腫瘤出芽與pT1期胃腺癌臨床病理特征的相關(guān)性分析

徐 程，張 響，姬東澤，吳 靚，徐劉洋，張智弘

近年來對腫瘤的分子遺傳學(xué)研究日益精進(jìn)，但組織病理學(xué)形態(tài)在判斷腫瘤性質(zhì)、分化程度及評估患者預(yù)后方面仍有不可替代的作用。多項(xiàng)研究證實(shí)，腫瘤出芽(tumor budding, TB)是結(jié)直腸癌的不良預(yù)后因素，第8版AJCC指南、美國病理學(xué)家協(xié)會(College of American Pathologists, CAP)報告模板也提出，需在常規(guī)病理診斷中，對所有Ⅰ、Ⅱ期結(jié)直腸癌評估TB，評估方法及標(biāo)準(zhǔn)參照2016年國際TB會議共識(International Tumor Budding Consensus Conference, ITBCC)。然而，TB并非結(jié)直腸癌中的特有現(xiàn)象，其普遍存在于各種消化系統(tǒng)惡性腫瘤中，關(guān)于TB在胃癌(尤其是早期胃癌)中的意義尚不明確，本文收集232例pT1期胃癌，分析TB與其臨床病理特征的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料收集2013年1月～2015年1月江蘇省人民醫(yī)院/南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理學(xué)部明確診斷的pT1期胃腺癌(即腫瘤位于黏膜及黏膜下層)根治標(biāo)本合計293例，剔除其中的低黏附性癌61例，最終納入研究的pT1期胃腺癌合計232例，所有病例均具有完整的臨床病理資料，包括患者性別、年齡、腫瘤最大徑、腫瘤分化、腫瘤浸潤層次、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(入組要求取材淋巴結(jié)個數(shù)均在15枚以上)、有無脈管內(nèi)癌栓，所有病例術(shù)前均未行放、化療或其他針對腫瘤的治療。所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm厚切片，由兩名病理醫(yī)師獨(dú)立復(fù)習(xí)所有HE切片。通過電話或門診病歷系統(tǒng)對患者進(jìn)行隨訪，本實(shí)驗(yàn)觀察的預(yù)后指標(biāo)為無進(jìn)展生存時間(progression free survival, PFS)，即患者從手術(shù)日到出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、死亡的生存時間。

1.2 TB評估方法目前胃癌中TB尚無規(guī)范化的評估方法，本實(shí)驗(yàn)基于ITBCC推薦的結(jié)直腸癌TB評估法評估胃癌TB，步驟如下：(1)根據(jù)目鏡的直徑計算該顯微鏡200倍視野的面積(本顯微鏡目鏡直徑22 mm，200倍視野直徑1.10 mm，面積0.95 mm2)。(2)從癌組織的所有HE切片中，選取在腫瘤浸潤前沿TB最豐富的一張切片；在100倍鏡下觀察該切片，尋找TB的熱點(diǎn)區(qū)(至少觀察10個100倍視野)。(3)選定熱點(diǎn)區(qū)后，轉(zhuǎn)到200倍視野，計數(shù)200倍視野下的TB數(shù)量。(4)根據(jù)不同顯微鏡直徑，計算每0.785 mm2的TB數(shù)，即TB數(shù)=不同目鏡實(shí)測TB數(shù)量/標(biāo)化值(注：目鏡直徑20 mm的顯微鏡，200倍視野面積為0.785 mm2，其標(biāo)化值為1，則本實(shí)驗(yàn)選用顯微鏡標(biāo)化值為1.210)。(5)將每0.785 mm2的TB數(shù)<5個定義為低級別TB，每0.785 mm2的TB數(shù)≥5個定義為高級別TB。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。本實(shí)驗(yàn)中患者年齡、腫瘤最大徑以中位數(shù)作為臨界值進(jìn)行分組，TB與胃腺癌臨床病理特征的相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)性檢驗(yàn)，多因素分析采用Logistic回歸，生存分析采用Kaplan-Meier函數(shù)，Log-rank檢驗(yàn)；P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征232例pT1期非低黏附性胃腺癌中，女性59例，男性173例；患者年齡33～86歲，中位年齡62歲；腫瘤最大徑0.3～6 cm，中位值2.0 cm；高分化19例，中分化143例，低分化70例；浸潤層次：黏膜內(nèi)(pT1a)116例，黏膜下(pT1b)116例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移202例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例；無脈管內(nèi)癌栓209例，有脈管內(nèi)癌栓23例。16例患者術(shù)后接受化療(均為有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例)，其余患者術(shù)后均未行化療。

2.2 TB的評估第一次閱片后，66例TB分級不確定，經(jīng)重新切片及討論后再次閱片評估得出最終結(jié)果：232例pT1期非低黏附性胃腺癌中，低級別TB 196例(84.5%)(圖1)，高級別TB 36例(15.5%)(圖2)。

①②

2.3 TB與胃腺癌臨床病理特征的相關(guān)性高級別TB與女性患者(女性vs男性，r=-0.160，P=0.015)、腫瘤低分化(高+中分化vs低分化，r=0.263，P<0.001)、腫瘤浸潤至黏膜下層(黏膜內(nèi)vs黏膜下，r=0.381，P<0.001)、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移vs有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，r=0.403，P<0.001)、有脈管內(nèi)癌栓(無脈管內(nèi)癌栓vs有脈管內(nèi)癌栓，r=0.376，P<0.001)相關(guān)，與患者年齡、腫瘤最大徑無相關(guān)性(表1)。

表1 TB與胃腺癌臨床病理特征的相關(guān)性[n(%)]

2.4 TB與胃腺癌臨床病理特征的多因素分析將性別、腫瘤分化、腫瘤浸潤層次、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有無脈管內(nèi)癌栓納入pT1期胃腺癌TB的多因素分析，結(jié)果顯示：腫瘤浸潤至黏膜下層(OR=17.192，P<0.001)、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(OR=3.976，P=0.011)、有脈管內(nèi)癌栓(OR=3.521，P=0.033)是高級別TB的獨(dú)立危險因素，而性別、腫瘤分化非獨(dú)立危險因素(表2)。

表2 高級別TB(TB≥5)與胃腺癌臨床病理特征的多因素分析

2.5 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與胃腺癌臨床病理特征的相關(guān)性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與女性患者(女性vs男性，r=-0.306，P<0.001)、腫瘤低分化(高+中分化vs低分化，r=0.278，P<0.001)、腫瘤浸潤至黏膜下層(黏膜內(nèi)vs黏膜下，r=0.206，P=0.002)、有脈管內(nèi)癌栓(無脈管內(nèi)癌栓vs有脈管內(nèi)癌栓，r=0.302，P<0.001)、高級別TB(低級別vs高級別，r=0.403，P<0.001)相關(guān)，與患者年齡、腫瘤最大徑無明顯相關(guān)性(表3)。

表3 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與胃腺癌臨床病理特征的相關(guān)性[n(%)]

2.6 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與胃腺癌臨床病理特征的多因素分析將患者性別、腫瘤分化、腫瘤浸潤層次、有無脈管內(nèi)癌栓、TB分級納入pT1期胃腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的多因素分析，結(jié)果顯示：女性(OR=0.138，P<0.001)，腫瘤低分化(OR=2.783，P=0.036)、高級別TB(OR=3.876，P=0.014)是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險因素，浸潤至黏膜下層和有脈管內(nèi)癌栓非獨(dú)立危險因素(表4)。

表4 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與胃腺癌臨床病理特征的多因素分析

2.7 生存分析本組177例患者獲得隨訪資料，隨訪時間7～85個月(中位隨訪時間69個月)，20例患者疾病發(fā)生進(jìn)展(11.3%)，包括16例患者因腫瘤死亡，4例患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移但目前尚存活，157例患者無進(jìn)展生存(88.7%)。生存分析顯示，TB與pT1期胃腺癌患者的無進(jìn)展生存期無明顯相關(guān)性(P>0.05)。

3 討論

TB定義為腫瘤間質(zhì)內(nèi)散在的單個或≤4個成簇的腫瘤細(xì)胞，廣義的TB分為腫瘤周圍出芽(peritumoral budding, PTB)和腫瘤內(nèi)出芽(intratumoral budding, ITB)，PTB是指在腫瘤的浸潤前沿出現(xiàn)的TB，只能在手術(shù)標(biāo)本中評估，ITB是指在腫瘤主體內(nèi)出現(xiàn)的TB，在手術(shù)標(biāo)本、活檢標(biāo)本中均可評估[1]。盡管ITB在腫瘤的預(yù)后評估中有一定的價值，比如部分學(xué)者認(rèn)為ITB與結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[2]，但目前國際上主流的研究認(rèn)為，ITB提示不良預(yù)后的證據(jù)等級不如PTB充分，ITBCC目前尚不建議將ITB納入消化系統(tǒng)腫瘤的組織病理學(xué)評估中。大部分文獻(xiàn)報道的TB(包括本實(shí)驗(yàn))均特指PTB。

TB最早被發(fā)現(xiàn)與結(jié)直腸癌的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)：多個中心的研究均證實(shí)TB是pT1期結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立相關(guān)因素[3-4]，最大樣本量的研究來自2015年日本Kawachi等[5]的研究，806例pT1期結(jié)直腸癌中，有233例存在高級別TB(29%)，25%高級別TB病例發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，僅7%低級別TB病例發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.001)。TB是Ⅱ期結(jié)直腸癌無進(jìn)展生存期和總生存期的獨(dú)立預(yù)后因子。一個納入12項(xiàng)評估TB作為Ⅱ期結(jié)直腸癌預(yù)后因素的研究系統(tǒng)證明，高級別TB是重要的不良預(yù)后因素(P<0.001)，并可以作為病死率的獨(dú)立預(yù)測因子(P<0.001)[6]?；赥B對提示患者預(yù)后的重要價值，結(jié)直腸癌的CAP病理報告模板中，已將TB作為常規(guī)報告內(nèi)容。

除了結(jié)直腸癌，越來越多的研究認(rèn)為TB與胃癌、食管癌、胰腺癌等多種消化系統(tǒng)腫瘤的預(yù)后相關(guān)[3, 7-8]。在本實(shí)驗(yàn)之前，針對胃癌TB的系統(tǒng)性研究主要有4項(xiàng)[9-12]，均認(rèn)為高級別TB的病例具有更高的侵襲性(表5)。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高級別TB與更深的腫瘤浸潤層次、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管內(nèi)癌栓相關(guān)，而這些病理參數(shù)均提示腫瘤的侵襲性和不良轉(zhuǎn)歸，與文獻(xiàn)報道相似。其中TB與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性尤其值得關(guān)注，對于內(nèi)鏡下黏膜剝除術(shù)的早期胃癌標(biāo)本，我們不僅要關(guān)注腫瘤距垂直切緣的距離，還應(yīng)評估TB，從而預(yù)測其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險，成為是否需追加根治手術(shù)的重要依據(jù)。

表5 胃腺癌中TB的分析

Che等[9]、Olsen等[10]、Kemi等[11]在全部胃腺癌中的TB研究均顯示，高級別TB與較短的生存期相關(guān)，僅Gulluoglu等[12]的研究針對pT1期胃腺癌，但未做生存分析。本實(shí)驗(yàn)預(yù)后分析結(jié)果顯示，TB與pT1期胃腺癌患者的無進(jìn)展生存期無顯著相關(guān)性，其原因可能是高級別TB與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，而有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的部分患者術(shù)后接受了化療，改善了預(yù)后，作者猜想，TB可協(xié)同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，成為早期胃癌患者術(shù)后是否需要化療的參考依據(jù)。本組部分病例因失訪，可能干擾了生存分析結(jié)果，故pT1期胃腺癌中TB與預(yù)后的相關(guān)性需加大樣本量進(jìn)行深入探究。

目前胃癌中的TB研究尚不如結(jié)腸癌深入，且無規(guī)范化的TB評估方法，以往的4項(xiàng)研究評估方法也各不相同，導(dǎo)致TB低級別、高級別的分級標(biāo)準(zhǔn)也未統(tǒng)一。本實(shí)驗(yàn)與Kemi等[11]的研究參考了ITBCC推薦的結(jié)直腸癌“TB熱點(diǎn)區(qū)”評估法，即從所有切片中選取1個最熱點(diǎn)區(qū)域，計數(shù)該區(qū)域200倍視野下的TB數(shù)，該方法已形成共識，且相對簡單，不會給診斷工作造成負(fù)擔(dān)，建議推廣到胃癌的TB評估中。ITBCC比較了在HE切片中直接觀察和利用上皮免疫組化標(biāo)記觀察TB，發(fā)現(xiàn)兩種方法對TB的判讀結(jié)果相似，且前者更加方便、經(jīng)濟(jì)，也避免了上皮標(biāo)記在壞死細(xì)胞中出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象，故推薦病理醫(yī)師利用HE切片直接評估TB，但報告結(jié)果完全依賴于觀察者的經(jīng)驗(yàn)，需經(jīng)過統(tǒng)一培訓(xùn)來保證判讀的可重復(fù)性。

本組病例未將低黏附性癌納入其中，因?yàn)镺lsen等[10]和Kemi等[11]的兩項(xiàng)研究均不推薦在低黏附性癌中評估TB，他們認(rèn)為，低黏附性癌以單個散在腫瘤細(xì)胞的形式浸潤胃壁，難以明確何為腫瘤浸潤前緣，故無法準(zhǔn)確評估TB，有學(xué)者認(rèn)為，低黏附性癌可能是高級別TB的一種極端表現(xiàn)形式，即腫瘤完全由出芽的腫瘤細(xì)胞構(gòu)成[3]，也可解釋為何低黏附性癌的侵襲性更強(qiáng)、預(yù)后更差。另外，目前對于其他一些特殊組織學(xué)亞型腺癌中TB的評估經(jīng)驗(yàn)有限，需十分謹(jǐn)慎，如在黏液腺癌中，漂浮在黏液湖里的腫瘤細(xì)胞簇不應(yīng)視為TB；若腫瘤間質(zhì)彌漫性炎細(xì)胞浸潤及促結(jié)締組織反應(yīng)(尤其是在髓樣癌中)，有時很難觀察到其中的TB，此時可通過重新切片或上皮免疫組化標(biāo)記輔助評估；新輔助化療后的標(biāo)本不適合評估TB，故“TB無法評估”，并作出相應(yīng)解釋，在病理診斷中可以接受[1]。

TB與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)相關(guān)[13]：EMT是指上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為梭形間質(zhì)細(xì)胞的過程，是胚胎發(fā)育和傷口愈合所涉及的正常生理機(jī)制，過程中伴隨著上皮細(xì)胞間黏附蛋白的減少、并獲得促進(jìn)細(xì)胞遷移的間葉表型[14]。在出芽的腫瘤細(xì)胞中，與細(xì)胞黏附能力相關(guān)的鈣黏蛋白E-cadherin、claudins、α-catenin、β-catenin等表達(dá)下調(diào)，而誘導(dǎo)EMT過程的重要間葉標(biāo)記ZEB1、ZEB2、β-catenin、vimentin、SMA等顯著上調(diào)[13]。目前研究認(rèn)為，TB模仿了EMT過程，使腫瘤獲得侵襲、轉(zhuǎn)移能力，從而解釋了高級別TB病例更易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、預(yù)后也更差的原因。臨床工作中，可應(yīng)用于證實(shí)TB的免疫標(biāo)志物較少，目前獲得普遍認(rèn)可且特異性較強(qiáng)的是E-cadherin膜陽性水平下調(diào)，β-catenin在腫瘤主體內(nèi)呈細(xì)胞膜、質(zhì)陽性，在浸潤前沿(即出芽的腫瘤細(xì)胞)中呈細(xì)胞核陽性。目前，通過阻斷EMT相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的各種受體(Axl、c-MET等)、酶(COX2、Erk2等)、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(LIV-1等)，研發(fā)出許多相關(guān)抑制劑，在抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移、進(jìn)展方面取得一定的治療效果[15]。而TB與EMT密切相關(guān)，提示EMT相關(guān)抑制劑可成為高級別TB病例的潛在治療靶點(diǎn)。

綜上所述，TB與pT1期非低黏附性胃腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管內(nèi)癌栓、浸潤層次顯著相關(guān)，是腫瘤侵襲性的重要指標(biāo)；TB的評估方法建議采用ITBCC推薦的結(jié)直腸癌“TB熱點(diǎn)區(qū)評估法”；基于其重要的臨床病理價值，建議將其推廣到pT1期胃腺癌的常規(guī)診斷體系中。