犬細(xì)小病毒CPV-JL19株分離鑒定及遺傳進(jìn)化分析

由海波，胡 博，王全凱，劉 昊，朱翔宇，張海玲，白 雪，徐 超*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 特產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部經(jīng)濟(jì)動(dòng)物疫病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長春 130112；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林 長春 130118；3.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東 佛山 528000)

犬細(xì)小病毒(canine parvovirus,CPV)屬于細(xì)小病毒科、細(xì)小病毒屬，是家犬和多種野生食肉動(dòng)物的常見病原[1]。CPV基因組由約5 200個(gè)核苷酸DNA分子組成，其中包含2個(gè)開放閱讀框(ORF)。其中一個(gè)ORF通過選擇性剪接相同的mRNA編碼2個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(VP1和VP2)，另一個(gè)ORF編碼2個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1和NS2)。病毒衣殼為一個(gè)直徑約為25 nm的二十面體，由6個(gè)VP1和54個(gè)VP2組成[2]。構(gòu)成衣殼的主要蛋白是VP2，VP2中幾個(gè)關(guān)鍵堿基和氨基酸的變化能夠改變抗原特征和宿主范圍。因此，目前大量研究均集中在VP2基因的進(jìn)化，對(duì)非結(jié)構(gòu)蛋白基因的研究有限[3]。并且與VP2基因序列相比，GenBank中可用的全基因序列相對(duì)較少。

1900年前后貓細(xì)小病毒(FPV)最早被發(fā)現(xiàn)，隨后經(jīng)過多年環(huán)境變化與病毒進(jìn)化，1978年前后演化出可以感染犬的CPV。CPV和FPV之間的氨基酸變化影響VP2蛋白與宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TfR)的相互作用，可能有助于CPV與家犬TfR結(jié)合的能力，因此被認(rèn)為是犬類宿主轉(zhuǎn)移的決定因素[4-5]。在其出現(xiàn)不久后很快產(chǎn)生了兩種不同的抗原變體。其中CPV-2a于1979年出現(xiàn)，在VP2中共出現(xiàn)5個(gè)氨基酸取代(Met87Leu,Ile101Thr,Ala300Gly,Asp305Tyr,Asn375Asp);另一個(gè)是在1984年出現(xiàn)的CPV-2b，在VP2中增加了一個(gè)單獨(dú)的替代(Asn426Asp)[6]。隨后，新的變體出現(xiàn)在世界各地，包括New CPV-2a和New CPV-2b，每個(gè)都有多種氨基酸取代[7]。2000年，在意大利發(fā)現(xiàn)了另一種新的抗原變異，其特征是Asp426Glu取代，稱為CPV-2c[8]。相對(duì)于原始的CPV-2,CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c的抗原變異型在犬中具有更高的致病性，并且宿主范圍擴(kuò)大[9]。CPV原始型(CPV-2)迅速被其抗原變異體所取代，其進(jìn)化速度接近RNA病毒[10]，對(duì)疾病診斷和流行病學(xué)有很大的影響。

由于CPV的遺傳變異較快，目前的疫苗可能不能夠提供全面的保護(hù)。因此，進(jìn)一步探究當(dāng)前分離鑒定的CPV流行株的遺傳變異特性，為下一步制備有效的CPV疫苗提供適宜的疫苗株，這些對(duì)CPV的預(yù)防具有重要理論意義。本研究對(duì)吉林省長春市某動(dòng)物醫(yī)院分離到的1株CPV進(jìn)行鑒定，解析其遺傳變異規(guī)律及流行特性，為該地區(qū)CPV的預(yù)防、治療及疫苗研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床樣品及細(xì)胞株臨床樣品為吉林省長春市某動(dòng)物醫(yī)院臨床表現(xiàn)為細(xì)小病毒病的犬肛拭子，并在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所進(jìn)行分析。貓腎傳代細(xì)胞系(F81)由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部經(jīng)濟(jì)動(dòng)物疫病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑CPV單克隆抗體由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部經(jīng)濟(jì)動(dòng)物疫病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備保存；熒光二抗購自Abcam公司；ExTaq聚合酶、dNTP、pMD18-T載體均購自TaKaRa公司；DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒、DNA Marker均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 病毒DNA提取與PCR鑒定取肛拭子浸泡液作為樣品，參照基因組提取試劑盒說明書提取病毒DNA，采用CPV鑒定引物進(jìn)行PCR檢測。其引物序列P1：5′-GGATTTCTACGGGTACTTTC-3′;P2：5′-GGTGTGCCACTAGTTCCAGTAT-3′。P-CR擴(kuò)增體系20 μL：模板1 μL，Ex Taq 1 μL，10×Ex Taq Buffer 2 μL，上、下游引物各1 μL，dNTP 1 μL，加ddH2O至20 μL。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸90 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.4 病毒分離與培養(yǎng)無菌取肛拭子置1.5 mL EP管中于滅菌PBS(pH 7.2)內(nèi)浸泡48 h，反復(fù)凍融3次，4℃、10 000 r/min離心10 min，取上清，經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾后，采用同步接毒的方式，在含5%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)的F81細(xì)胞中接入全部處理后的病料上清，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照，于35℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日觀察記錄細(xì)胞是否出現(xiàn)拉絲、脫落等典型病變(CPE)，繼續(xù)盲傳3～5代，-80℃保存。

1.5 病毒形態(tài)學(xué)鑒定取分離毒株第5代細(xì)胞培養(yǎng)物10 mL于超濾管內(nèi)，8 000 r/min離心20 min，取10 μL濃縮病毒液用0.1%磷鎢酸溶液進(jìn)行電鏡負(fù)染觀察病毒的形態(tài)學(xué)特征。

1.6 血凝試驗(yàn)在96孔V型血凝板上，每孔加pH 7.2的PBS 25 μL；第1排孔加入25 μL病毒液，依次進(jìn)行倍比稀釋至11排孔并棄去25 μL，第12排孔為紅細(xì)胞對(duì)照；向各孔補(bǔ)加PBS 25 μL，每孔加入1%豬紅細(xì)胞懸液50 μL；將反應(yīng)板輕輕振蕩搖勻1 min，置4℃ 60 min，以100%凝集(完全無淚珠樣流淌)的最高稀釋倍數(shù)為血凝效價(jià)。

1.7 間接免疫熒光試驗(yàn)將F81細(xì)胞懸液鋪在6孔板中，同步接毒分離株病毒，36 h后棄上清液，用PBS洗3次；加入4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次；加入0.5% Tristone，室溫10 min，PBS洗3次；加入5% BSA，37℃封閉1 h；加入1∶100稀釋的CPV單抗，37℃孵育1 h，PBS 洗3次；加入1∶100稀釋的FITC羊抗鼠IgG二抗，37℃避光孵育1 h，PBS清洗后加入終濃度0.1% DAPI，37℃避光感作5 min，在熒光顯微鏡下觀察。同時(shí)設(shè)未接種病毒的細(xì)胞做為陰性對(duì)照。

1.8 序列擴(kuò)增及遺傳進(jìn)化分析

1.8.1序列擴(kuò)增 參考GenBank中CPV全基因組序列設(shè)計(jì)引物，分6個(gè)片段擴(kuò)增CPV全基因組，引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系40 μL：模板 2 μL，Ex Taq Buffer 4 μL，dNTPs 2 μL，上、下游引物各2 μL，Ex Taq 聚合酶2 μL，加ddH2O至40 μL。PCR 反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94C°變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。

表1 引物信息

1.8.2測序及序列分析 PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收后克隆入pMD18-T載體中，轉(zhuǎn)化至Trans5α感受態(tài)細(xì)胞后涂布于LB(Amp)固體培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng)，挑取平板上單克隆菌落于液體LB培養(yǎng)基中，經(jīng)菌液PCR鑒定后，送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。將所有片段利用DNAStar軟件進(jìn)行序列拼接并上傳至GenBank。于NCBI網(wǎng)站在線Blast，將序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比較，并通過DNAStar程序包的MegAlign程序?qū)Ψ蛛x株序列與GenBank 發(fā)表的典型參考株進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)分析。利用Mega 5.0軟件，通過鄰接法構(gòu)建完整編碼區(qū)的系統(tǒng)發(fā)育樹，分析分離株與其他毒株及疫苗株的進(jìn)化關(guān)系。

1.9 動(dòng)物回歸試驗(yàn)選取4只3月齡健康比格犬，CPV抗體陰性，試驗(yàn)組2只分別灌服第5代細(xì)胞培養(yǎng)液(TCID50為103/mL)30 mL，同時(shí)對(duì)照組2只灌服30 mL F81細(xì)胞培養(yǎng)液，隔離飼養(yǎng)，每日檢測動(dòng)物體溫、體質(zhì)量同時(shí)觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的臨床癥狀，每隔1 d采血進(jìn)行血常規(guī)檢測。

2 結(jié)果

2.1 PCR鑒定結(jié)果對(duì)分離毒株的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示在573 bp左右出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期目的條帶大小一致(圖1)。

M.DL2000 DNA Marker;1.樣品;2.陰性對(duì)照;3.陽性對(duì)照

2.2 病毒分離采用F81細(xì)胞同步接毒的方法，從采集的肛拭子中分離到1株CPV，命名為CPV-JL19，與對(duì)照組F81細(xì)胞相比較(圖2A)，接種CPV后的F81細(xì)胞出現(xiàn)拉網(wǎng)、變形及脫落等典型CPE(圖2B)，而對(duì)照組細(xì)胞生長良好。

2.3 病毒形態(tài)學(xué)鑒定分離毒株第5代細(xì)胞培養(yǎng)物用0.1%磷鎢酸溶液進(jìn)行電鏡負(fù)染觀察，可見圓形二十面體結(jié)構(gòu)、直徑約20 nm、無囊膜的典型病毒樣粒子，與CPV的形態(tài)相符(圖3)。

A.接毒后的F81細(xì)胞；B.正常F81細(xì)胞

圖3 CPV-JL19 電鏡觀察病毒粒子形態(tài)

2.4 血凝試驗(yàn)血凝試驗(yàn)結(jié)果測得分離株第5代細(xì)胞培養(yǎng)物血凝特性穩(wěn)定，其血凝效價(jià)為1∶29～1∶210(圖4)。

CPV和PBS，每個(gè)樣品2個(gè)重復(fù)

2.5 間接免疫熒光試驗(yàn)接毒后36 h，F(xiàn)81細(xì)胞在熒光顯微鏡下可觀察到明顯的綠色熒光，對(duì)照組未接毒細(xì)胞在熒光顯微鏡下未觀察到熒光(圖5)。

A.CPV感染F81細(xì)胞；B.正常細(xì)胞

2.6 全基因組序列擴(kuò)增及遺傳進(jìn)化分析用分離株CPV-JL19的細(xì)胞培養(yǎng)物提取DNA，PCR擴(kuò)增全基因組序列經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，獲得與預(yù)期片段大小一致的目的基因(圖6)。對(duì)獲得的目的片段進(jìn)行測序，將測序結(jié)果進(jìn)行序列拼接，最終得到一段總長4 727 bp的序列，上傳至GenBank(登錄號(hào)：MN519258)。

使用DNAStar軟件SeqMan工具將測序結(jié)果與GenBank中已收錄的CPV全基因組序列進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果顯示，CPV-JL19株堿基序列與蒙古(5 MGL)、中國四川(SC/23/2017)和上海(CPV-SH1516)等地的分離株核苷酸同源性均較高，為99.9%，與CPV-2的同源性相對(duì)較低，為98.3%，與意大利(CPV_IZSSI)、巴西(CPV/Brazil)、中國北京(CPV-BJL3)和四川(CPV/SC)毒株的同源性分別為98.9%，98.4%，99.2%和99.8%(圖7)，可以看出CPV-JL19株主要與國外分離株同源性較低，與國內(nèi)四川、上海、北京等地的分離株同源性相對(duì)國外分離株較高。采用Mega 5.0軟件將此分離株序列與GenBank中部分CPV序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，分離株CPV-JL19主要位于國內(nèi)分離株的分支群，與蒙古分離株處于一個(gè)小分支群，與中國四川、上海分離株親緣關(guān)系較近，與北京分離株相對(duì)較遠(yuǎn)(圖8)。

M.DL2000 DNA Marker;1.P1;2.P2;3.P3;4.P4;5.P5;6.P6;7.陰性對(duì)照

圖7 CPV-JL19分離株基因組同源性分析

圖8 CPV-JL19全基因組系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.7 VP2全基因氨基酸序列分析采用Mega 5.0軟件對(duì)分離株CPV-JL19 VP2基因的氨基酸序列與GenBank登錄的CPV VP2氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，確定CPV-JL19為CPV-2c型。與北京CPV-2c型參考毒株(CPV-BJL3)相比第370位氨基酸由Gln→Arg，第440位氨基酸由Ala→Thr；與深圳分離株(Shenzhen-H1)相比，第48位氨基酸由His→Gln，第119位氨基酸由Asn→Val，第370位氨基酸由Gln→Arg；與國外分離株EC-08-2017(厄瓜多爾)相比，第139位氨基酸由Ile→Val，第267位氨基酸由Phe→Tyr，第324位氨基酸由Tyr→Ile，第370位氨基酸由Gln→Arg；與蒙古(5 MGL)、新加坡(M31-6)、中國四川(SC/18/2017)、中國上海(3-2-1-2016)等國內(nèi)其他地區(qū)分離毒株無氨基酸位點(diǎn)變化(表2)。

表2 VP2蛋白氨基酸序列的變異情況

2.8 動(dòng)物回歸試驗(yàn)用CPV-JL19分離株的第5代細(xì)胞培養(yǎng)物接種幼犬，6 d后開始發(fā)病，出現(xiàn)厭食、嘔吐、排稀便、體溫升高、體質(zhì)量下降、白細(xì)胞數(shù)下降等典型臨床癥狀，隨后便血、脫水、絕食，最后攻毒組的2只犬全部死亡。病理剖檢發(fā)現(xiàn)尸體嚴(yán)重脫水，胃中無內(nèi)容物，胃底黏膜出血，空腸和回腸局部充血、黏膜脫落，腸腔內(nèi)有血樣糞便，腸系膜淋巴結(jié)腫脹等病理變化。而空白對(duì)照組無上述癥狀和病理變化。取血液樣品DNA進(jìn)行PCR檢測，攻毒組核酸均為CPV陽性。

3 討論

本試驗(yàn)成功分離得到1株CPV，通過PCR鑒定、電鏡觀察、間接免疫熒光、動(dòng)物回歸試驗(yàn)等鑒定方法及序列分析確定分離毒株為1株CPV-2c型強(qiáng)毒株，命名為CPV-JL19株，基因組全長4 727 bp，GenBank登錄號(hào):MN519258。序列對(duì)比顯示，CPV-JL19株堿基序列與蒙古(5 MGL)、中國四川(SC/23/2017)和上海(CPV-SH1516)等地的分離株核苷酸同源性均較高，為99.9%。系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，CPV-JL19株與蒙古分離株(5 MGL)處于一個(gè)小的進(jìn)化分支。與蒙古國(5 MGL)、中國黑龍江(HEB-A6)等近期分離株無氨基酸位點(diǎn)變化。

目前，CPV-2c廣泛分布于歐洲(意大利、保加利亞、英國、德國、希臘、葡萄牙、瑞典和西班牙)、非洲(突尼斯)、亞洲(印度、越南)、大洋洲(澳大利亞)和美洲(美國、阿根廷和烏拉圭)[11-13]。2010年測序首次證實(shí)我國存在CPV-2c病毒[14]，但2012年，亞洲才檢測到CPV-2c病毒[15]，直到2014年我國分離并鑒定出CPV-2c病毒[9]。此后，南亞也檢測到CPV-2c病毒[16-18]。自2018年以來，在蒙古犬中CPV-2c亞型取代2b在抗原型中占據(jù)主導(dǎo)地位。并且在蒙古國的CPV-2c陽性樣本中檢測到3種不同的位點(diǎn)突變。而在相似的時(shí)間跨度內(nèi)，從蒙古國和我國分離到的毒株序列也有驚人的相似性[19]。

我國目前CPV-2c主要在南方流行，在北方相對(duì)較少，在東北地區(qū)New CPV-2a占主導(dǎo)地位[9]。由于在未接種疫苗和接種疫苗的犬中均存在CPV的感染，這促使我們對(duì)目前我國流行的病毒變種進(jìn)行描述和分離。CPV在我國的繼續(xù)發(fā)展，表明疫苗株可能需要調(diào)整以獲得最佳的抗感染保護(hù)，適當(dāng)改變目前疫苗接種策略是十分必要的，因?yàn)樘镩g株和疫苗株之間的毒株差異可能導(dǎo)致免疫失敗[20]。目前在世界范圍內(nèi)現(xiàn)有的商業(yè)疫苗是基于CPV-2和CPV-2b的，雖然有幾項(xiàng)研究表明它們能夠交叉保護(hù)所有抗原類型[21-23]。但在接種CPV疫苗的犬只中，仍然存在出現(xiàn)臨床癥狀的犬[19]。我國目前可用的商業(yè)疫苗是基于CPV-2型的[9]，而使用CPV-2型弱毒活疫苗的犬可能無法抵抗我國目前流行的CPV-2c病毒的感染。這也許可以解釋從未接種疫苗和接種疫苗的犬均能分離出CPV-2c病毒的原因。因此，在進(jìn)一步檢測CPV-2疫苗對(duì)CPV-2c的有效性顯得非常重要。本研究為我國調(diào)整CPV疫苗株提供了依據(jù)。