面包酵母凍干粉保護(hù)劑篩選及其生物活性分析

韓蕓嬌，張媛媛, ，夏雪芬，董施彬，張 彬, ，肖 霄

（1.石家莊學(xué)院，河北石家莊 050035；2.德宏師范高等專科學(xué)校，云南德宏 678400；3.德宏州食品藥品檢驗(yàn)所，云南德宏 678400）

面包酵母（S.cerevisiae）是重要的工業(yè)微生物，廣泛地應(yīng)用于人類主食的制作，如作為優(yōu)良的發(fā)酵劑和營(yíng)養(yǎng)劑用于包子、糕點(diǎn)、面包等面食產(chǎn)品[1-2]。在面包烘培工業(yè)中，面包酵母可以在較短的發(fā)酵時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生二氧化碳使面團(tuán)膨脹，形成內(nèi)相柔軟的面包，并且在發(fā)酵過(guò)程中，代謝產(chǎn)生醇類、羥基化合物和乙酸乙酯等風(fēng)味物質(zhì)。這些風(fēng)味物質(zhì)在焙烤過(guò)程中，通過(guò)氨基酸和糖的反應(yīng)得到吡嗪類化合物，賦予了面包制品的獨(dú)特風(fēng)味[3-4]。在現(xiàn)代食品工業(yè)領(lǐng)域，將新鮮的酵母菌通過(guò)干燥技術(shù)制備成活性酵母粉是一種可行的制劑化方法。有研究表明，與其它干燥方法相比，真空冷凍干燥具有保持微生物較高的存活率，避免雜菌污染而且攜帶方便等特點(diǎn)[5-8]。

然而，在冷凍干燥過(guò)程中酵母菌會(huì)受到預(yù)冷、冰晶、高滲透壓、細(xì)胞脫水等因素的影響，導(dǎo)致其存活率降低或者生物活性喪失。因此，在冷凍干燥過(guò)程中，選擇恰當(dāng)保護(hù)劑十分重要[9-12]。常見(jiàn)的保護(hù)劑有糖、醇、脫脂乳等[13-15]。龍艷珍等[16]研究了棘孢木霉的真空冷凍方法，通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，加入保護(hù)劑后，經(jīng)冷凍干燥得到的菌株的存活率達(dá)到81.25%，并保持較高的活性水平。陳勝杰等[17]以脂乳粉、低聚木糖、可溶性淀粉和VC鈉鹽為基礎(chǔ)，采用正交實(shí)驗(yàn)研究復(fù)合凍干保護(hù)劑，發(fā)現(xiàn)復(fù)合保護(hù)劑能夠有效提高三株實(shí)驗(yàn)菌株的凍干存活率，且活菌數(shù)均高于1.0×108CFU/g。葉鵬等[12]通過(guò)SDS-PAGE凝膠電泳發(fā)現(xiàn)，抗凍劑對(duì)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)均有不同程度的冷凍修復(fù)作用，修復(fù)后的細(xì)胞壁變厚。張雅碩等[18]在副干酪乳桿菌冷凍干燥工藝中加入由脫脂奶粉、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、谷胱甘肽組成的復(fù)合保護(hù)劑，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)副干酪乳桿菌經(jīng)真空冷凍干燥后存活因子達(dá)（0.998±0.001），活菌數(shù)為（2.35±0.02）×1011CFU/g。經(jīng)電鏡觀察發(fā)現(xiàn)菌體形態(tài)飽滿，結(jié)構(gòu)完整，菌體活性保持良好。于紅等[19]以植物乳桿菌發(fā)酵枸杞漿為研究對(duì)象，通過(guò)優(yōu)化得到最佳復(fù)配保護(hù)劑組合為：20%麥芽糊精、14%乳糖、6%海藻糖。在此條件下，益生菌發(fā)酵枸杞凍干粉后活菌數(shù)達(dá)9.6 lg CFU/g，含水量低于3%，色澤完好，復(fù)水性強(qiáng)，產(chǎn)品質(zhì)量佳。目前，關(guān)于面包酵母菌冷凍干燥保護(hù)劑的研究少有報(bào)道。

以實(shí)驗(yàn)室篩選改良的面包酵母菌種3G-28為對(duì)象，以脫脂奶粉、蔗糖、甘油和β-環(huán)狀糊精為復(fù)合保護(hù)劑，進(jìn)行面包酵母凍干粉制作，對(duì)面凍干菌粉的發(fā)酵力、海藻糖含量、蔗糖酶活力以及發(fā)酵液中的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了研究，旨在得到性能優(yōu)良的酵母凍干粉，為微生物工業(yè)化應(yīng)用以及酵母冷凍干燥保護(hù)劑的作用機(jī)理研究提供一定的科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

面包酵母BY-3、3G-28 均為實(shí)驗(yàn)室保存；市售酵母Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ號(hào) 安琪酵母有限股份公司；脫脂奶粉 BD醫(yī)療器械（上海）有限公司；蔗糖（分析純）北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；阿拉伯膠（分析純） 北京Bio-topped科技有限公司；吐溫-80（分析純） 北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司；β-環(huán)狀糊精（食品級(jí)） 孟州市華興生物化工有限責(zé)任公司。

YOD-203真空冷凍干燥機(jī) 美國(guó)Thermo公司；3K15高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Sigma公司；6890N-5975i氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用儀 美國(guó)Agilent公司；SPME（CAR/PDMS, 75 μm） 美國(guó)Supelco公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酵母菌的培養(yǎng) 菌種增殖培養(yǎng)：取面包酵母3G-28的斜面菌種，用接種環(huán)挑取一環(huán)，無(wú)菌條件下接種于YPD培養(yǎng)基[20]中，恒溫30 ℃，搖床轉(zhuǎn)速150 r/min，培養(yǎng)36 h。

1.2.2 酵母凍干粉的制備 取培養(yǎng)好的酵母菌液，于6000 r/min離心10 min，收集菌體沉淀，用無(wú)菌水清洗并稀釋到0.1 g/mL。按菌液與保護(hù)劑比例（v/v）為1:5加入保護(hù)劑，用透氣膜封口后進(jìn)行預(yù)凍，先置于-20 ℃，8 h，再置于-40 ℃，12 h，樣品凍結(jié)完全后放入冷凍溫度為-50 ℃，真空度100 mBar的真空冷凍干燥機(jī)內(nèi)凍干24 h，然后真空封裝，于4 ℃冰箱中儲(chǔ)存。

1.2.3 離心條件的確定 將酵母菌液分別在轉(zhuǎn)速為4000、6000、8000 r/min條件下離心10、20 min，得到的酵母泥用無(wú)菌水水洗兩次，均勻涂布在YPD固體培養(yǎng)基上，30 ℃下靜置培養(yǎng)24 h后，測(cè)定酵母活菌數(shù)量。

1.2.4 保護(hù)劑配比的確定

1.2.4.1 單一保護(hù)劑的篩選 本實(shí)驗(yàn)選擇低分子和高分子共6種不同的保護(hù)劑，通過(guò)活菌計(jì)數(shù)法考察單個(gè)保護(hù)劑在不同濃度下的保護(hù)效果?；罹鷶?shù)量多者說(shuō)明此保護(hù)劑在該濃度下的保護(hù)效果優(yōu)于活菌數(shù)量較低者。將6種保護(hù)劑加入無(wú)菌水配制到所需濃度（w/v），具體為：脫脂奶粉濃度（5%、10%、15%、20%、25%），蔗糖濃度（1%、3%、5%、7%、9%），吐溫-80濃度（5%、10%、15%、20%、25%），阿拉伯膠濃度（5%、10%、15%、20%、25%），β-環(huán)狀糊精濃度（5%、10%、15%、20%、25%），甘油濃度（1%、3%、5%、7%、9%），于121 ℃滅菌20 min，其中脫脂奶粉滅菌溫度為115 ℃，10 min。按照1.2.2的方法制備酵母凍干粉，并測(cè)定活菌數(shù)量。

1.2.4.2 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化 根據(jù)響應(yīng)面分析軟件提供的模型，選?。篈（甘油濃度）、B（脫脂奶粉濃度）、C（β-環(huán)狀糊精濃度）、D（蔗糖濃度）四個(gè)因素為變量，酵母菌的活菌數(shù)量為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)四因素三水平的實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)因素與水平的取值表見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels table of response surface experiment

1.2.5 酵母活菌數(shù)量的測(cè)定 選用平板計(jì)數(shù)法作為實(shí)驗(yàn)過(guò)程中酵母活菌數(shù)量的測(cè)定方法，采用十倍稀釋法適當(dāng)稀釋發(fā)酵液，取1 mL發(fā)酵液加入9 mL無(wú)菌水混勻，再取1 mL稀釋的發(fā)酵液加入9 mL無(wú)菌水，重復(fù)稀釋6～7次。將稀釋液均勻涂布在YPD固體培養(yǎng)基上，恒溫30 ℃，培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行平板計(jì)數(shù)（30～300 CFU/mL范圍內(nèi)），求得單位酵母活菌數(shù)量。

1.2.6 發(fā)酵力的測(cè)定 本研究采用失重法[21]對(duì)制得的BY-3、3G-28、市售Ⅰ，市售Ⅱ，市售Ⅲ五種酵母凍干粉進(jìn)行發(fā)酵力（F）的測(cè)定。

用量筒量取50 mL LF培養(yǎng)基，加入1.0 g活化后的酵母，將錐形瓶置于30 ℃恒溫?fù)u床上，150 r/min培養(yǎng)3 h，每30 min記錄質(zhì)量，用重量的變化來(lái)表示酵母發(fā)酵力大小，見(jiàn)式（1）：

式中：F為菌種的發(fā)酵力，mg/(h·g)；x1為發(fā)酵前錐形瓶的重量，mg；x2為發(fā)酵后錐形瓶的重量，mg；t為發(fā)酵時(shí)間，h；m為添加酵母的重量，g。

1.2.7 海藻糖含量的測(cè)定 稱取1.0 g酵母粉放入干燥離心管中，加入三氯乙酸（0.5%）15 mL，混合均勻，置于冰水浴中提取海藻糖，每隔15 min振蕩一次，提取1 h后離心（3000 r/min；10 min），取上清液放入25 mL容量瓶中，加蒸餾水至刻度，混勻待測(cè)。以15 mL三氯乙酸溶液（0.5%）加蒸餾水至25 mL為空白對(duì)照，選擇蒽酮-硫酸法[22]測(cè)定海藻糖含量。海藻糖含量與吸光值線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=3.8829 x+0.0143，R2=0.9993。

1.2.8 蔗糖酶活力的測(cè)定 取潔凈試管加入蔗糖溶液（0.1 mol/L）1.0 mL，NaAc-HAc緩沖液（0.2 mol/L,pH=5.2）2.0 mL，蒸餾水6.5 mL，于30 ℃水浴5 min，加入0.5 mL酵母液（已知濃度）迅速混勻，繼續(xù)水浴5 min，然后吸取1 mL反應(yīng)液加入到2 mL DNS溶液中，沸水中保持5 min，取出冷卻至室溫，于540 nm測(cè)定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)方程為y=0.1023x+0.0409，R2=0.9992，線性關(guān)系良好[23]。

DNS（3,5-二硝基水楊酸）顯色液的制備方法：稱取酒石酸鉀鈉182.0 g放入500 mL熱的蒸餾水中溶解（水溫不能超過(guò)50 ℃），加熱過(guò)程中依次向溶液中加入3,5-二硝基水楊酸、NaOH、苯酚、無(wú)水亞硫酸鈉質(zhì)量分別為6.3、21.0、5.0、5.0 g，攪拌直至全部溶解，冷卻后用純水定容至1000 mL，室溫下在棕色瓶中保存，放置一周后方能使用。

蔗糖酶活力的定義：30 ℃，pH為5.2時(shí)，單位酵母（每g酵母干物質(zhì)）每分鐘分解蔗糖生成1 mg葡萄糖為一個(gè)活力單位（U）。

式中：A為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求得的葡萄糖含量（μmol）；C為酵母液濃度（g/mL）；0.180為1 μmol葡萄糖的摩爾質(zhì)量（mg）；5為顯色反應(yīng)時(shí)間（min）；0.5為加入的酵母液的體積（mL）。

1.2.9 發(fā)酵液風(fēng)味物質(zhì)成分的測(cè)定 將等量BY-3、3G-28和市售Ⅲ菌種分別置于LF培養(yǎng)基[21]中發(fā)酵，3 h后測(cè)定風(fēng)味物質(zhì)。發(fā)酵液中揮發(fā)性物質(zhì)的萃?。喝“l(fā)酵液于樣品瓶中，放入恒溫水浴中50 ℃下平衡20 min，插入SPME萃取頭，繼續(xù)在50 ℃下保持吸附40 min，GC解吸5 min，進(jìn)行GC-MS分析[24]。

氣相色譜（GC）的條件設(shè)定：DB-WAX毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm×0.25 mm；Agilent），氦氣（He)為載氣，恒定流速為1.2 mL/min，不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣口溫度為250 ℃；程序升溫：初始溫度為40 ℃，保持3 min，以5 ℃ /min升溫到200 ℃，再以10 ℃/min升溫到250 ℃，保持3 min。

質(zhì)譜（MS）的條件設(shè)定：電子轟擊（EI）離子源，電子能量為70 eV，離子源溫度為230 ℃，傳輸線溫度為280 ℃，四級(jí)桿溫度為150 ℃，質(zhì)量掃描范圍m/z 55 ～ 500。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)每組3個(gè)平行樣，每個(gè)平行實(shí)驗(yàn)測(cè)定3次取其平均值，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示”。采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析，采用Origin 8.0進(jìn)行相關(guān)圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 離心條件對(duì)酵母活菌數(shù)量的影響

從圖1看出，離心轉(zhuǎn)速相同時(shí)，活菌數(shù)隨著離心時(shí)間的增加反而變少，說(shuō)明菌體可能受到了過(guò)強(qiáng)的機(jī)械作用導(dǎo)致死亡；離心時(shí)間相同時(shí)，活菌數(shù)隨轉(zhuǎn)速增加先增大后減少，說(shuō)明離心轉(zhuǎn)速在一定范圍內(nèi)（4000～6000 r/min）時(shí)，轉(zhuǎn)速增加能減少菌體隨上清液的流失使得活菌數(shù)增加，但在6000～8000 r/min范圍內(nèi)時(shí)，離心強(qiáng)度過(guò)大引起的機(jī)械作用造成了菌體的死亡。離心時(shí)間和轉(zhuǎn)速對(duì)酵母菌體的存活率具有一定影響，這一結(jié)論與其他研究報(bào)道相符[25-27]。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇離心條件為6000 r/min，時(shí)間10 min。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 不同濃度脫脂奶粉的保護(hù)效果 結(jié)果如圖2所示，與空白組相比，脫脂奶粉對(duì)菌體的保護(hù)效果非常顯著。這是因?yàn)槊撝谭凼且环N常見(jiàn)的大分子胞外保護(hù)劑，能在菌體表面形成一層保護(hù)層，而且奶粉中含有的蛋白、糖類等物質(zhì)可以對(duì)細(xì)胞加以保護(hù)，減少細(xì)胞與介質(zhì)的接觸面積[23]，并可以固定凍干的酶類，防止由于細(xì)胞壁的損傷而引起的胞內(nèi)物質(zhì)滲漏[28]；陳勝杰等[17]研究發(fā)現(xiàn)隨著脫脂乳粉濃度的增加，植物乳桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌和釀酒酵母菌三種菌的存活率均逐漸增加，但是當(dāng)增加到一定濃度后菌體的存活率保持穩(wěn)定或些許下降。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，當(dāng)脫脂奶粉濃度達(dá)到20%時(shí)，濃度的繼續(xù)增加并不會(huì)使保護(hù)效果變化更加明顯，結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際經(jīng)濟(jì)效益方面的考慮，脫脂奶粉濃度選擇20%。

圖2 不同濃度脫脂奶粉的保護(hù)效果Fig.2 Protective effect of different concentrations of skim milk powder

2.2.2 不同濃度蔗糖的保護(hù)效果 結(jié)果如圖3所示，蔗糖作為低溫保護(hù)劑在冷凍干燥過(guò)程中能夠顯著提高酵母菌的存活率。在冷凍干燥過(guò)程中，蔗糖可形成具有高粘度、低流動(dòng)性的玻璃態(tài)基質(zhì)，將蛋白質(zhì)分子支撐起來(lái)，使之不易變性。而且蔗糖分子中的羥基可以與菌體細(xì)胞膜蛋白質(zhì)及膜磷脂上的極性基團(tuán)結(jié)合形成氫鍵，從而對(duì)細(xì)菌的細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)的完整性起到保護(hù)作用[29-30]。蔗糖還可以滲透進(jìn)入細(xì)胞，在細(xì)胞壁和膜間發(fā)揮作用，和溶液中的水分子結(jié)合，減緩晶核的形成，降低在冷凍干燥時(shí)晶核對(duì)細(xì)胞的傷害[31]。隨蔗糖濃度增大，酵母活菌數(shù)量先增多后減小。綜合考慮到酵母的活菌數(shù)量、實(shí)驗(yàn)的可操作性以及生產(chǎn)成本，蔗糖濃度選擇5%。

圖3 不同濃度蔗糖的保護(hù)效果Fig.3 Protective effect of different concentrations of sucrose

2.2.3 不同濃度吐溫-80的保護(hù)效果 從圖4可以看出，與空白對(duì)照相比，吐溫-80濃度在5% ～ 20%之間對(duì)酵母菌的存活均具有保護(hù)作用，這是因?yàn)橥聹?80是一種非離子型表面活性劑，具有較好的乳化能力、潤(rùn)濕能力，在冷凍過(guò)程中減少菌體因脫水造成的蛋白變性，降低凍結(jié)損失；又能在凍干粉復(fù)水時(shí)，對(duì)菌體起到一定水分潤(rùn)濕作用[32]。但是隨著吐溫-80濃度的增加，其保護(hù)作用逐漸減弱，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇吐溫-80濃度為5%，但其酵母菌活菌數(shù)量仍明顯低于其他單體保護(hù)劑。

圖4 不同濃度吐溫-80的保護(hù)效果Fig.4 Protective effect of different concentrations of tween-80

2.2.4 不同濃度阿拉伯膠的保護(hù)效果 阿拉伯膠是一種聚合類保護(hù)劑，廣泛用作乳化劑、穩(wěn)定劑、懸浮劑、黏合劑、成膜劑等。鄒小波等[33]將低溫貯藏的藍(lán)莓果實(shí)進(jìn)行阿拉伯膠復(fù)合涂膜處理，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)可以顯著減緩藍(lán)莓果實(shí)質(zhì)量損失、降低腐爛率和延緩硬度降低（P＜0.05），并能維持果實(shí)較高的總酚、花色苷含量和較好的感官品質(zhì)。其原因是具有較高憎水性的阿拉伯膠能夠在菌體表面形成水蒸氣屏障。在酵母菌體的冷凍干燥過(guò)程中阿拉伯膠作為保護(hù)劑可以減少水分蒸發(fā)，能夠保護(hù)細(xì)胞在受到低溫和脫水時(shí)不被傷害。由圖5可以看出，添加阿拉伯膠對(duì)酵母菌具有一定的保護(hù)作用，阿拉伯膠濃度為25%時(shí)，保護(hù)作用最好，但其酵母菌活菌數(shù)量仍明顯低于其他單體保護(hù)劑。

圖5 不同濃度阿拉伯膠的保護(hù)效果Fig.5 Protective effect of different concentrations of gum Arabic

2.2.5 不同濃度β-環(huán)狀糊精的保護(hù)效果β-環(huán)狀糊精是一種大分子多糖，它可以增加菌體的黏度增加，提高凍干物料的玻璃化溫度，使其不易結(jié)晶。同時(shí)，以β-環(huán)狀糊精作為保護(hù)劑，得到的凍干菌粉呈蓬松狀態(tài)，阻止細(xì)胞收縮變硬，使酵母凍干粉具有良好的復(fù)水性，并提高其生物活性[34]。從圖6可知，與空白對(duì)照相比，β-環(huán)狀糊精對(duì)酵母菌具有很好地保護(hù)作用，當(dāng)β-環(huán)狀糊精的濃度達(dá)到15%時(shí)，酵母菌活菌數(shù)目最大，因此，選擇β-環(huán)狀糊精濃度為15%。

圖6 不同濃度β-環(huán)狀糊精的保護(hù)效果Fig.6 Protective effect of different concentrations of β-cyclodextrin

2.2.6 不同濃度甘油的保護(hù)效果 結(jié)果如圖7所示，保護(hù)效果呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，在5%時(shí)，活菌數(shù)量達(dá)到峰值。其原因是甘油屬于小分子類保護(hù)劑，具有良好的滲透性能，能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，分子中羥基和細(xì)胞中的大分子形成氫鍵，可以部分替代由水形成的氫鍵，使得在失水過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)的大分子物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物和其他大分子物質(zhì)保持原有結(jié)構(gòu)和生物體的活性。由于在甘油添加量1%～5%范圍內(nèi)時(shí)，氫鍵的形成有效的維持了細(xì)胞的活性，此外甘油具有較好的持水性使得在失水過(guò)程中不至于過(guò)快的失去水分，而當(dāng)甘油的添加量超過(guò)5%時(shí)，對(duì)一些大分子諸如蛋白質(zhì)的穩(wěn)定能力達(dá)到了極限，在冷凍干燥的過(guò)程中過(guò)高的濃度使得蛋白質(zhì)發(fā)生了變性影響了細(xì)胞的活性。因此甘油的濃度選擇5%。

圖7 不同濃度甘油的保護(hù)效果Fig.7 Protective effect of different concentrations of glycerine

2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.3.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)脫脂奶粉、蔗糖、甘油和β-環(huán)狀糊精保護(hù)效果較好，故分別設(shè)定為變量A、B、C、D，酵母菌的活菌數(shù)量為響應(yīng)值（Y），采用Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)了27組試驗(yàn)，24組為析因點(diǎn)試驗(yàn)，3組為重復(fù)零點(diǎn)試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，用Design-Expert軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行二元多項(xiàng)式回歸模擬，得到回歸方程如下：

由表3可知，本實(shí)驗(yàn)所得到的回歸模型F值為13.67，P值＜0.0001說(shuō)明此實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷倪_(dá)到極顯著水平，失擬項(xiàng)P=0.0730，呈不顯著，表明該模型真實(shí)可靠。四種變量中甘油濃度對(duì)響應(yīng)值（活菌數(shù)量）的影響最為顯著（P小于0.05），且四個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值的影響效果依次為：A甘油濃度＞D蔗糖濃度＞B脫脂奶粉濃度＞Cβ-環(huán)狀糊精濃度。模型的總決定系數(shù)為R2=0.9410，校正決定系數(shù)為R2Adj=0.8721，說(shuō)明試驗(yàn)誤差較小，模型與實(shí)際預(yù)測(cè)值擬合效果好，本模型可以解釋87.21%響應(yīng)值的變化。本實(shí)驗(yàn)的變異系數(shù)（C.V.）為2.36%＜5%，這表明實(shí)驗(yàn)具有較高的重復(fù)度和準(zhǔn)確性。因此回歸方程可以很好地描述各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系。

2.3.2 響應(yīng)面交互作用分析與優(yōu)化 以A（甘油濃度）、B（脫脂奶粉濃度）、C（β-環(huán)狀糊精濃度）、D（蔗糖濃度）為影響因子，以酵母菌活菌數(shù)量為響應(yīng)值，根據(jù)上述回歸方程做出響應(yīng)面分析圖及等高線圖，如圖8～圖13所示。通過(guò)圖組可以直觀的觀察各個(gè)因素的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響。圖中各因素的邊線坡度越小則該因素對(duì)酵母菌活菌數(shù)量的影響越小，因素的邊線的坡度越陡則該因素對(duì)酵母菌活菌數(shù)量的影響越大[35]。由組圖分析得到的各因素對(duì)響應(yīng)值的影響效果與方差分析結(jié)果一致。響應(yīng)曲面的坡度反映了兩因素的交互作用效果，曲面坡度越陡峭，表明兩因素交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響越顯著，反之，代表二者交互作用不顯著[36]。由圖12可知，脫脂奶粉濃度和蔗糖濃度之間的交互影響顯著，表現(xiàn)為響應(yīng)面曲線坡度最為陡峭。但各因素的交互作用下酵母細(xì)胞存活數(shù)量的變化均呈現(xiàn)正拋物線形狀，表明各因素在波動(dòng)水平內(nèi)均存在峰值任意兩個(gè)因素的交互作用都存在一個(gè)最高點(diǎn)，說(shuō)明通過(guò)改變這四個(gè)因素，可以使酵母菌活菌數(shù)量達(dá)到最高[37]。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiment

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

2.3.3 最佳保護(hù)劑配比的確定與驗(yàn)證 通過(guò)Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)二次多項(xiàng)式回歸方程進(jìn)行分析，得出最優(yōu)設(shè)計(jì)為：A（甘油濃度）4.72%，B（脫脂奶粉濃度）20.15%，C（β-環(huán)狀糊精濃度）15.06%，D（蔗糖濃度）5.14%，預(yù)測(cè)值為36.9035×109個(gè)/mL。為了便于具體實(shí)驗(yàn)操作，將各因素條件優(yōu)化為：甘油濃度4.7%，脫脂奶粉濃度20%，β-環(huán)狀糊精濃度15%，蔗糖濃度5%。在此條件下重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，實(shí)際測(cè)得的酵母活菌數(shù)量為36.89×109個(gè)/mL，表明模型與實(shí)際操作擬合度良好。

2.4 發(fā)酵力的測(cè)定結(jié)果

分別將酵母菌株BY-3、3G-28、市售Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ號(hào)，按照1.2.5的方法制成酵母粉，進(jìn)行發(fā)酵能力測(cè)定實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖14所示，與其它菌株相比，菌株3G-28的發(fā)酵能力最好，為214 mg/h/g干酵母。這是因?yàn)?G-28為改良菌株，以BY-3菌株為初始菌株，通過(guò)空氣等離子體技術(shù)誘變得到。該菌株在改良后較初始菌株發(fā)酵力提高了48.57%，在高糖面團(tuán)和無(wú)糖面團(tuán)中均能保持較高的酵母活力，特別是在低溫耐受性方面明顯優(yōu)于初始菌株，因此，3G-28酵母菌凍干粉表現(xiàn)出良好的發(fā)酵力[21]。

2.5 海藻糖含量的分析

前期研究表明，菌株3G-28在-20 ℃低溫下進(jìn)行保藏，兩周后，其菌株的相對(duì)發(fā)酵力可達(dá)到76.10%，酵母泥的相對(duì)發(fā)酵力為83.91%[21]。有文獻(xiàn)表明，酵母細(xì)胞的耐冷凍性與發(fā)酵開(kāi)始前細(xì)胞內(nèi)的海藻糖含量有關(guān)，并且高含量海藻糖的酵母比低含量海藻糖的酵母的保存期限長(zhǎng)，這是因?yàn)楹Ｔ逄堑慕Y(jié)構(gòu)穩(wěn)定，在冷凍干燥過(guò)程中可以保護(hù)膜和蛋白質(zhì)不被破壞[38-39]。因此，海藻糖含量的測(cè)定也是衡量酵母性能的一個(gè)指標(biāo)。分別對(duì)五種酵母凍干制粉進(jìn)行海藻糖含量的測(cè)定，結(jié)果如圖15所示，菌株3G-28的海藻糖含量為44.220 mg/g干酵母，處于一個(gè)較高的水平，相較于其它四種酵母凍干粉，性能較優(yōu)，耐冷凍性和耐儲(chǔ)存能力較好。

2.6 蔗糖酶活力的分析

對(duì)于酵母菌來(lái)說(shuō)，在利用蔗糖作為碳源時(shí)，蔗糖在細(xì)胞外的分解速度遠(yuǎn)高于細(xì)胞內(nèi)己糖的代謝速度，從而導(dǎo)致環(huán)境滲透壓快速升高，生長(zhǎng)受到抑制。因此，降低酵母菌蔗糖酶活力，維持適宜的滲透壓水平，不僅可以保持其細(xì)胞的活性，在面團(tuán)含糖較高時(shí)也能保持酵母的發(fā)酵活性[40]。在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，酵母菌3G-28蔗糖酶活力較初始菌株BY-3降低了71.89%，在高糖面團(tuán)和無(wú)糖面團(tuán)中均能保持較高的酵母活力[21]。分別對(duì)五份酵母凍干制粉進(jìn)行蔗糖酶活力的測(cè)定，結(jié)果如圖16所示，菌株3G-28的蔗糖酶活力為20.27 U/g干酵母，低于其它菌株，即在面團(tuán)含糖較高時(shí)，其發(fā)酵活性高于其他4種酵母凍干粉。

圖8 甘油和脫脂奶粉交互作用的響應(yīng)面和等高線Fig.8 The response surface and contour map of glycerine and skim milk powder

圖9 甘油和β-環(huán)狀糊精交互作用的響應(yīng)面和等高線Fig.9 The response surface and contour map of glycerine and β-cyclodextrin

圖10 甘油和蔗糖交互作用的響應(yīng)面和等高線Fig.10 The response surface and contour map of glycerine and sucrose

圖11 脫脂奶粉和β-環(huán)狀糊精交互作用的響應(yīng)面和等高線Fig.11 The response surface and contour map of skim milk powder and β-cyclodextrin

圖12 脫脂奶粉和蔗糖交互作用的響應(yīng)面和等高線Fig.12 The response surface and contour map of skim milk powder and sucrose

圖13 β-環(huán)狀糊精和蔗糖交互作用的響應(yīng)面和等高線Fig.13 The response surface and contour map of β-cyclodextrin and sucrose

圖14 不同菌株的發(fā)酵力Fig.14 Fermenting power of different strains

2.7 發(fā)酵液風(fēng)味物質(zhì)成分的測(cè)定及比較

選取BY-3、3G-28和綜合表現(xiàn)較好的市售Ⅲ號(hào)，三種酵母凍干粉進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，采用固相微萃取結(jié)合GC-MS的方法分別對(duì)發(fā)酵液體培養(yǎng)基所含的風(fēng)味物質(zhì)成分進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4。

三個(gè)樣品檢測(cè)到的揮發(fā)性物質(zhì)主要包括醇類、酯類、醛類和烴類。其中市售Ⅲ發(fā)酵液樣品檢測(cè)到的風(fēng)味物質(zhì)共18種，分別為醇類5種，酯類7種，烴類5種，醛類1種，各組分占例為57.73%，24.32%，13.38%，1.28%；BY-3發(fā)酵液樣品檢測(cè)到的風(fēng)味物質(zhì)共19種，分別為醇類5種，酯類6種，醛類3種，烴類5種，各組分占例為44.38%，26.66%，6.45%和11.20%；3G-28發(fā)酵液樣品檢測(cè)到的風(fēng)味物質(zhì)共18種，分別為醇類6種，酯類7種，醛類2種，烴類3種，各組分占例為62.85%，21.17%，1.31%，9.68%。表明在保護(hù)劑的作用下，酵母凍干粉的發(fā)酵力和性能得到了很好的保留。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果顯示，樣品中的主要風(fēng)味物質(zhì)為醇類，其次為酯類。三個(gè)樣品中共同檢測(cè)出的醇類主要有：乙醇、2-乙基己醇和苯乙醇，醇類是風(fēng)味物質(zhì)的重要組成部分，在焙烤過(guò)程中，通過(guò)一系列化學(xué)反應(yīng)帶給面包制品的獨(dú)特風(fēng)味，其中，經(jīng)菌株3G-28發(fā)酵的樣品中醇類含量最高，表現(xiàn)出較好的發(fā)酵性能及較高的實(shí)用性。

圖15 不同菌株的海藻糖含量Fig.15 Trehalose content of different strains

3 結(jié)論

本文在前期研究的基礎(chǔ)上，對(duì)改良酵母菌株3G-28的凍干粉的生產(chǎn)及其生物活性進(jìn)行了研究。通過(guò)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)得到了面包酵母3G-28的最佳凍干保護(hù)劑配方為：甘油濃度4.7%，脫脂奶粉濃度20%，β-環(huán)狀糊精濃度15%，蔗糖濃度5%，添加該保護(hù)劑制得的面包酵母凍干粉活菌數(shù)量為36.89×109個(gè)/mL。該面包酵母凍干粉性能較優(yōu)，其發(fā)酵能力為214 mg/h/g干酵母，海藻糖含量為44.22 mg/g干酵母，蔗糖酶活力20.27 U/g干酵母。通過(guò)GC-MS對(duì)3G-28酵母菌凍干粉、市售酵母菌凍干粉和初始菌株酵母凍干粉的發(fā)酵液風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析比較，發(fā)現(xiàn)3G-28酵母菌凍干粉具有較好的風(fēng)味特質(zhì)，由其發(fā)酵的樣品中風(fēng)味物質(zhì)醇類含量最高。本研究具有很強(qiáng)的實(shí)用價(jià)值，為改善面包產(chǎn)品品質(zhì)、推進(jìn)微生物工業(yè)化應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

圖16 不同菌株的蔗糖酶活力Fig.16 Invertase activity of different strains

表4 發(fā)酵液風(fēng)味物質(zhì)成分Table 4 The flavor composition of before and after fermentation