抑制侵襲性真菌的新型分子及其作用靶點研究進(jìn)展

郭 希，賴莘秀，楊媚滟，李嶠楨，王思行，宋章永,2*

(西南醫(yī)科大學(xué) 1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 病原微生物教研室； 2.公共實驗技術(shù)中心分子生物學(xué)技術(shù)平臺，四川 瀘州 646000)

廣譜抗生素使用、免疫抑制劑濫用、艾滋病感染及血液系統(tǒng)惡性腫瘤等因素,造成以白色念珠菌(Candidaalbicans)、新生隱球菌(Cryptococcusneoformans)和煙曲霉(Aspergillusfumigatus)為代表的侵襲性真菌感染率和致死率日益增長，嚴(yán)重威脅著人類健康。但現(xiàn)有抗真菌藥物種類少、毒副作用強(qiáng)以及臨床耐藥甚至超級耐藥菌株的涌現(xiàn)，均使得現(xiàn)有的抗真菌藥物治療受到挑戰(zhàn)。

真菌細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞具有相似的真核生物特征，故藥物新靶點探究核心是提高侵襲性真菌藥物靶點的特異性，減少毒副作用[1-2]。在現(xiàn)代生命科學(xué)技術(shù)發(fā)展和對侵襲性真菌致病機(jī)制逐步深入的研究背景下，本文擬探討小分子物質(zhì)和次生代謝產(chǎn)物等對真菌生物膜、細(xì)胞壁、線粒體及生化代謝等相關(guān)靶點作用機(jī)制，總結(jié)出靶向治療侵襲性真菌的潛在功能藥物。

1 臨床現(xiàn)有藥物靶點

目前臨床常用藥物靶點主要有3類：1)合成的廣譜抗真菌唑類藥物抑制14α-羊毛脂醇脫甲基酶阻止麥角甾醇的合成；2)棘白菌素類藥物非競爭性抑制β-1,3-葡聚糖合成酶，干擾細(xì)胞壁β-1,3-葡萄糖的合成；3)細(xì)菌次生代謝產(chǎn)物多烯類藥物(如兩性霉素B)與麥角固醇結(jié)合，改變細(xì)胞膜通透性，引起細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外滲。但部分臨床真菌的天然耐藥性、藥物靶點基因突變造成的唑類耐藥菌株、棘白菌素類受限的給藥方式、多烯類毒副作用大等因素使得這3類藥物的臨床應(yīng)用受到挑戰(zhàn)。

2 生物膜及菌絲形成靶點

2.1 靶向生物膜及菌絲形成的物質(zhì)

生物膜是指真菌黏附于惰性或活性實體的接觸表面，分泌多糖基質(zhì)、纖維蛋白、脂質(zhì)蛋白等物質(zhì)，將其自身包繞其中而形成的大量真菌聚集膜樣物。生物膜的形成是侵襲性真菌反復(fù)感染、慢性持續(xù)感染、產(chǎn)生耐藥性的重要原因，其主要組成為菌絲。針對生物膜和菌絲形成的靶點藥物開發(fā)是新藥研發(fā)的重要方向。

2.1.1 影響信號通路調(diào)控生物膜形成的物質(zhì)：某些物質(zhì)通過調(diào)控信號通路影響侵襲性真菌生物膜和菌絲的形成進(jìn)而發(fā)揮抗真菌作用。例如大黃素是蛋白激酶CK2的天然抑制劑，通過抑制白色念珠菌菌絲發(fā)育及生物膜形成發(fā)揮作用，但對成熟的生物膜作用較弱[3]。粉防己堿以劑量依賴方式對白色念珠菌的酵母-菌絲形態(tài)轉(zhuǎn)變和生物膜形成起抑制作用，這與調(diào)控Ras1p-cAMP-PKA通路基因表達(dá)下調(diào)有關(guān)[4]。

2.1.2 影響菌絲形成基因表達(dá)的物質(zhì)：基于具有良好的空間分散性、成藥性能以及藥物代謝動力學(xué)性質(zhì)的小分子物質(zhì)更易衍生出性質(zhì)優(yōu)良的抗真菌藥物，部分小分子物質(zhì)可針對菌絲形成基因發(fā)揮抗真菌作用。BH3I-1及其衍生物作用于白色念珠菌菌絲增殖特異基因RFG1、NRG1和UME6，抑制白色念珠菌菌絲的增殖與形態(tài)發(fā)生[5]；具有抗菌和抗癌作用的糖脂生物表面活性劑-槐糖脂可下調(diào)念珠菌菌絲特異基因HWP1、ALS1、ALS3、ECE1和SAP4的表達(dá)，并阻止真菌黏附從而抑制生物膜形成[6]。

2.1.3 影響真菌附著與致病的物質(zhì)：“Filastatin”是一種對白色念珠菌附著至非活性表面(如聚苯乙烯塑料)和致病過程有顯著抑制作用的化合物，對人體細(xì)胞系無毒，但其抑菌機(jī)制尚未明確。因此，“Filastatin”可作為潛在的保護(hù)性材料應(yīng)用于醫(yī)療器械表面預(yù)防真菌感染[7]。與“Filastatin”有類似功能的防腐劑葡萄糖酸氯己定，對生物膜的抑制作用體現(xiàn)在改變細(xì)胞滲透性引起微生物溶解和抑制接觸面的黏附[8]。

2.2 細(xì)菌代謝產(chǎn)物靶向生物膜及菌絲形成抑制物

細(xì)菌與真菌往往有著共同的寄生環(huán)境，兩者相互影響。益生菌對白色念珠菌的抑制作用是依靠其代謝物的消旋來影響白色念珠菌在宿主表面定植和菌絲形成。如乳酸桿菌的培養(yǎng)上清液中發(fā)現(xiàn)的一些蛋白質(zhì)分子、過氧化氫及低分子化合物(抑菌素、羧酸、脂肪酸)等代謝物，可抑制白色念珠菌酵母-菌絲的轉(zhuǎn)變以及黏附[9]。卷曲乳酸桿菌的上清液中也發(fā)現(xiàn)可顯著下調(diào)菌絲特異基因ALS3、HWP1、ECE1表達(dá)和上調(diào)負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因NRG1的功能物質(zhì)[10]。

除益生菌外，包括芽孢桿菌在內(nèi)的土壤細(xì)菌，除有效阻斷新生隱球菌的關(guān)鍵毒力因子——黑色素和莢膜合成外，也對真菌生物膜形成及菌絲增殖有顯著的抑制作用[11]。另外，糞腸球菌素ENTV主要依賴于真菌的生物信號即Fsr群體感應(yīng)系統(tǒng)發(fā)揮抑制作用[12]。

3 細(xì)胞壁合成相關(guān)靶點

包括β-1,3-葡聚糖和β-1,6-葡聚糖在內(nèi)的多糖是真菌細(xì)胞壁的重要組成成分。以抗真菌細(xì)胞壁的功能物質(zhì)作用機(jī)制探究真菌細(xì)胞壁作用新靶點，旨在找到特異性高和副作用小的抗真菌藥物(表1)。

表1 具有新靶點的抗真菌化合物Table 1 The Antifungal compounds with novel target

3.1 影響細(xì)胞壁損傷的次生代謝產(chǎn)物

植物的天然勞森能在較低濃度水平上抑制尖孢霉增殖，作用機(jī)制除直接損傷真菌細(xì)胞壁外，還能改變膜通透性、激活氧化應(yīng)激系統(tǒng)、誘導(dǎo)自噬相關(guān)基因(ATG1和ATG8)的上調(diào)表達(dá)等發(fā)生累積效應(yīng)進(jìn)而發(fā)揮抗真菌作用[13]。皂苷同樣也能直接損傷細(xì)胞壁從而抑制白色念珠菌增殖，主要機(jī)制是使細(xì)胞壁產(chǎn)生不穩(wěn)定性和減少酵母黏附[14]。

參與真菌繁殖、侵襲和免疫逃逸的分泌型天冬氨酸蛋白酶(secretory aspartic proteinase，SAP)是真菌重要毒力因子，可作為潛在的藥物作用靶點。體外研究證實對從放線菌培養(yǎng)物中分離出來的胃抑霉素A進(jìn)行P2和P3位點結(jié)構(gòu)改造，所得產(chǎn)物對白色念珠菌SAP1、SAP3、SAP5和SAP6表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制力[15]。

3.2 影響細(xì)胞壁形成的相關(guān)基因突變

KTR基因缺失影響其編碼的1,2-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶活性，導(dǎo)致細(xì)胞壁半乳甘露聚糖的缺失。另外SSDA基因突變影響幾丁質(zhì)合成酶的亞細(xì)胞定位繼而影響細(xì)胞壁合成，這兩種基因突變都能達(dá)到抑制真菌增殖的目的[16]。

3.3 影響細(xì)胞壁形成的相關(guān)信號通路

鈣調(diào)磷酸酶調(diào)節(jié)的信號通路調(diào)節(jié)β-葡聚糖和幾丁質(zhì)的生物合成，在真菌細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)時影響細(xì)胞壁完整性。單獨使用鈣調(diào)磷酸酶抑制劑(環(huán)孢素A或他克莫司)對煙曲霉的增殖具有抑制作用[17]。因此阻斷鈣調(diào)磷酸酶信號通路被認(rèn)為是一種新的抗深部真菌病策略。

4 抑制線粒體相關(guān)靶點

喹諾酮類化合物可引起線粒體膜電位的下降，誘導(dǎo)DNA損傷并使細(xì)胞周期停留在G2/M期，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。除此之外，喹諾酮類化合物還可通過影響氧化還原循環(huán)、蛋白質(zhì)巰基的芳基化、誘導(dǎo)DNA鏈斷裂及生物還原烷基化等機(jī)制導(dǎo)致真菌細(xì)胞產(chǎn)生毒性[18]。鹵代水楊酰胺[N1-(3，5-二氯苯基)-5-氯-2-羥基苯甲酰胺]可通過破壞真菌線粒體蛋白轉(zhuǎn)位發(fā)揮作用，而其類似物氯硝柳胺會導(dǎo)致真菌線粒體對細(xì)胞核出現(xiàn)逆行反應(yīng)，因此其可用作抑制白色念珠菌侵襲腸上皮細(xì)胞的新型真菌抑制劑[19]。

小檗堿可與氟康唑聯(lián)用產(chǎn)生協(xié)同抗耐藥真菌作用，對耐藥性白色念珠菌的協(xié)同抗菌效果尤其顯著。其作用機(jī)制是通過增強(qiáng)三羧酸循環(huán)和抑制線粒體ATP合酶活性這兩條途徑使得內(nèi)源性活性氧生成，導(dǎo)致耐藥菌株的氧化損傷[20]。真菌產(chǎn)生的膠質(zhì)毒素也能夠抑制其他真菌病原體在人體內(nèi)累積，相關(guān)機(jī)制與小檗堿產(chǎn)生的氧化損傷類似，在相應(yīng)菌體中產(chǎn)生過氧化氫和超氧化物，導(dǎo)致真菌細(xì)胞內(nèi)的單鏈和雙鏈脫氧核糖核酸斷裂[21]。

5 其他作用靶點

5.1 海藻糖代謝相關(guān)靶點

在高溫、高寒、高滲透壓及干燥失水等惡劣環(huán)境

條件下，海藻糖匯集于真菌細(xì)胞表面形成獨特的保護(hù)膜，有效地保護(hù)蛋白質(zhì)分子不變性，從而維持真菌的生命過程和生物學(xué)特征。白色念珠菌中海藻糖-6-磷酸合酶基因1(TPS1)的破壞會導(dǎo)致菌絲形成受損和感染性降低；而TPS2基因的破壞導(dǎo)致海藻糖-6-磷酸(T-6-P)的累積，高濃度的T-6-P具有細(xì)胞毒性，因此，海藻糖合成TPS1和TPS2基因可作為潛在的藥物治療靶點[22]。

5.2 氨基酸與蛋白質(zhì)代謝相關(guān)靶點

感染期間，真菌會呈現(xiàn)特有的氨基酸代謝過程，例如：缺乏CPCA(氨基酸饑餓時的轉(zhuǎn)錄激活劑)和AREA(當(dāng)優(yōu)選的氮源不可用時被激活的氮代謝阻遏劑)時會損害煙曲霉的毒力，使得氨基酸的代謝受阻，從而影響煙曲霉的毒力[23]，因此特有的氨基酸代謝關(guān)鍵基因可作為潛在的藥物靶點。

而真菌中的Bd1基因突變導(dǎo)致BET蛋白(bromodomain and extira-terminal)兩個相關(guān)結(jié)構(gòu)域的滅活，使得其在體外生存能力喪失和對小鼠致病毒力降低。二苯并噻二酮化合物就利用此特點發(fā)揮抑菌作用。這些發(fā)現(xiàn)使得高度選擇性的BET蛋白抑制劑有望成為抗真菌治療新策略，并確定Bd1基因可作為新作用靶點[24]。

5.3 針對金屬離子穩(wěn)態(tài)的相關(guān)靶點

真菌細(xì)胞內(nèi)鋅離子的螯合可導(dǎo)致其凋亡，如變形蟲可能通過降低病原體鋅的利用率來減少真菌細(xì)胞的增殖[25]。紫草素通過破壞白色念珠菌細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子的流失進(jìn)而引起菌體死亡[26]。二溴喹啉化合物也通過擾亂體內(nèi)金屬離子穩(wěn)態(tài)而發(fā)揮抗真菌作用[27]，因此有針對的調(diào)控菌體內(nèi)金屬離子失衡也可作為潛在的藥物治療靶點。

6 問題與展望

近年來，侵襲性真菌感染的高發(fā)病率和致死率已是當(dāng)前面臨的一大挑戰(zhàn)，探索潛在真菌特異性藥物新靶點和開發(fā)新型抗真菌藥物成為迫切需要。本文以藥物作用新靶點為核心，在小分子抑制物和次生代謝產(chǎn)物等方面探究新型藥物研發(fā)機(jī)制，以期尋求特異的治療藥物，但目前主要集中在酵母菌方面的研究，絲狀真菌方面的研究相對滯后，且這些研究成果距離臨床應(yīng)用還有一段距離。

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，相關(guān)的后續(xù)研究可基于以下幾個方面開展：1)深入研究新型抗真菌物質(zhì)的作用機(jī)制，尋找相應(yīng)的功能物質(zhì)，為研發(fā)新型藥物提供更加充分的理論依據(jù)；2)優(yōu)化潛在安全、高效的新型藥物的藥效動力學(xué)及藥代動力學(xué)，以滿足未來抗真菌治療的需求。3)將計算機(jī)輔助技術(shù)、基因組學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)等充分應(yīng)用于新型藥物的研發(fā)，這將有助于推動新一代高效、低副作用的抗真菌藥物的研發(fā)和臨床用藥。