丹參飲預(yù)處理保護缺血/再灌注損傷模型大鼠心肌細胞實驗研究

任耀龍，楊 磊，趙明君，鄭 剛，徐佳萌，尤金枝，李瑩超

(1.陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，陜西 咸陽 712021；2.陜西中醫(yī)藥大學，陜西 咸陽 712046)

急性心肌梗死是常見的嚴重威脅人類生命安全的心血管系統(tǒng)急危重癥,臨床治療的首要目的在于盡快開通阻塞血管,恢復(fù)心肌血流灌注。然而，伴隨而來的心肌缺血/再灌注損傷(Myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI)嚴重制約了臨床獲益[1]。目前，認為MIRI與氧化應(yīng)激[2]、細胞內(nèi)鈣超載[3]、生理pH值快速恢復(fù)[4]、心肌能量代謝障礙[5]、炎癥反應(yīng)[6]等有關(guān)，但其具體病理生理機制尚未明確，且西醫(yī)學應(yīng)對手段較為有限。丹參飲由丹參、檀香、砂仁組成，具有活血祛瘀、行氣止痛等臨床功效，廣泛應(yīng)用于急性心肌梗死的臨床治療，并顯示出一定的臨床療效。本研究以丹參飲預(yù)處理干預(yù)大鼠MIRI模型在體心肌細胞，探索中醫(yī)經(jīng)典名方丹參飲對大鼠心肌的保護作用及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 研究動物：選擇SPF級健康成年SD大鼠50只，雄性25只，雌性25只，質(zhì)量180～210 g，購于成都達碩實驗動物有限公司，許可證號[SCXK(川)2015-030]。實驗動物飼養(yǎng)于陜西中醫(yī)藥大學協(xié)同創(chuàng)新中心SPF級動物實驗中心，給予標準飼料及飲用水喂養(yǎng)7 d后用于實驗。

1.1.2 主要試劑與儀器：肌酸激酶同工酶(Creatine kinase-MB，CK-MB)和N-末端腦鈉肽前體(N-terminal probrain natriuretic peptide，NT-proBNP)試劑盒(批號20191231)，乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase， LDH)試劑盒(批號20191228)。八通道研究型高速記錄系統(tǒng)(澳大利亞埃德公司，型號PL3508/P)、SC-5型小動物呼吸機、全自動酶標儀(美國Bio-Tek公司，型號ELXSOSIU)、高速冷凍離心機(日本日立公司，型號CR22GⅡ)、Leica VT1000 S振動切片機、TC-120S生物組織自動脫水機、TR-180生物組織自動染色、倒置熒光數(shù)碼顯微鏡[Nikon公司，型號TS100-F(配DS-5MC)IX73-U]。

1.2 實驗方法

1.2.1 丹參飲：丹參、檀香各15 g，砂仁10 g，實驗藥物均購于陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院中草藥房。藥物制備：精確稱取生藥40 g，加12倍自來水，浸泡30 min，按藥物質(zhì)量/水量=1/8量加水煎煮2次(檀香后下)，藥液以1000 r/min，離心10 min除雜質(zhì)，濃縮為含生藥濃度1 g/ml，4 ℃下密封冷藏備用。

1.2.2 建模、分組及給藥：將實驗動物隨機分為五組：假手術(shù)組、模型組、丹參飲低劑量組、丹參飲中劑量組、丹參飲高劑量組，每組10只，每組雌雄各5只。參考實驗動物模型制備文獻[7]并進行改進，具體操作方法如下。大鼠實驗前12 h禁食、不禁水，以10%水合氯醛3.5 ml/kg劑量腹腔注射、實施麻醉后仰位固定于動物解剖臺，正確連接Medlab信號采集系統(tǒng)，監(jiān)測Ⅱ?qū)?lián)心電圖，氣管切開行氣管插管接小動物呼吸機(潮氣量2.5 ml，呼吸頻率70次/min，呼吸比1∶2)，觀察穩(wěn)定5 min后于胸骨左緣約0.5 cm處進行開胸，剪斷第4肋，刺破胸膜充分暴露心臟，剪開心包后將心臟擠出胸腔，于左心耳與肺動脈圓錐交界處高位以0號手術(shù)線縫針穿過左前降支(Left anterior descending，LAD)，同時將直徑1 mm的聚乙烯管置于手術(shù)線與LAD之間，拉緊手術(shù)線使聚乙烯管壓迫LAD造成急性心肌缺血模型，觀察心電圖以ST段抬高大于0.1 mV為結(jié)扎成功標志。缺血45 min后去除聚乙烯管恢復(fù)LAD灌注，以心臟表面顏色轉(zhuǎn)紅，抬高的ST段下降1/2以上為再灌注成功標志，再灌注180 min后腹主動脈取血，并快速摘取心臟用于心肌組織樣本檢測。假手術(shù)組手術(shù)過程與模型組相同，但只穿線不結(jié)扎冠脈。假手術(shù)組：大鼠給予等體積生理鹽水，2次/d，連續(xù)灌服14 d后手術(shù)，只穿線不結(jié)扎冠脈；模型組：開胸結(jié)扎LAD，余同假手術(shù)組；丹參飲低劑量組(5 g/kg生藥量)、丹參飲中劑量組(10 g/kg生藥量)、丹參飲高劑量組(15 g/kg生藥量)，各組均配制成10 ml/kg的藥液，2次/d，連續(xù)灌服14 d后手術(shù)。

1.2.3 心電圖監(jiān)測：詳細記錄MIRI模型大鼠各階段心電圖表現(xiàn)。

1.2.4 CK-MB、LDH及NT-proBNP水平檢測：再灌注3 h后腹主動脈取血，血液標本3000 r/min離心,取上清分裝，置于-20 ℃冰箱冷凍備用，實驗全部結(jié)束后嚴格按照試劑盒操作要求測定LDH、CK-MB和NT-proBNP等生化指標。

1.2.5 心肌梗死面積測定：大鼠心肌梗死面積的測定參照文獻[8]進行，具體操作方法如下。標本采集完成后摘取心臟，以4 ℃生理鹽水充分沖洗后濾紙吸水，分離出完整的左心室后稱定質(zhì)量；將-20 ℃速凍處理后的左心室沿心尖至基底部切為2 mm厚度的切片，切片后置于濃度為1 %的2，3，5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrezolium chloride，2,3,5-TTC)中避光孵育10 min，成功染色后心肌梗死區(qū)域為蒼白色，具有活性的非梗死區(qū)域心肌組織呈暗紅色；將梗死區(qū)與非梗死區(qū)進行分離后分別稱定質(zhì)量。以梗死心肌質(zhì)量與左心室質(zhì)量的比值代表大鼠心肌梗死范圍。

1.2.6 組織病理學觀察：采血后快速摘除心臟，取缺血心肌組織，置于10%甲醛中進行固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片，HE染色后作光學觀察，采集圖像進行分析。

2 結(jié) 果

2.1 MIRI模型大鼠各階段心電圖表現(xiàn) 本研究詳細記錄了整個實驗過程中各組大鼠心電圖表現(xiàn)。大鼠行前降支結(jié)扎后，心電圖表現(xiàn)為ST段呈弓背向上抬高，提示造模成功；45 min后取出聚乙烯管給予前降支再灌注，出現(xiàn)再灌注后室性心律失常，并出現(xiàn)Q波；再灌注180 min后心電圖表現(xiàn)為ST段回落，病理性Q波形成。隨機抽取的1只模型大鼠心電圖表現(xiàn)情況見圖1。

A：造模成功時；B：再灌注時；C：再灌注180 min時

2.2 各組大鼠CK-MB、LDH及NT-proBNP水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清CK-MB、LDH及NT-proBNP水平明顯升高，組間差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)。與模型組比較，丹參飲低劑量組、丹參飲中劑量組、丹參飲高劑量組大鼠血清CK-MB、LDH及NT-proBNP水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)，且丹參飲高劑量組降低程度最大，見表1。

表1 各組大鼠CK-MB、LDH及NT-proBNP水平比較

2.3 各組大鼠心肌梗死情況比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠梗死心肌質(zhì)量、梗死范圍較大，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)。與模型組比較，丹參飲低劑量組、丹參飲中劑量組、丹參飲高劑量組大鼠梗死心肌質(zhì)量、梗死范圍較小，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)；與丹參飲低劑量組比較，丹參飲高劑量組大鼠梗死心肌質(zhì)量、梗死范圍較小，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)。見表2。

表2 各組大鼠心肌梗死情況比較

2.4 各組大鼠心肌組織病理學 對大鼠缺血區(qū)心肌進行HE染色，觀察各組心肌缺血/再灌注損傷后心肌細胞形態(tài)學改變情況。模型組心肌紋理紊亂，心肌細胞正常結(jié)構(gòu)明顯破壞，丹參飲預(yù)處理組的病理表現(xiàn)明顯改善，并隨著丹參飲劑量增加，改善效果越明顯(圖2)。

圖2 各組MIRI大鼠心肌組織(HE染色，×20)

3 討 論

冠脈血運重建時代背景下的急性心肌梗死治療以盡早開通病變血管，及時恢復(fù)冠脈血流為目標，然而血流恢復(fù)后的MIRI進一步增加心肌梗死面積，誘發(fā)惡性心律失常，降低心功能，是心血管研究領(lǐng)域尚未解決的科學問題之一?；A(chǔ)研究表明，MIRI可影響心肌超微結(jié)構(gòu)，導致心肌代謝紊亂、電生理失調(diào)及心肌功能異常[9]。目前，西醫(yī)學應(yīng)對MIRI的主要手段包括缺血預(yù)處理和缺血后處理，均為有創(chuàng)操作，存在進一步破壞冠脈血管床的潛在風險，臨床應(yīng)用受限[10-11]。

目前，醫(yī)學界對MIRI的具體生理病理機制尚不清楚，認為與細胞凋亡、心肌能量代謝障礙、內(nèi)皮細胞功能障礙、氧自由基爆發(fā)、細胞內(nèi)鈣超載、中性粒細胞浸潤等有關(guān)[12-14]。近年來，中醫(yī)藥廣泛應(yīng)用于MIRI防治領(lǐng)域，現(xiàn)代藥理學證實多種中藥單體及中藥復(fù)方可有效減少心肌凋亡、減輕心肌細胞線粒體損傷、調(diào)控自噬過程、調(diào)節(jié)內(nèi)源性一氧化氮表達、抑制炎癥反應(yīng)，多角度發(fā)揮心肌細胞保護作用[15-17]。袁秋貞等[18]研究結(jié)果表明，心肌片能減輕心肌缺血再灌注損傷，抑制心肌細胞凋亡，其機制可能通過激活A(yù)MPK信號通路實現(xiàn)。李基赫等[19]研究結(jié)果顯示，中藥多糖組分可降低血清及缺血再灌注心肌MDA、SOD、GSH-PX含量，增加心肌Na+K+-ATPase含量，對大鼠心肌缺血再灌注氧化應(yīng)激反應(yīng)有一定抑制作用，表明中藥多糖組分對氧化應(yīng)激反應(yīng)有一定抑制。丹參飲出自《時方歌括》，由丹參、檀香、砂仁組成，具有活血祛瘀，行氣止痛的功效[20]，是本科研團隊臨床治療急性心肌梗死最常用的經(jīng)典基礎(chǔ)方劑之一，取得了較滿意的臨床療效。

本研究采用前降支結(jié)扎方法制備大鼠MIRI模型，實驗中可見典型的急性心肌梗死心電圖演變過程，部分大鼠在再灌注階段記錄到典型的室性心動過速表現(xiàn)，充分說明造模成功。本研究結(jié)果顯示，丹參飲預(yù)處理可顯著減低MIRI模型大鼠心肌酶學水平，保護心功能，且高濃度丹參飲保護作用較顯著。在心肌梗死范圍方面，高劑量丹參飲預(yù)處理組大鼠心肌梗死范圍最小，進一步表明該方劑預(yù)處理可保護心肌細胞。對實驗大鼠缺血區(qū)域心肌細胞進行HE染色，從病理學角度直觀說明了丹參飲預(yù)處理保護了MIRI模型大鼠心肌細胞的價值。

綜上所述，丹參飲預(yù)處理可明顯降低MIRI模型大鼠CK-MB、LDH及NT-proBNP水平，縮小梗死面積，具有顯著的心肌細胞保護作用，且存在一定的量效關(guān)系，為臨床防治MIRI提供了新的思路，但其具體作用機制有待進一步研究。