凝結(jié)芽孢桿菌抑菌性能的研究進(jìn)展

■柳成東 趙 平 王乙茹 王春羲 程志斌*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明650201；2.達(dá)州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川達(dá)州635001；3.昆明三正生物科技（集團(tuán)）有限公司，云南昆明650217）

2020年7月1日我國飼料與養(yǎng)殖業(yè)全面實施飼料“減抗”“禁抗”以來，飼用益生菌等有效“替抗”飼料添加劑的研究越來越受到關(guān)注（程志斌等，2017；夏濤等，2018；王乙茹等，2020）。參照飼用抗生素改善畜禽生產(chǎn)性能的主要機理——抑菌作用（柳成東等，2020），當(dāng)前各類創(chuàng)新研發(fā)的替抗飼料添加劑（包括飼用益生菌）均在積極評估其抑菌作用，以驗證“替抗”動物試驗的應(yīng)用效果（夏濤等，2018；楊保和等，2018；夏濤等，2019）。

凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）2013年12月正式列入我國《飼料添加劑品種目錄》，近7年的科學(xué)研究與生產(chǎn)實踐均表明，凝結(jié)芽孢桿菌具有抑制畜禽腸道有害菌、調(diào)控腸道菌群的作用（Lee等，2018；Zhou等，2020）。然而，本課題組匯總了國內(nèi)外凝結(jié)芽孢桿菌抑菌實驗和（或）實驗報道發(fā)現(xiàn)，凝結(jié)芽孢桿菌抑菌性能的研究客觀存在“評估方法繁雜、判定標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一、系統(tǒng)性研究不足”等諸多問題。文章綜述與分析了以上這些問題，提出未來凝結(jié)芽孢桿菌抑菌性能研究的方向，以明確凝結(jié)芽孢桿菌抑菌作用及效果，為凝結(jié)芽孢桿菌在飼料及養(yǎng)殖業(yè)的替抗應(yīng)用奠定科學(xué)基礎(chǔ)。

1 凝結(jié)芽孢桿菌抑菌性能評估的研究方法

凝結(jié)芽孢桿菌抑菌性能的評估研究主要包括二類，體外抑菌實驗評估（in vitrobacteriostatic evaluation）和體內(nèi)抑菌實驗評估（in vivobacteriostatic evaluation）。凝結(jié)芽孢桿菌體外抑菌實驗評估已采用的方法包括：牛津杯法（Majeed等，2016；Fu等，2018）、最小抑菌濃度法（郭豐慶等，2020）、殺菌能力法（Pan等，2013）、平板劃線法（陳桂芳等，2018）等。體內(nèi)抑菌實驗評估一般通過檢測飼喂凝結(jié)芽孢桿菌的動物腸道食糜及糞便中標(biāo)志性特定細(xì)菌的數(shù)量（腸道有害菌、腸道有益菌），來評估飼用凝結(jié)芽孢桿菌對畜禽腸道菌群的調(diào)控效果，尤其是評估對腸道有害菌的抑制作用。腸道特定細(xì)菌數(shù)量檢測一般采用平板計數(shù)法（Lan等，2017；Khajeh等，2020）、實時熒光定量PCR法（趙娜等，2017；Pu等，2018）、宏基因組測序法（Wu等，2018；Li等，2019）等。

牛津杯法是體外抑菌實驗評估凝結(jié)芽孢桿菌抑菌作用的最常用方法（姚曉紅等，2015；張韻等，2017；嚴(yán)濤等，2018；李靜舒等，2020）。然而，匯總以往的實驗報道（見表1）發(fā)現(xiàn)，牛津杯法評估凝結(jié)芽孢桿菌抑菌性能的存在的問題是：以抑菌圈直徑值（diameter of inhibition zone,DIZ）來判斷抑制作用的標(biāo)準(zhǔn)尚未統(tǒng)一（馮媛媛等，2017）。姚曉紅等（2015）用牛津杯法評估凝結(jié)芽孢桿菌對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑制作用，采用的抑菌作用判定標(biāo)準(zhǔn)是：“高敏感”（DIZ＞20 mm）、“中敏感”（10 mm＜DIZ＜20 mm）和“低敏感”（DIZ＜10mm）。Fu等（2018）用牛津杯法同樣評估凝結(jié)芽孢桿菌對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑制作用，采用判定標(biāo)準(zhǔn)是：“高敏感”（DIZ＞12 mm）、“低敏感”（6 mm＜DIZ＜12 mm）和“不敏感”（DIZ＜6 mm）。最新的李靜舒等（2020）的研究，將牛津杯法評估凝結(jié)芽孢桿菌抑制大腸桿菌的判定標(biāo)準(zhǔn)分為4個檔次：“高敏感”（DIZ＞20 mm）、“中敏感”（16 mm＜DIZ＜20 mm）、“低敏感”（7.8 mm＜DIZ＜12 mm）和“不敏感”（DIZ＜7.8 mm）。以上抑菌作用判定標(biāo)準(zhǔn)的差異造成凝結(jié)芽孢桿菌抑菌效果無法比較。

傳統(tǒng)的平板計數(shù)法能夠直接檢測腸道特定菌及屬的總數(shù)，其優(yōu)點是檢測結(jié)果直觀、可判讀性高，缺點是檢測效率低、數(shù)據(jù)可重復(fù)性較差（郭佳等，2020；馬培培等，2020）。實時熒光定量PCR法也可以直接檢測腸道特定菌，其優(yōu)點是檢測效率高，但缺點是只能檢測指示菌的相對值，尤其是無法定量腸道總菌數(shù)的數(shù)量級變化（李萌等，2018）。宏基因組測序法可高效地檢測飼喂凝結(jié)芽孢桿菌對動物腸道大部分細(xì)菌種屬的影響，但缺點是只能檢測細(xì)菌豐度值，尤其是無法定量某一特定腸道菌的數(shù)量級（高航等，2020）。因此，由于檢測方法不同，評估飼用凝結(jié)芽孢桿菌對畜禽腸道菌

群影響的報道有一定的差異（趙娜等，2017；Zhen等，2018）。此外，凝結(jié)芽孢桿菌添加量、添加方式、實驗動物品種、試驗日齡、采樣部位等因素也會影響飼用凝結(jié)芽孢桿菌調(diào)控腸道菌群的作用效果（見表2）。

表1 凝結(jié)芽孢桿菌體外抑菌實驗的抑菌圈直徑(DIZ)(牛津杯法，mm)

表1（續(xù)）凝結(jié)芽孢桿菌體外抑菌實驗的抑菌圈直徑(DIZ)(牛津杯法，mm)

表2 飼用凝結(jié)芽孢桿菌對畜禽腸道菌群的調(diào)控效果（飼養(yǎng)實驗，腸菌數(shù)測定）

表2（續(xù)）飼用凝結(jié)芽孢桿菌對畜禽腸道菌群的調(diào)控效果（飼養(yǎng)實驗，腸菌數(shù)測定）

2 凝結(jié)芽孢桿菌抑菌性能的評估

2.1 凝結(jié)芽孢桿菌對畜禽腸道有害菌的抑制作用

等，2018；李靜舒等，2020；周倩等，2020）、對沙門氏菌的DIZ值為10.2～18.6 mm（Majeed等，2016；張韻等，2017；趙麗娜，2017；金迅等，2018；周倩等，2020），說明凝結(jié)芽孢桿菌對畜禽腸道主要有害菌有一定的抑制作用。然而，唯一一篇報道顯示：凝結(jié)芽孢桿菌LU-B02對大腸桿菌沒有抑制作用（劉全永等，2015）。

對應(yīng)表1和表2匯總了飼喂凝結(jié)芽孢桿菌對豬雞腸道主要有害菌的影響。在肉雞飼糧中添加凝結(jié)凝結(jié)芽孢桿菌的報道顯示：與對照組（BD）相比，實驗組（PD）雞腸道食糜大腸桿菌數(shù)量降低9.5%～100.0%（Hung等，2012；王政等，2016；趙娜等，2017；Zhen等，2018；Wu等，2018）、沙門氏菌數(shù)量下降18.5%～60.8%（Zhen等，2018）。趙娜等（2017）使用AV500肉雞，1～42日齡試驗階段在飼糧中添加0.3×106CFU/g（全價配合飼料）凝結(jié)芽孢桿菌，檢測42日齡腸道大腸桿菌結(jié)果顯示：與BD組相比，飼喂凝結(jié)芽孢桿菌的PD組肉雞盲腸大腸桿菌數(shù)量下降100.0%。Zhen等（2018）研究1.6×106CFU/g飼用凝結(jié)芽孢桿菌對科寶肉雞腸道菌群的影響，42日齡腸道菌群檢測結(jié)果顯示：與BD組相比，PD組肉雞盲腸大腸桿菌數(shù)量下降65.1%。Wu等（2018）在AA肉雞飼糧中添加4.0×106CFU/g凝結(jié)芽孢桿菌，至42日齡檢測腸道大腸桿菌數(shù)量的結(jié)果也顯示PD組肉雞盲腸大腸桿菌數(shù)量比BD組下降了65.1%。此外，只有Zhen等（2018）報道了肉雞飼喂凝結(jié)芽孢桿菌對腸道沙門氏菌數(shù)量級降低的效果，這一方面的研究及數(shù)據(jù)有待于豐富。

在仔豬飼糧中添加凝結(jié)凝結(jié)芽孢桿菌的報道顯示：與BD組相比，PD組仔豬腸道食糜或糞便中大腸桿菌數(shù)量降低46.4%～91.7%（王向榮等，2013；黃遵錫等，2017；黃遵錫等，2020）。王向榮等（2013）使用DLY斷奶仔豬，在32～67日齡試驗階段，在飼糧中添加0.16×107CFU/g凝結(jié)芽孢桿菌，發(fā)現(xiàn)PD組糞便中的大腸桿菌比BD組下降了30.9%。隨后，黃遵錫等（2017、2020）連續(xù)報道，飼喂0.5×107CFU/g和2.0×107CFU/g凝結(jié)芽孢桿菌的PD組仔豬糞便、食糜中大腸桿菌比BD組分別下降了46.4%和90.8%。然而，至今沒有飼用凝結(jié)芽孢桿菌對豬腸道沙門氏菌數(shù)量級影響的試驗報道，這一方面的研究有待補充。

以上分析表明：肉雞飼糧添加106CFU/g凝結(jié)芽孢桿菌、仔豬飼糧添加106～107CFU/g凝結(jié)芽孢桿菌，能夠有效降低豬雞腸道有害菌大腸桿菌，且這一效果與體外牛津杯法評估結(jié)果相符。然而，對于沙門氏菌的抑制效果，有待于更多的動物試驗證明。

2.2 凝結(jié)芽孢桿菌對畜禽腸道有益菌的影響

表2匯總了飼喂凝結(jié)芽孢桿菌對豬雞腸道主要有益菌的影響。在肉雞飼糧中添加凝結(jié)凝結(jié)芽孢桿菌的報道顯示：與BD組相比，PD組雞腸道食糜乳酸桿菌數(shù)量提高55.6%～1 350.0%（Hung等，2012；王政等，2016；Wu等，2018；Zhen等，2018）、雙歧桿菌數(shù)量提高4.0%～478.9%（Wu等，2018；Zhen等，2018）。Zhen等（2018）使用科寶肉雞，1～42日齡試驗階段在日糧中添加1.6×106CFU/g凝結(jié)芽孢桿菌，檢測腸道有益菌的結(jié)果顯示：肉雞18日齡，PD組比BD組盲腸乳酸桿菌、雙歧桿菌分別提高113.8%和233.3%；肉雞42日齡，PD組比BD組盲腸乳酸桿菌、雙歧桿菌分別提高57.3%和8.0%。Wu等（2018）使用AA肉雞，研究4.0×106CFU/g凝結(jié)芽孢桿菌對腸道有益菌的影響，結(jié)果顯示，肉雞28日齡，PD組比BD組盲腸乳酸桿菌、雙歧桿菌分別提高154.5%和478.9%；肉雞42日齡，PD組比BD組盲腸乳酸桿菌、雙歧桿菌分別提高55.6%和4.0%。以上結(jié)果表明，飼糧添加凝結(jié)芽孢桿菌對肉雞前期腸道有益菌乳酸桿菌和雙歧桿菌有較好的增加效應(yīng)，但隨著肉雞日齡增加及凝結(jié)芽孢桿菌的持續(xù)使用，似乎對后期肉雞腸道有益菌的增加效應(yīng)減弱，尤其是對雙歧桿菌無增加效應(yīng)。

在仔豬飼糧中添加凝結(jié)芽孢桿菌的報道顯示，與BD組相比，PD組仔豬腸道食糜或糞便中乳酸桿菌數(shù)量提高81.8%～727.6%（王向榮等，2013；黃遵錫等，2017；黃遵錫等，2020）、雙歧桿菌提高54.5%（王向榮等，2013）。黃遵錫等（2017、2020）連續(xù)報道，飼喂高劑量0.5×107CFU/g和2.0×107CFU/g凝結(jié)芽孢桿菌的PD組乳酸桿菌比BD組分別提高了270.8%和727.6%。王向榮等（2013）研究表明，與BD組相比，0.16×107CFU/g較低劑量的凝結(jié)芽孢桿菌使仔豬糞便乳酸桿菌數(shù)量提高81.8%。以上結(jié)果表明，仔豬飼糧添加凝結(jié)芽孢桿菌具有顯著增加腸道有益菌乳酸桿菌的作用，且這一作用有顯著的劑量效應(yīng)。此外，只有一篇報道顯示飼糧添加凝結(jié)芽孢桿菌具有增加仔豬腸道有益菌雙歧桿菌的作用（王向榮等，2013），因此這一方面的研究有待于完善。

在體外抑菌實驗評估方面，迄今為止沒有凝結(jié)芽孢桿菌對畜禽腸道有益菌（包括乳酸桿菌、雙歧桿菌等）的研究報道，因此這一方面的研究亟待開展。

2.3 凝結(jié)芽孢桿菌對飼料及飼料源金黃色葡萄球菌的抑制作用

表1匯總了牛津杯法評估凝結(jié)芽孢桿菌對金黃色葡萄球菌的抑制作用，結(jié)果顯示凝結(jié)芽孢桿菌對金黃色葡萄球菌抑菌作用的DIZ值范圍14.4～20.7 mm（Majeed等，2016；張韻等，2017；趙麗娜，2017；金迅等，2018；周倩等，2020），說明凝結(jié)芽孢桿菌對存在于飼料和飼料原料中有害菌金黃色葡萄球菌有較好的抑制作用。只有劉全永等（2015）研究報道顯示，凝結(jié)芽孢桿菌LU-B02對金黃色葡萄球菌沒有抑制作用。

2.4 凝結(jié)芽孢桿菌對商業(yè)飼用益生菌的抑菌作用

我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部規(guī)范的可以在飼料中添加的商業(yè)飼用益生菌有34種《飼料添加劑品種目錄（2013）》，其中以單一菌或復(fù)合菌在飼料及養(yǎng)殖生產(chǎn)中應(yīng)用較為廣泛的包括（唐仁龍等,2018）：芽孢桿菌（枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌）、乳酸菌（屎腸球菌、糞腸球菌）、酵母菌（產(chǎn)朊假絲酵母、釀酒酵母）等。表1匯總了牛津杯法評估凝結(jié)芽孢桿菌對主要商業(yè)飼用益生菌抑制作用的研究報道，分析顯示：①凝結(jié)芽孢桿菌對主要商業(yè)飼用益生菌的體外抑菌作用評估缺乏系統(tǒng)性。目前，只有凝結(jié)芽孢桿菌對枯草芽孢桿菌、啤酒酵母和植物乳桿菌的研究結(jié)果（姚曉紅等，2015；趙鈺等，2015；Fu等，2018；），對當(dāng)前“替抗”應(yīng)用較為普遍的地衣芽孢桿菌、屎腸球菌、糞腸球菌等飼用益生菌的抑制研究沒有客觀數(shù)據(jù)報道。②采用牛津杯法評估凝結(jié)芽孢桿菌對枯草芽孢桿菌的抑制作用有矛盾。姚曉紅等（2015）用牛津杯法評估了3株凝結(jié)芽孢桿菌（菌株編號B4、BFS-2、NJ）對枯草芽孢桿菌的抑制作用，結(jié)果顯示3株凝結(jié)芽孢桿菌對枯草芽孢桿菌均有一定的抑制作用。同年，趙鈺等（2015）也用牛津杯法得出凝結(jié)芽孢桿菌（菌株編號LL1103）對枯草芽孢桿菌有抑制作用的結(jié)論。Fu等（2018）再次證明凝結(jié)芽孢桿菌（菌株編號L1208）對枯草芽孢桿菌有抑制作用。相反，劉全永等（2015）卻報道凝結(jié)芽孢桿菌（菌株編號LU-B02）對枯草芽孢桿菌沒有抑制作用。進(jìn)一步分析，2篇飼養(yǎng)試驗結(jié)果顯示：飼用凝結(jié)芽孢桿菌與枯草芽孢桿菌組合飼喂仔豬的生長性能低于單一凝結(jié)芽孢桿菌的飼喂效果，這一結(jié)果支持了牛津杯法評估凝結(jié)芽孢桿菌與枯草芽孢桿菌有頡頏效應(yīng)的觀點（黃遵錫等，2017；王乙茹等，2018）。

綜合以上結(jié)果，鑒于凝結(jié)芽孢桿菌與其他商業(yè)飼用益生菌之間可能存在頡頏效應(yīng)，因系統(tǒng)地開展凝結(jié)芽孢桿菌對其他商業(yè)飼用益生菌的抑菌作用研究，才能科學(xué)地指導(dǎo)飼料與養(yǎng)殖企業(yè)選擇凝結(jié)芽孢桿菌和其他飼用益生菌的組合應(yīng)用。

3 展望

借鑒飼用抗生素抑菌促生長的作用效果，在當(dāng)前“禁抗”的大形勢下，飼糧補充凝結(jié)芽孢桿菌具有抑制畜禽腸道有害菌、維持腸道菌群平衡的作用，從而改善畜禽健康與生產(chǎn)性能。未來的研究應(yīng)加快凝結(jié)芽孢桿菌體內(nèi)、體外的系統(tǒng)抑菌性能評估，重點要補充凝結(jié)芽孢桿菌對腸道有益菌和其他商業(yè)益生菌的可能抑制作用研究，為凝結(jié)芽孢桿菌在飼料及養(yǎng)殖業(yè)的替抗應(yīng)用奠定科學(xué)基礎(chǔ)。