天然環(huán)烯醚萜類化合物提取及純化技術(shù)研究新進(jìn)展

謝 玲，張學(xué)俊，陶 菡，賀揚(yáng)潔，張靈麗

(1.貴州大學(xué)貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

0 引言

我國(guó)藥用植物種類繁多，種植面積和分布較廣，是國(guó)家獨(dú)有的種質(zhì)資源。一方面，藥用植物的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生態(tài)效益在農(nóng)業(yè)發(fā)展中占有舉足輕重的地位，另一方面，充分利用藥用植物資源進(jìn)行產(chǎn)品開發(fā)，是打開我國(guó)農(nóng)業(yè)發(fā)展新局面的重要戰(zhàn)略舉措之一。目前，利用藥用植物活性成分開發(fā)的產(chǎn)品，在國(guó)際市場(chǎng)上具有較大的商業(yè)潛力和經(jīng)濟(jì)效益。將農(nóng)業(yè)與醫(yī)藥、食品、化妝品等行業(yè)有效結(jié)合，不僅有利于新產(chǎn)品開發(fā)，擴(kuò)大資源利用，打開市場(chǎng)新格局，還可以實(shí)現(xiàn)“藥用農(nóng)業(yè)”產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型升級(jí)。

藥用植物資源的利用是基于其天然產(chǎn)物的活性功能價(jià)值。環(huán)烯醚萜(Iridoids)是一類重要的次生代謝產(chǎn)物，具有廣泛的生物活性，是用于預(yù)防骨質(zhì)疏松、“三高”、癌癥、帕金森病(PD)等疾病治療發(fā)揮藥效的主要基礎(chǔ)物質(zhì)。目前主要應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)，基于它的抗炎、抗病毒、抗氧化等活性功能，有望在食品、保健品、果蔬保鮮和化妝品等領(lǐng)域應(yīng)用。該類化合物在夾竹桃科、玄參科、茜草科、唇形科、馬鞭草科、龍膽科和木犀科等67種雙子葉植物中普遍存在[1-2]。在進(jìn)行樣品分析檢測(cè)和產(chǎn)品開發(fā)前，往往需要采取必要的手段進(jìn)行提取和純化以消除雜質(zhì)干擾。本文對(duì)環(huán)烯醚萜類化合物的生物酶法(enzyme-assisted extraction，EAE)、表面活性劑輔助提取(surfactant assisted extraction，SAE)、離子液體輔助提取(ionic liquids assisted extraction，ILs)、超聲波輔助提取(ultra-sound-assisted extraction，UAE)、微波輔助提取(microwave-assisted extraction，MAE)、加速溶劑萃取(accelerated solvent extraction，ASE)、加壓液體萃取(pressurized liquid extraction，PLE)、超臨界流體萃取(supercritical fluid extraction，SFE)、逆流分離技術(shù)(countercurrent separation，CCS)、大孔吸附樹脂法和膜分離法等方法進(jìn)行系統(tǒng)闡述，以期為這類物質(zhì)的工業(yè)化提取、純化供以參考，使得相關(guān)藥用植物的開發(fā)利用促進(jìn)“藥用農(nóng)業(yè)”可持續(xù)健康發(fā)展，提高農(nóng)民收入。

1 提取方法

1.1 生物酶提取

鄭陽(yáng)[3]用纖維素酶從杜仲葉中提取杜仲醇，在料液比1∶25 g/mL、酶解溫度30 ℃、pH值7.0、酶用量1.0%、酶解4 h和提取1次時(shí)，杜仲總醇提取率0.235 7%。陳玉甫等[4]使用蛋白酶、果膠酶和纖維素酶分步連續(xù)酶解提取杜仲樹皮中的桃葉珊瑚苷、京尼平苷、京尼平苷酸和綠原酸4種活性成分，所得桃葉珊瑚苷、京尼平苷和京尼平苷酸3種環(huán)烯醚萜的含量分別為22.42、77.89和110.05 μg/g，提取率高于乙醇提取法和水提法。CHEN Gang等[5]加入離子液體輔助酶解從杜仲中提取京尼平，首先將纖維素酶加入到離子液體溶液中，調(diào)節(jié)酸堿度，稱取杜仲皮粉末置于酶-離子液體溶液中攪拌混勻，在液固比19.81 mL/g、纖維素酶濃度5.15 mg/mL、pH值5.0時(shí)，處理樣品140 min，京尼平含量0.64 mg/g。

單一酶解提取時(shí)，水解速度慢，加入某些特定的表面活性劑、離子液體可以增強(qiáng)酶活性。

1.2 表面活性劑輔助提取

GONDA S等[6]用毛細(xì)管電泳-膠束電動(dòng)色譜法從不同提取物中提取桃葉珊瑚苷、梓醇、苯乙醇苷、毛蕊花糖苷和車前草苷，研究了不同電解質(zhì)和表面活性劑類型對(duì)提取效果的影響。最終選擇15 mM四硼酸鈉、20 mM TAPS和250 mM DOC作為提取溶劑時(shí)，具有良好的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，取得了較好的分離效果。LI Fajie等[7]用非離子表面活性劑輔助紅外光譜提取胡黃連苷I和胡黃連苷II，紅外功率200 W，10%非離子表面活性劑聚乙二醇單烷基醚(GX-080)，料液比1∶150，紅外輔助提取4 min，胡黃連苷I和胡黃連苷II的含量分別為6.898 3和39.298 2 mg/g。GUO J等[8]用SDS輔助微波提取杜仲皮中總環(huán)烯醚萜，在SDS濃度2 mg/mL、料液比1∶50、微波功率1 100 W、提取6 min時(shí)，總環(huán)烯醚萜提取率高達(dá)95%～105%。

表面活性劑的使用可有效替代有機(jī)溶劑，一方面緩解了環(huán)境污染嚴(yán)重的問(wèn)題，另一方面可以減小生產(chǎn)成本，提高提取效率。

1.3 離子液體輔助提取

CAO Xiaoji等[9]用離子液體輔助超聲提取法與超高效液相色譜、電噴霧電離四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)合，同時(shí)篩選胡黃連中的環(huán)烯醚萜苷、苯乙醇苷和葫蘆素苷，在最佳工藝為超聲波功率500 W、離子液體[BMIM][BF4]、料液比1∶500 g/mL和超聲30 min時(shí)，胡黃連苷I、胡黃連苷II、6-O-E-阿魏酸梓醇的提取率分別為2.84%、3.57%和2.20%，提取率比熱回流提取法高2～3倍。DU Kunze等[10]采用離子液體渦旋強(qiáng)化基質(zhì)固相分散法，通過(guò)對(duì)離子液體類型、吸附劑類型、樣品與吸附劑比例、離子液體濃度和體積、研磨時(shí)間和渦流時(shí)間等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，最后選用SiO2作為分散吸附劑，以濃度為6 mL 175 mM的[Domim]HSO4作為洗脫劑，山茱萸粉末中莫諾苷、狼芽菜苷、馬錢苷和山茱萸苷的含量分別為0.59%～0.93%、0.048%～0.056%、0.036%～0.470%和0.65%～0.74%，山茱萸粗品中的含量分別為1.57%～1.61%、0.061%～0.078%、0.54%～0.64%和0.16%～0.19%。

利用離子液體水溶液的兩親性，使其形成兩相體系可用作多功能分離板，作用于植物基質(zhì)時(shí)與目標(biāo)分析物形成離子-偶極、π-π共軛等相互作用，可以促進(jìn)目標(biāo)組分從基質(zhì)中剝離[11]。

1.4 超聲波輔助提取

超聲波作用于水溶液中產(chǎn)生空化作用，撕裂水分子團(tuán)形成大量空腔微氣泡，在植物組織縫隙中形成超聲微射流，使植物組織表面剝落和破裂，進(jìn)一步擴(kuò)大溶劑與基質(zhì)的接觸表面積，使溶劑滲透到植物細(xì)胞中加快分析物溶出[12]。

1.5 微波輔助提取

CHENG Zhenyu等[16]用微波輔助提取法從龍膽中提取龍膽苦苷，提取溶劑為21.71% K2HPO4和40.72%乙醇，溫度80 ℃、微波功率806 W、料液比1∶11 g/mL和微波處理31 s時(shí)，龍膽苦苷含量65.32mg/g。WAKTE P等[17]用該方法從胡黃連中提取胡黃連苷I、胡黃連苷II，以水為提取溶劑，料液比1∶9 g/mL、溫度60 ℃和提取60 s時(shí)，其含量分別為41.23和6.12 mg/g。傅亞等[18]以玄參為原料，用微波輔助提取哈巴苷和哈巴俄苷，以水為提取劑，料液比1∶20 g/mL、微波功率600 W、溫度50 ℃和提取30 min時(shí)，總提取率1.117 2 %。WANG Xin等[19]用該方法從生地黃中提取益母草苷、梓醇，在最佳工藝參數(shù)為甲醇體積分?jǐn)?shù)60%、溫度60 ℃、料液比1∶50 g/mL和提取10 min時(shí)，益母草苷、梓醇的含量分別為0.86和6.87 mg/g。

MAE不僅可以最大程度地提取目標(biāo)化合物，還可以在短時(shí)間內(nèi)快速均勻加熱，以最大程度地減少目標(biāo)化合物在高溫和空氣中長(zhǎng)時(shí)間暴露導(dǎo)致的降解[20]。

1.6 加速溶劑萃取

朱君燕等[21]采用加壓溶劑萃取法(PSE)提取山茱萸中環(huán)烯醚萜苷，在90%乙醇、壓力9 000 kPa、溫度60 ℃和保壓20 min時(shí)，總環(huán)烯醚萜苷提取率40.46 mg/g，高于超聲提取(39.95 mg/g)和回流提取(37.83 mg/g)。PSE法與超聲波法的提取率雖然相差不大，但PSE通過(guò)試驗(yàn)優(yōu)化及與其他下游技術(shù)聯(lián)用可以有效增加目標(biāo)分析物提取量，且更易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化；與索式提取相比，雖然兩者提取率相差小，但索式提取法用時(shí)是PSE法的8～12倍。李婷等[22]采用在線加壓溶劑提取-超高效液相色譜-離子肼-飛行時(shí)間質(zhì)譜(Online PLE-UHPLC-IT-TOF-MS)聯(lián)用技術(shù)實(shí)現(xiàn)了草蓯蓉化學(xué)成分的快速分析，樣品提取池由空預(yù)柱芯和正相硅膠組成，柱芯用濾膜密封后將其裝入預(yù)柱套內(nèi)，通過(guò)0.1%甲酸水溶液自動(dòng)觸發(fā)提取，提取溫度70℃、提取壓力約25 MPa、提取3 min時(shí)，鑒定了10個(gè)苯乙醇苷類、14個(gè)環(huán)烯醚萜苷類及21個(gè)苯丙醇苷類化合物。與UAE相比，該方法提取的樣品色譜峰響應(yīng)值整體高于UAE。

PSE與常溫常壓下的溶劑提取技術(shù)相比，可以大大地提高提取效率和性能，主要在于高溫高壓下可以獲得良好的溶解度和傳質(zhì)效果。

1.7 超臨界流體萃取

PATIL A A等[23]用超臨界CO2萃取法從胡黃連中提取胡黃連苷I和胡黃連苷II，萃取壓力30 MPa、溫度40 ℃和助溶劑濃度10%時(shí)，胡黃連苷I和胡黃連苷II含量分別為32.50±1.13和9.72±0.38 mg/g。LI Hui等[24]以杜仲種子為原料，比較超臨界CO2萃取和索式提取法對(duì)桃葉珊瑚苷提取效果的影響，萃取助溶劑為水-乙醇混合物(1∶3，v/v)，料液比1∶6 g/mL、萃取壓力26 MPa、提取溫度55℃、分離溫度30 ℃和CO2流速20 L/h時(shí)，提取100 g物料用時(shí)2 h，桃葉珊瑚苷提取率1.921%，而索式提取法提取10 g物料用時(shí)3 h，桃葉珊瑚苷提取率1.606%，超臨界CO2萃取法效果更好，目標(biāo)化合物收率和能耗均低于索式提取法。

該方法集萃取和富集于一體，超臨界流體先選擇性地將極性、分子量和沸點(diǎn)不同的組分萃取后，通過(guò)改變壓力和溫度使分析物析出，從而實(shí)現(xiàn)分離純化。

2 分離純化方法

2.1 逆流分離技術(shù)

WANG Yarong等[25]用逆流分離法從梔子中提取環(huán)烯醚萜苷和藏紅花酸衍生物，先將樣品用HPD-100柱層析分離后，使用不同的溶劑體系進(jìn)行分離純化，選擇正丁醇-乙醇-水(10∶1∶10，v/v)從餾分A中純化梔子苷、6β-羥基-京尼平苷和京尼平苷酸；乙酸乙酯-正丁醇-水(2∶1.5∶3，v/v)體系用于從餾分B中分離京尼平苷；己烷-乙酸乙酯-正丁醇-水(1∶2∶1∶5，v/v)用于從餾分C中純化藏紅花苷1、藏紅花苷2、藏紅花苷3和藏紅花苷4，流速8 mL/min，轉(zhuǎn)速600 r/min，其純度分別為91.7%、93.4%、92.5%、98.2%、94.1%、96.3%、94.1%和98.9%。根據(jù)目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)和基質(zhì)的復(fù)雜性，向正丁醇-水體系中加入非極性或極性溶劑改變?nèi)軇w系的極性范圍。CHEN Bao等[26]以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶3∶1∶3，v/v)作為溶劑體系，在分離速度800 r/min和流速5 mL/min的條件下，從龍膽草根提取物中純化三氟氯苷，其純度98.9%。為了優(yōu)化離子化合物的分配或降低溶劑系統(tǒng)的乳化作用，尤其是樣品溶液中含有酸性雜質(zhì)時(shí)，可以加入少量有機(jī)酸，以縮短雙相溶劑系統(tǒng)沉降時(shí)間，提高固定相保留率，改善分離度。

在任何逆流分離技術(shù)中，最關(guān)鍵是溶劑體系的選擇。分配系數(shù)值(K)較小時(shí)峰分離度差，而K值較大時(shí)會(huì)導(dǎo)致過(guò)度的譜帶展寬。因此，選擇合適的溶劑體系可以提供適宜K值，使其達(dá)到“最佳點(diǎn)”以獲得最佳的分離效果。

2.2 大孔吸附樹脂法

張瑜等[27]考察了D-101、H-103、NKA-II、ME-1、ME-2、XDA-1、YWD03D、YWD07D和YWD09D共9種對(duì)總環(huán)烯醚萜苷比吸附量較大的樹脂對(duì)金銀花環(huán)烯醚萜苷類成分的分離純化效果，發(fā)現(xiàn)H-103型大孔樹脂的吸附和洗脫能力較好，用30%乙醇以2.0 BV/h的流速洗脫后，總環(huán)烯醚萜苷的洗脫率達(dá)90.0%。WANG Lu等[28]用AB-8大孔吸附樹脂法和高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)與離子遷移譜技術(shù)結(jié)合，從梔子提取物中分離得到了環(huán)烯醚萜類苷等71種化合物。蔣麗娟等[29]用SP825大孔吸附樹脂結(jié)合硅膠柱色譜法分離純化玄參哈巴苷，其純度達(dá)98%以上。沈燚等[30]篩查了AB-8、ADS-17、D101、HPD400、HPD600、HP20、S-8、SP850、XDA-1和XDA-16等極性和非極性樹脂對(duì)巴戟天環(huán)烯醚萜苷類成分(MOIG)的吸附、解吸附作用，結(jié)果表明，XDA-1型大孔樹脂效果最佳，其含量達(dá)54%以上。蘇婭等[31]以30%乙醇作為洗脫劑，用D101型大孔樹脂純化肉蓯蓉毛蕊花糖苷，其含量為25.1%。

該方法在天然產(chǎn)物分離純化中較為常用，經(jīng)大孔樹脂處理后不僅可以通過(guò)減少提取物中的雜質(zhì)來(lái)提高制劑的內(nèi)在質(zhì)量，還可以降低產(chǎn)品的吸濕性，增強(qiáng)提取液穩(wěn)定性，此外，還能去除重金屬、農(nóng)藥殘留等有害成分，從而提高制劑的安全性。

2.3 膜分離法

膜分離中常用的膜分離技術(shù)包括反滲透(RO)、超濾(UF)、電滲析(ED)、納濾(NF)、膜蒸餾(MD)和滲透汽化(PV)[32]。郭立瑋等[33]用超濾膜法考察生物堿和環(huán)烯醚萜類物質(zhì)的透過(guò)率及其定量構(gòu)效關(guān)系，結(jié)果表明，梔子苷等4種環(huán)烯醚萜類化合物的透過(guò)率<50%，可能是因?yàn)榱弦航M分之間存在透過(guò)競(jìng)爭(zhēng)。在膜分離過(guò)程中，梔子苷這類小分子物質(zhì)易被大分子包裹而被截留。徐益清等[34]以復(fù)方板藍(lán)根水提液為研究對(duì)象，選用200和50 nm孔徑陶瓷膜分離哈巴俄苷、甘草苷等6種有效成分，平均遷移率分別為85%、83%。宋逍等[35]用膜分離法純化穿山龍薯蕷皂苷，最佳工藝參數(shù)為料液濃度2 g/L、過(guò)膜溫度30 ℃和過(guò)膜壓力0.8 MPa，其平均轉(zhuǎn)移率44.88%。

盡管膜分離法具有諸多優(yōu)點(diǎn)，但仍存在以下問(wèn)題。膜污染導(dǎo)致通量下降，膜的清洗和再生是應(yīng)用過(guò)程的關(guān)鍵。膜材質(zhì)對(duì)提取液中某些成分的吸附，導(dǎo)致轉(zhuǎn)移率下降。由于提取液組分體系復(fù)雜，淀粉、蛋白質(zhì)和果膠等高分子物質(zhì)與小分子有效組分以膠體或水合物的狀態(tài)存在，甚至被大分子物質(zhì)包裹，在膜分離過(guò)程中產(chǎn)生空間位阻，導(dǎo)致目標(biāo)化合物透過(guò)率低。

3 各方法優(yōu)缺點(diǎn)及其他方法

對(duì)以上各方法的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行歸納總結(jié)，以期為環(huán)烯醚萜類化合物的提取及純化方法選擇提供精準(zhǔn)參考，結(jié)果如表1所示。

表1 各方法優(yōu)缺點(diǎn)比較Tab.1 Comparison of advantages and disadvantages of these methods

除以上提取及純化方法外，如分子印跡固相萃取技術(shù)(MISPE)、硅膠柱色譜法和半制備色譜技術(shù)等方法也可用于分離環(huán)烯醚萜類化合物。CHEN Lizong等[36]采用分子印跡固相萃取技術(shù)分離純化梔子苷、京尼平苷酸等5種環(huán)烯醚萜苷(IGs)，以京尼平苷為模板，α-1-烯丙基-2-N-乙酰氨基葡萄糖(NAP)作為新型水溶性功能單體，制備了對(duì)環(huán)烯醚萜苷具有特異分子識(shí)別能力的親水性分子印跡聚合物。萃取分離前將5.0 g MIP裝入固相萃取柱中，梔子提取物以20.0 mL/min的流速加載到MISPE上，乙酸乙酯/乙醚(3.0 mL，pH值8.5)以18.0 mL/min的流速洗脫，采用HPLC-DAD進(jìn)行檢測(cè)分析，所得5種環(huán)烯醚萜類化合物(IGs)的純度均>98%。該方法分子印跡聚合物的制備，以及確定最佳比例的模板/功能單體、交聯(lián)劑/功能單體的過(guò)程復(fù)雜且耗時(shí)。SAIDI I等[37]用硅膠柱色譜結(jié)合制備型HPLC從垂花琴木的花中分離得到了一種新的環(huán)烯醚萜苷(Spinomannoside)。

4 結(jié)束語(yǔ)

從環(huán)烯醚萜類化合物提取及純化方法的發(fā)展進(jìn)程上看，單元操作有時(shí)不能滿足需求，需要采用多種方法聯(lián)用技術(shù)。通過(guò)使用力、聲、微波和電場(chǎng)等多能量場(chǎng)來(lái)提高傳質(zhì)速率的文獻(xiàn)報(bào)道日漸增多，可以有效縮短樣品制備的時(shí)間，如微波-熱壓場(chǎng)，超聲強(qiáng)化微波輔助提取和ASE等。另一方面，通過(guò)除雜、分離、分級(jí)和富集一體化戰(zhàn)略技術(shù)可以替代傳統(tǒng)方法中的多步驟單元操作，更省時(shí)，更易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，且能有效避免熱不穩(wěn)定性組分的降解損失，如SFE、膜分離法。目前，很多提取方法仍然停留在實(shí)驗(yàn)室階段，需要不斷完善提取方案，朝著適應(yīng)規(guī)模化生產(chǎn)的方向發(fā)展，以最大限度提高產(chǎn)品的附加值。