強(qiáng)氧化劑脫黑色素對(duì)免疫組化染色影響的評(píng)估

韓 雪，宋國(guó)新，唐錦玲，張煒明

黑色素瘤是臨床上較為常見(jiàn)的皮膚黏膜和色素膜惡性腫瘤，也是發(fā)病率增長(zhǎng)最快的惡性腫瘤之一[1]。免疫組化染色是黑色素瘤病理學(xué)診斷常用的檢查方法。富含黑色素的瘤組織行免疫組化染色時(shí)，組織中沉積的大量黑色素與免疫組化陽(yáng)性所顯示的DAB棕黃色顆?；ハ喔蓴_，影響結(jié)果判讀[2]。因此，這一類組織染色前通常需要進(jìn)行氧化脫黑色素處理。本實(shí)驗(yàn)在實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)強(qiáng)氧化劑處理切片不僅會(huì)造成組織脫片，還易破壞組織內(nèi)抗原，造成假陰性結(jié)果。本文采用3組不同染色法評(píng)估富含黑色素的黑色素瘤組織中常規(guī)檢測(cè)的4種抗原受氧化脫黑色素的影響程度，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料收集2016～2018年南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科存檔的黑色素瘤標(biāo)本28例，每例均重新切片，經(jīng)HE染色證實(shí)組織內(nèi)含有大量棕黑色色素顆粒。選取HMB-45、S-100、Melan-A、Ki-67 4種抗體作為測(cè)試抗體。實(shí)驗(yàn)使用的一抗、檸檬酸抗原修復(fù)液(pH 6.0)、鼠兔通用型MaxVision二抗、DAB顯色試劑盒、AEC顯色試劑盒均購(gòu)自福州邁新公司。脫黑色素采用高錳酸鉀/草酸法：0.5%高錳酸鉀液，2%草酸液均為科室自配。

1.2 方法將組織連續(xù)切片14張，分為3組：(1)第1組切片不經(jīng)氧化脫黑色素處理，直接行HE染色和常規(guī)免疫組化檢測(cè)，DAB顯色。(2)第2組切片經(jīng)抗原修復(fù)后采用高錳酸鉀法氧化脫黑色素，再行HE染色和常規(guī)免疫組化檢測(cè)，經(jīng)DAB顯色。脫黑色素方法如下：組織切片水洗，根據(jù)切片中黑色素量的多少，用強(qiáng)氧化劑高錳酸鉀液滴染5～30 min，蒸餾水沖洗；滴加2%草酸，鏡下觀察無(wú)色后流水沖洗，記錄氧化劑氧化時(shí)間。(3)第3組切片不經(jīng)氧化脫黑色素處理，直接行常規(guī)免疫組化檢測(cè)，AEC顯色。

2 結(jié)果

2.1 脫黑色素后免疫組化染色抗原表達(dá)直接行HE染色的切片鏡下可見(jiàn)組織中含有大量的棕褐色顆粒(圖1)，脫黑色素后行HE染色，發(fā)現(xiàn)這些棕褐色顆粒消失，證實(shí)這些色素顆粒為黑色素。第1組切片的免疫組化染色正常，無(wú)脫片現(xiàn)象發(fā)生，DAB顯色的陽(yáng)性結(jié)果呈棕色，與褐色的內(nèi)源性黑色素相互干擾，難以準(zhǔn)確判讀(圖2)。第2組切片內(nèi)均無(wú)黑色素沉著(圖3)，經(jīng)兩位高年資診斷醫(yī)師閱片，與第3組相比，HMB-45、S-100、Melan-A、Ki-67總表達(dá)減弱/假陰性率分別有60%(15/25)、16%(4/25)、88%(22/25)和24%(6/25)(表1)，其中Melan-A表達(dá)受氧化脫黑色素影響程度最高，22例表達(dá)減弱甚至陰性，HMB-45次之，25例Ki-67均出現(xiàn)不同程度背景著色。脫黑色素后行免疫組化染色的28例組織中，13例部分脫片，合計(jì)21張切片有不同程度的掉片，其中3例完全脫片無(wú)法繼續(xù)進(jìn)行閱片故不納入后續(xù)統(tǒng)計(jì)。第3組切片AEC紅色顯色與黑色素區(qū)別明顯，與背景反差強(qiáng)，便于鏡下觀察(圖4)。

①②③④

表1 氧化脫黑色素對(duì)抗原表達(dá)的影響(n=25)

2.2 不同脫黑色素時(shí)間與抗原表達(dá)受影響的關(guān)系25例組織按高錳酸鉀氧化時(shí)間分為5 min組7例、6～15 min組13例和16～30 min組5例，各組切片4種抗原表達(dá)減弱/假陰性數(shù)及其所占本組的比例見(jiàn)表2，4種抗原受脫黑色素時(shí)間影響程度不一，16～30 min組受影響比例最高，6～15 min組受影響次之，5 min組受影響比例最低。大部分富含黑色素的組織經(jīng)6～15 min高錳酸鉀氧化后，黑色素可被有效脫掉。

表2 不同脫黑色素時(shí)間組抗原表達(dá)減弱/假陰性例數(shù)[n(%)]

3 討論

黑色素是由黑色素母細(xì)胞產(chǎn)生的一種生物性色素顆粒，正常表達(dá)于人體表皮、虹膜、睫狀體和脈絡(luò)膜、腦膜和神經(jīng)節(jié)等處，在常規(guī)HE染色中通常呈黃褐色或棕褐色[3]。組織切片中存在大量黑色素顆粒時(shí)，會(huì)掩蓋細(xì)胞的結(jié)構(gòu)及形態(tài)，影響鏡下觀察和疾病診斷，從而需要進(jìn)行脫黑色素處理，尤其在行免疫組化染色時(shí)，常規(guī)的DAB棕色顯色極易受黑色素干擾[2]。黑色素是一種不含鐵而含硫的色素，性質(zhì)穩(wěn)定，完全不溶于水及有機(jī)溶劑，常規(guī)組織經(jīng)固定、脫水、透明、浸蠟后也不會(huì)丟失黑色素。目前對(duì)組織中內(nèi)源性黑色素的脫黑色素試劑以氧化劑類為主，如高錳酸鉀等，利用氧化劑的氧化及漂白作用，打開(kāi)黑色素的酚環(huán)，使之脫色[4]。現(xiàn)行使用較多的高錳酸鉀強(qiáng)氧化劑脫黑色素法脫黑色素效果好，時(shí)間短，但容易掉片，既往的研究多專注于試劑濃度、脫黑色素時(shí)間的優(yōu)化上，較少關(guān)注脫黑色素過(guò)程中強(qiáng)氧化劑對(duì)組織切片中抗原的破壞。

作者在實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，部分組織經(jīng)過(guò)脫黑色素處理后行常規(guī)免疫組化檢測(cè)時(shí)會(huì)出現(xiàn)抗原表達(dá)減弱甚至假陰性的現(xiàn)象，且假陰性的出現(xiàn)率與氧化劑脫黑色素時(shí)間的長(zhǎng)短相關(guān)，即組織中含有的黑色素越多，需要脫黑色素的時(shí)間越長(zhǎng)，對(duì)抗原的影響亦越大。同時(shí)氧化劑對(duì)抗原的影響具有選擇性[5]，即相同的氧化脫黑色素時(shí)間對(duì)不同抗原的影響程度不一致。在本組實(shí)驗(yàn)中有25例黑色素瘤組織的4種常用診斷抗體均出現(xiàn)不同程度的抗原表達(dá)減弱/假陰性反應(yīng)，Melan-A表達(dá)受氧化脫黑色素影響程度最高，HMB-45次之。隨著氧化劑脫黑色素時(shí)間的延長(zhǎng)，還會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)及結(jié)構(gòu)的破壞，影響了抗原定位的準(zhǔn)確性以及抗體與之反應(yīng)的敏感性。

DAB顯色劑是免疫組化染色中最常用的顯色劑，顯色保存長(zhǎng)久不褪色是其最大優(yōu)點(diǎn)，但在富含黑色素的黑色素瘤組織中，黑色素顆粒干擾DAB棕黃色陽(yáng)性顆粒，影響鏡下觀察。氧化脫黑色素雖能脫去組織中的黑色素，但對(duì)組織中的抗原產(chǎn)生影響，甚至影響判讀結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此，在富含黑色素的腫瘤組織行免疫組化檢測(cè)時(shí)可采用AEC顯色劑替代DAB顯色劑，取消了氧化脫黑色素環(huán)節(jié)，既避免了脫黑色素過(guò)程中強(qiáng)氧化劑對(duì)組織的損傷，又簡(jiǎn)化了染色流程，且能取得良好的染色效果。此外，劉興華等[6]在免疫組化DAB顯色后使用H2O2去黑色素也取得較好的效果，陽(yáng)性定位準(zhǔn)確，表達(dá)清晰，提高了診斷的準(zhǔn)確率。在日常工作中，仍需不斷摸索、不斷創(chuàng)新，尋找操作更加簡(jiǎn)便、免疫組化結(jié)果更加優(yōu)良的脫黑色素方法。