堿蓬草總生物堿提取工藝優(yōu)化及其對高脂飲食小鼠的體內(nèi)抗氧化活性

李小陽，韓冠英 ，閆 松，趙艷丹，郭 斌，崔 鏨

（1.錦州醫(yī)科大學，遼寧錦州 121000；2.錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，遼寧錦州 121000）

堿蓬（Suaeda salsa）是藜科植物，為一年生葉肉質(zhì)化真鹽生草本植物[1-2]，營養(yǎng)豐富，是優(yōu)質(zhì)蔬菜和油料作物。堿蓬的嫩莖葉既可鮮食，又可干制，宋人曾鞏在《隆平集西夏傳》中有古人食用堿蓬的記載，因此堿蓬具有食用開發(fā)前景。堿蓬中含有豐富的生物堿、黃酮、蛋白質(zhì)、酚醌、多糖類等化合物[3-5]，此外堿蓬草總生物堿具有藥用價值，可以降糖、降壓、防治心臟病、增強人體免疫力等[6]。堿蓬籽生產(chǎn)出的“共軛亞油酸”，具有抗癌[7]、降膽固醇、抗動脈粥樣硬化等[8]功效。

生物堿是主要存在于植物中的一類含氮的堿性有機化合物，具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌等[9-11]藥理活性。有研究發(fā)現(xiàn)生物堿還具有殺蟲活性及抗氧化作用[12-14]。目前尚未見對堿蓬草中生物堿提取工藝及體外抗氧化活性進行研究的相關報道。

普遍采用超聲波輔助法、醇溶劑提取法、水或酸水等提取方法來提取植物中的生物堿[15-16]。雖然水或酸水法提取生物堿簡單經(jīng)濟，但提取液濃縮困難，而且耗時較長；醇類極性較大，穿透力強、溶出率高、沸點較低、容易回收[17]。超聲波輔助法可縮短提取時間，提高提取效率，應用廣泛，不受分子質(zhì)量大小、成分極性的限制，適用于絕大多數(shù)有效成分的提取[18]。本實驗采用乙醇作為溶劑，聯(lián)合超聲波輔助法，既可以達到理想的提取效果，又可以保證被提取物作為藥用與食用的安全性。

本實驗采用乙醇作為提取劑，在單因素實驗的基礎上，采用正交設計法研究堿蓬草中總生物堿的最佳提取工藝，并對其抗氧化活性進行了研究，以期為堿蓬草日后在食品及醫(yī)藥行業(yè)的研究應用提供了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

堿蓬草 采自遼寧省錦州市沿海灘涂濕地，經(jīng)錦州醫(yī)科大學藥學院郭斌教授鑒定為堿蓬屬堿蓬草（Suaeda salsa）；無水乙醇、三氯化鐵、雙氧水（H2O2）、硫酸亞鐵（FeSO4）、二氯甲烷 天津永晟精細化工有限公司；氫氧化鈉 天津市永大化學試劑有限公司；碘化鉍鉀 天津市光復精細化工研究所；硅鎢酸 天津市科密歐化學試劑有限公司；膽固醇 安徽天啟化工科技有限公司；豬油 自備；蛋黃粉 天津市永大化學制劑有限公司；膽酸鈉 上海如吉生物有限公司；基礎飼料 實驗室自制；丙二醛MDA試劑盒、過氧化氫酶CAT試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶GSH-PX試劑盒 南京建成生物工程研究所；其他試劑 均為國產(chǎn)分析純；SPF鼠 錦州醫(yī)科大學（許可證號：SCXK（遼）2017-0003）。

SHZ-D（111）恒溫水浴鍋 上海騰方公司；BP 211D型電子分析天平 德國Sartorius公司；RE-3000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海廣英公司；UP3200HE數(shù)控超聲波清洗器 南京壘君達超聲電子設備有限公司；PHSJ-4A實驗室pH計 上海精密科學儀器有限公司；UV-2550型紫外分光光度計 日本島津；UP3200HE數(shù)控超聲儀 南京壘君達超聲電子設備有限公司；80-1離心機 常州天隧儀器有限公司；SCD-118TMPA冰箱 海爾股份公司；DH-360（303-1）恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學儀器有限公司；680型全自動酶標儀 美國Bio-Rad公司；WH-3微型渦輪混合儀 上海精科實業(yè)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 堿蓬草總生物堿的提取工藝 將新采得的堿蓬草放置陰暗處曬干，粉碎機打粉后60目過篩備用。分別稱取堿蓬草粉5 g，按照一定料液比加入一定濃度的乙醇溶劑，在一定的溫度、一定時間下進行超聲處理。超聲后抽真空過濾，濾液旋干后加入25 mL 1% HCl超聲1 min后加入2 mol/L NaOH約3 mL將pH調(diào)至10～11，過濾后濾液加入35 mL二氯甲烷萃取3次，合并萃取液于40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干，用2 mL乙醇將堿蓬草總生物堿溶解，乙醇自然蒸發(fā)后得橘黃色至黃褐色固體，即為堿蓬草總生物堿。

1.2.2 鑒別反應

1.2.2.1 碘化鉍鉀反應 取碘化鉍鉀2 g，加冰醋酸20 mL后加50 mL蒸餾水稀釋。取1 mL堿蓬草總生物堿溶液于試管中，加1～2滴碘化鉍鉀試劑，觀察是否產(chǎn)生沉淀及沉淀顏色[19]。

1.2.2.2 碘-碘化鉀反應 取碘0.5 g與碘化鉀1.5 g，加蒸餾水25 mL蒸餾水稀釋。取1 mL母液于試管中，加2～3滴碘化鉀試劑。觀察是否產(chǎn)生沉淀及沉淀顏色[19]。

1.2.2.3 硅鎢酸反應 取硅鎢酸10 g加蒸餾水稀釋至100 mL，取1 mL母液于試管中，加1～2滴硅鎢酸試劑。觀察是否產(chǎn)生沉淀及沉淀顏色[19]。

1.2.2.4 碘化汞鉀反應 取碘化鉀10 g，加水10 mL溶解后，緩緩加入二氯化汞的飽和水溶液，隨加隨攪拌，至生成的紅色沉淀不再溶解加蒸餾水稀釋至200 mL。取1 mL母液于試管中，加2～3滴碘化汞鉀試劑。觀察是否產(chǎn)生沉淀及沉淀顏色[19]。

1.2.3 堿蓬草總生物堿提取量的測定 參考文獻[20-22]的方法，采用無水乙醇為溶劑，精密配制14.28、12.50、11.11、10.00、9.09 μg/mL鹽酸小檗堿標準品溶液。將得到的橘黃色至黃褐色固體定容至一定體積測出其吸光度值，利用紫外分光光度計在272 nm波長下測定溶液吸光度A值，根據(jù)吸光度值算出生物堿濃度。以鹽酸小檗堿的質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度A值為縱坐標，繪制標準曲線，標準曲線方程為：y=0.05603x+0.00205，R2=0.99951。按照繪制鹽酸小檗堿標準曲線的方法，測定堿蓬草總生物堿的吸光度A值，根據(jù)式1得出堿蓬草總生物堿的提取量。

式中：C為根據(jù)鹽酸小檗堿標準曲線計算出堿蓬草總生物堿的質(zhì)量濃度（μg/mL）；V為堿蓬草總生物堿定容后的體積（mL）；M為實驗用堿蓬草粉的質(zhì)量（g）。

1.2.4 堿蓬草總生物堿單因素實驗 以堿蓬草總生物堿提取量為指標，分別考察超聲時間、超聲溫度、乙醇濃度、料液比4個因素對堿蓬草總生物堿提取量的影響。在每個因素中，設定5個水平進行單因素試驗，每組實驗重復三次，取平均值。

1.2.4.1 不同超聲時間對堿蓬草總生物堿提取量的影響 固定料液比為1:10（g/mL），超聲溫度為40 ℃，乙醇濃度為75%，采用1.2.1的方法提取堿蓬草總生物堿，評價不同的超聲時間（10、15、20、25、30 min）對堿蓬草總生物堿提取量的影響。

1.2.4.2 不同超聲溫度對堿蓬草總生物堿提取量的影響 固定超聲時間為25 min，乙醇濃度為75%，料液比為1:10（g/mL），采用1.2.1的方法提取堿蓬草總生物堿，評價不同的超聲溫度（25、30、35、40、45 ℃）對堿蓬草總生物堿提取量的影響。

1.2.4.3 不同乙醇濃度對堿蓬草總生物堿提取量的影響 固定料液比為1:10（g/mL），超聲時間25 min，超聲溫度為40 ℃，采用1.2.1的方法提取堿蓬草總生物堿，評價不同的濃度的溶劑（55%、65%、75%、85%、95%）對堿蓬草總生物堿提取量的影響。

1.2.4.4 不同料液比對堿蓬草總生物堿提取量的影響固定超聲時間為25 min，超聲溫度為40 ℃，乙醇濃度為75%，采用1.2.1的方法提取堿蓬草總生物堿，評價不同的料液比（1:8、1:10、1:12、1:14、1:16 g/mL）對堿蓬草總生物堿提取量的影響。

1.2.5 堿蓬草總生物堿的正交試驗 根據(jù)單因素實驗結(jié)果采用超聲時間、超聲溫度、乙醇濃度、料液比為考察因素，每個因素選定三個水平，設計L9（34）正交試驗以確定堿蓬草總生物堿的最優(yōu)提取工藝。因素水平見表1。

表1 正交試驗因素與水平設計Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.6 堿蓬草總生物堿抗氧化活性的測定

1.2.6.1 實驗分組和處理 將100只4周齡昆明SPF鼠（雌雄各半，體重20±2 g），隨機分為5組（堿蓬草總生物堿低、中、高劑量組，高脂對照組，正常對照組）每組20只，5只一籠。正常組給予小鼠基礎飼料，高脂組對照組給予高脂飼料，堿蓬草總生物堿低、中、高劑量組給予高脂飼料。將實驗室制得的堿蓬草總生物堿與蒸餾水根據(jù)小鼠體重（取20 g）配制成2、4、8 mg/kg，并對小鼠進行灌胃，試驗期間小鼠行自由飲水和攝食，每天上午9點進行灌胃，連續(xù)4、8、12、16周?？刂骑曫B(yǎng)室的溫濕度控制在22～25 ℃；40%～60%。

按照高脂飼料配方[23]的比例實驗室自制高脂飲食。膽固醇含量為1%；豬油含量為10%；蛋黃粉含量為10%；膽酸鈉含量為0.1%；基礎飼料含量為78.9%。

將實驗小鼠禁食不禁水12 h，用20%烏拉坦溶液0.1 mL/20 g將小鼠腹部內(nèi)注射進行麻醉，腹主動脈取血置于含有肝素鈉的真空取血管中。靜置30 min，3500 r/min后離心15 min，分離血清之后置于-80 ℃處保存。腹部取血完成后，摘取小鼠肝臟立即放入4 ℃生理鹽水中進行清洗，用濾紙吸干表面的水分。稱取備用的肝臟0.2 g，加入4 ℃的生理鹽水1.8 mL制成10%的肝勻漿，置于離心機中3500 r/min后離心15 min。取上清液（肝勻漿上清液），保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6.2 MDA含量的測定 取10%的肝勻漿適量，按照試劑盒要求進行操作，3500 r/min，離心15 min，取上清液，按照丙二醛（MDA）試劑盒說明書行測定。

1.2.6.3 CAT含量的測定 取10%的肝勻漿適量，3500 r/min，離心15 min，取上清液，按照過氧化氫酶（CAT）試劑盒明書進行測定。

1.2.6.4 GSH-Px含量的測定 取10%的肝勻漿適量，3500 r/min，離心15 min，取上清液1 mL進行顯色反應，按照谷胱甘肽過氧化物酶（GSH）試劑盒要求進行操作。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 生物堿鑒別反應結(jié)果

通過表2可以看出，在碘-碘化鉀反應實驗中產(chǎn)生褐色沉淀；碘化鉍鉀反應實驗中產(chǎn)生紅棕色沉淀；硅鎢酸反應實驗中產(chǎn)生黃色沉淀；碘化汞鉀反應實驗中產(chǎn)生白色沉淀。以上實驗均可證明被檢測物中含有總生物堿[19]。

表2 生物堿鑒別反應Table 2 Alkaloid identification reaction

2.2 單因素實驗結(jié)果

2.2.1 超聲時間對堿蓬草總生物堿提取量的影響 根據(jù)圖1可以看出，堿蓬草總生物堿的提取量隨著超聲時間的增長，提取量也隨之增長，在超聲時間為25 min時，堿蓬草總生物堿的最高提取量為0.58 mg/g。繼續(xù)增加超聲時間，總生物堿提取量變化平穩(wěn)稍有下降，可能是在一定提取時間下隨著超聲時間增加，一些生物堿被破壞[24]。故選擇超聲時間為25 min。

圖1 超聲時間對總生物堿提取量的影響Fig.1 Effects of ultrasonic time on the yield of total alkaloids

2.2.2 超聲溫度對堿蓬草總生物堿提取量的影響 根據(jù)圖2可以看出，堿蓬草總生物堿的提取量隨著超聲溫度的升高，提取量也隨之升高，當溫度升高至40 ℃時，提取量出現(xiàn)最大值。超聲溫度繼續(xù)升高時，堿蓬草總生物堿提取量有所下降，產(chǎn)生這種情況的原因可能是隨著超聲溫度升高，一些雜質(zhì)析出影響了生物堿的提取[25]。故選擇超聲溫度為40 ℃。

2.2.3 乙醇濃度對堿蓬草總生物堿提取量的影響 根據(jù)圖3可以看出，隨著乙醇濃度的升高，堿蓬草總生物堿提取量也隨之升高。當乙醇濃度為75%時，堿蓬草總生物堿提取量為0.58 mg/g。隨著乙醇濃度的繼續(xù)增加總生物堿提取量下降至平穩(wěn)，這可能是由于乙醇濃度繼續(xù)增加時一些揮發(fā)油或糖類等極性較低的物質(zhì)被提取出來，從而影響了生物堿溶出，降低生物堿的提取量[26]，故選擇乙醇濃度為75%。

圖2 超聲溫度對總生物堿提取量的影響Fig.2 Effects of ultrasonic temperature on the yield of alkaloid

圖3 乙醇濃度對總生物堿提取量的影響Fig.3 Effects of ethanol concentration on the yield of alkaloid

2.2.4 料液比對堿蓬草總生物堿提取量的影響 根據(jù)圖4可以看出隨著提取溶劑量的增加，堿蓬草總生物堿的提取量隨之增加。固定乙醇濃度為75%，當料液比為1:10時，總生物堿提取量為0.56 mg/g。繼續(xù)增加料液比，堿蓬草總生物堿提取量有所下降?？赡苁请S著溶劑體積的增大導致對堿蓬草的超聲不充分[27]，故選擇液料比為1:10。

圖4 料液比對堿蓬草總生物堿提取量的影響Fig.4 Effects of the ratio of material to liquid on the yield of alkaloids

2.3 正交設計試驗及結(jié)果

由表3可知，極差（R）值的大小反映了實驗因素對考察指標的影響程度。R值越大，表示實驗因素對堿蓬草總生物堿的提取量影響越大。在堿蓬草總生物堿提取工藝實驗中，對總生物堿提取量的影響因素依次為：料液比＞超聲溫度＞乙醇濃度＞超聲時間。可見，超聲溫度對堿蓬草總生物堿的提取量影響最大，超聲時間對堿蓬草總生物堿的影響最小。堿蓬草總生物堿的最佳提取工藝為A1B3C3D2，即超聲時間為20 min、超聲溫度45 ℃、乙醇濃度85%、料液比（g/mL）為1:10。

表3 正交設計試驗及結(jié)果Table 3 Orthogonal test design and results

由表4可知，料液比與超聲溫度對堿蓬草總生物堿的提取量具有顯著性影響（P＜0.05），超聲時間和乙醇濃度對堿蓬草總生物堿的提取量影響不大。

2.4 驗證試驗

按照1.2.1的方法進行驗證試驗，堿蓬草總生物堿平均提取量為0.65 mg/g，結(jié)果高于正交試驗其它組合結(jié)果，表明該提取工藝穩(wěn)定可行。

2.5 堿蓬草總生物堿抗氧化活性實驗結(jié)果

2.5.1 堿蓬草總生物堿對小鼠體重的影響 在高脂飲食飼養(yǎng)小鼠4周時，體重出現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05），高脂飲食組小鼠體重超過正常組小鼠體重約8%，高脂飲食飼養(yǎng)小鼠16周時小鼠體重出現(xiàn)極顯著差異（P＜0.01），高脂飲食組小鼠體重超過正常組小鼠體重約20%。

表4 正交試驗方差分析Table 4 Analysis of variance of orthogonal test

2.5.2 堿蓬草總生物堿對小鼠肝臟中MDA含量的影響 從表6中可知，小鼠的肝臟正常組MDA值含量在2.15～2.70 U/mg Prot的范圍內(nèi)變化。正常對照組MDA含量到12周時出現(xiàn)峰值，之后基本處于穩(wěn)定狀態(tài)，可能是隨著小鼠的年齡增長其抗氧化能力也隨之減弱。高脂對照組的小鼠，隨著飼養(yǎng)時間的增加，其肝臟中的MDA含量與正常組有顯著差異（P＜0.05）。與正常對照組及高脂飲食對照組比較，堿蓬草總生物堿的低、中、高劑量組均可以降低小鼠肝臟中MDA的含量（P＜0.05），且除高脂飲食組外其余組MDA值均在試劑盒說明書的參考范圍內(nèi)。

表5 喂養(yǎng)高脂飲食小鼠的體重變化（g）Table 5 Body weight changes of mice fed high-fat diet (g)

表6 堿蓬草總生物堿對高脂飲食小鼠肝臟MDA含量的影響（U/mg Prot）Table 6 Effects of total alkaloids of Suaeda salsa on MDA content in liver of mice fed with high-fat diet(U/ Mg prot)

2.5.3 堿蓬草總生物堿對小鼠肝臟中CAT含量的測定從表7中可知，正常組小鼠的肝臟CAT值含量在12.44～16.68 U/mg Prot的范圍內(nèi)變化。CAT是生物防御體系當中重要的末端氧化酶，其主要是清除體內(nèi)的過氧化氫，從而對機體有害物質(zhì)羥基自由的形成[28]。高脂對照組的小鼠，隨著飼養(yǎng)時間的增加，其肝臟中的CAT含量與正常組比較顯著降低（P＜0.05）。與正常對照組及高脂飲食對照組比較，堿蓬草總生物堿的低、中、高劑量組均可以增加小鼠肝臟中CAT的含量，并且出現(xiàn)了劑量效應的關系（P＜0.05）。通過分析表7可知，堿蓬草總生物堿對減少高脂飲食小鼠的肝臟中CAT含量有效，隨著飼養(yǎng)時間的增加，小鼠肝臟中的CAT含量也隨之增加。

表7 堿蓬草總生物堿對高脂飲食小鼠肝臟CAT含量的影響Table 7 Effects of total alkaloids of Suaeda salsa on cat content in liver of mice fed with high-fat diet

表8 堿蓬草總生物堿對高脂飲食小鼠肝臟GSH-Px含量的影響Table 8 Effects of total alkaloids of Suaeda salsa on GSH-Px content in liver of mice fed with high-fat diet

2.5.4 堿蓬草總生物堿對小鼠肝臟中GSH-Px含量的測定 GSH-Px是一種非常重要的催化氧化酶，廣泛分布在細胞內(nèi)，不僅能夠清除體內(nèi)的自由基，還能保護細胞膜的功能與結(jié)構不被破壞[29-30]。由表8可知，正常組小鼠肝臟中GSH-Px指標隨著飼養(yǎng)時間的延長GSH-Px值也隨之增加，高脂對照組與正常對照組比較GSH-Px顯著降低（P＜0.05），可知高脂飲食對小鼠的活性可以造成影響。飼喂高、中、低3個劑量的堿蓬草總生物堿與正常組及高脂對照組相比，隨著飼養(yǎng)時間的增加，肝臟中的GSH-Px值顯著性增加（P＜0.05），高劑量組效果最好。說明堿蓬草總生物堿能夠提高小鼠肝臟中GSH-Px的活性。

3 結(jié)論

堿蓬草總生物堿的最佳提取工藝為：超聲時間20 min、超聲溫度45 ℃、乙醇濃度85%、料液比1:10（g/mL），在此條件下，堿蓬草總生物堿的提取量為0.65 mg/g?？寡趸钚詫嶒灡砻鳎瑝A蓬草總生物堿通過顯著減少小鼠肝臟中MDA含量，增大小鼠肝臟中CAT及GSH-Px的活性(P＜0.05)，進而達到了抗氧化的目的，抗氧化的效果隨著堿蓬草總生物堿劑量的增大而增加。本實驗為進一步開發(fā)與利用堿蓬草資源提供了一定的理論依據(jù)，可作為堿蓬草食品方向的研究基礎。