胃癌組織中腺苷酸激酶4和HIF-1α的表達(dá)及其臨床意義

夏 林，王勁松

胃癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，近年來隨著胃鏡技術(shù)的發(fā)展，胃癌的早期發(fā)現(xiàn)和診斷已有所提高，但晚期胃癌的發(fā)病率仍然較高。晚期胃癌的治療主要是手術(shù)結(jié)合化療及靶向治療，但患者術(shù)后5年生存率較低，主要原因是腫瘤細(xì)胞發(fā)生了侵襲、轉(zhuǎn)移。因此尋找和識別胃癌進(jìn)展過程中參與的基因?qū)τ诎l(fā)現(xiàn)新的胃癌預(yù)后標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)具有重要意義。腺苷酸激酶(adenylate kinase, AK)是一種豐富的核苷酸磷酸轉(zhuǎn)移酶，其主要作用是通過將1個ATP或GTP分子中的1個磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到AMP上，催化產(chǎn)生2個ADP分子，從而平衡細(xì)胞腺嘌呤核苷酸組成以維持能量穩(wěn)態(tài)[1]。AK4是AK家族的成員之一，最近研究發(fā)現(xiàn)肺腺癌中AK4陽性提示肺癌患者預(yù)后差，其可促進(jìn)肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[2]。AK4在胃癌中的研究尚未見文獻(xiàn)報(bào)道，本文應(yīng)用免疫組化EnVision法檢測胃癌組織中AK4和低氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)的表達(dá)，旨在探討AK4在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及其與HIF-1α的關(guān)系，為胃癌的治療尋找新的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2015年1月～2017年12月江蘇省揚(yáng)中市人民醫(yī)院存檔的手術(shù)切除胃癌組織79例，其中男性49例，女性30例，患者年齡43～86歲，平均66.5歲，中位年齡67歲。所有患者術(shù)前均未行化療或放療，術(shù)后均有完整的病理診斷。79例胃癌分化程度：高分化6例，中分化37例，低分化36例；Lauren分型：腸型55例，彌漫型24例；腫瘤侵及肌層24例，侵及漿膜下及漿膜外者55例；有淋巴血管侵犯者33例，無淋巴血管侵犯者46例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者44例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者35例；pTNM分期中，Ⅰ期20例，Ⅱ期25例，Ⅲ期34例。取距離腫瘤>5 cm的癌旁正常胃黏膜組織作為正常對照。

1.2 試劑與方法鼠抗人AK4單克隆抗體(OTI3B1，LSbio公司，稀釋比1 ∶150)購自珠海泉輝公司；兔抗人HIF-1α單克隆抗體(EP118，稀釋比1 ∶100)與EnVision法檢測試劑盒均購自北京中杉金橋生物公司。所有手術(shù)標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片3張，分別行HE染色和免疫組化染色。免疫組化染色采用EnVision法，切片梯度乙醇脫蠟和水化后，高壓鍋高溫高壓進(jìn)行抗原修復(fù)，然后滴加一抗，4 ℃冰箱內(nèi)孵育過夜，次日依次滴加二抗，DAB顯色，鏡下控制反應(yīng)時間，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封固。用已知肺癌陽性組織作為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3 結(jié)果判斷AK4陽性定位于細(xì)胞質(zhì)，呈顆粒狀，HIF-1α陽性定位于細(xì)胞質(zhì)。結(jié)果判斷由兩名病理醫(yī)師采用雙盲法判讀，結(jié)果不一致者在多人共攬顯微鏡下達(dá)成意見一致。結(jié)果判斷依據(jù)文獻(xiàn)[3]，先根據(jù)染色強(qiáng)度分為：無染色為(-)，弱陽性為(1+)，中等陽性為(2+)，強(qiáng)陽性為(3+)；然后根據(jù)陽性細(xì)胞百分比為25%進(jìn)一步分為2組，AK4和HIF-1α高表達(dá)定義為陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度為(2+)或(3+)，且陽性細(xì)胞比例>25%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，AK4和HIF-1α表達(dá)與胃癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)及列聯(lián)系數(shù)進(jìn)行分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌及癌旁組織中AK4和HIF-1α的表達(dá)AK4陽性信號為顆粒狀胞質(zhì)陽性(圖1、2)，HIF-1α陽性信號為胞質(zhì)伴或不伴胞膜陽性(圖3、4)。79例胃癌組織中AK4高表達(dá)率為73.4%(58/79)，高于癌旁正常組織(25.3%，20/79)，兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=36.563，P<0.01)。胃癌組織中HIF-1α的高表達(dá)率為69.6%(55/79)，高于癌旁正常組織(16.5%，13/79)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=45.541，P<0.01)。

①②③④

2.2 胃癌組織中AK4和HIF-1α高表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系胃癌組織中AK4高表達(dá)率與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管侵犯和臨床分期密切相關(guān)，淋巴結(jié)陽性的胃癌組織AK4高表達(dá)率明顯高于淋巴結(jié)陰性的胃癌組織，伴有脈管侵犯的胃癌組織中AK4高表達(dá)率高于無脈管侵犯者，臨床分期Ⅲ+Ⅳ期胃癌組織AK4高表達(dá)率明顯高于Ⅰ+Ⅱ期胃癌，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05，表1)。HIF-1α在胃癌組織中的表達(dá)與腫瘤Lauren分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期有關(guān)(P<0.05)，與患者性別、年齡、分化程度、浸潤深度和脈管侵犯等無關(guān)(P>0.05，表1)。

表1 胃癌組織中AK4和HIF-1α高表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系

2.3 胃癌組織中AK4和HIF-1α表達(dá)的相關(guān)性統(tǒng)計(jì)分析顯示，胃癌組織中AK4和HIF-1α表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.05，表2)。

表2 胃癌組織中AK4和HIF-1α表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

近年來隨著內(nèi)窺鏡技術(shù)的進(jìn)展，早期胃癌的檢出率有所提高，且患者預(yù)后較好，但晚期胃癌患者目前尚缺乏有效的治療方法，預(yù)后仍較差。研究發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展不僅涉及到原癌基因的激活和抑癌基因的失活，還涉及到能量代謝相關(guān)的基因。AK是生物活細(xì)胞中參與高能量磷酸化轉(zhuǎn)移反應(yīng)的一種關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶，在細(xì)胞的能量代謝中發(fā)揮重要作用[4]。目前研究發(fā)現(xiàn)AK有9種，不同類型AK在細(xì)胞內(nèi)的定位不同，其中AK4定位于線粒體基質(zhì)中[5]。位于線粒體基質(zhì)中的AK4已被證明作為一種應(yīng)激反應(yīng)蛋白與線粒體ADP/ATP轉(zhuǎn)位酶物理性結(jié)合以維持細(xì)胞存活[6]。有研究顯示，沉默AK4表達(dá)可使細(xì)胞ATP水平提高到25%，同時增加ADP/ATP比例，活化AMPK信號，從而參與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[7]。

本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化法分析了胃癌及其癌旁正常組織中AK4的表達(dá)，結(jié)果顯示AK4在癌組織中的高表達(dá)率明顯高于癌旁正常組織，且胃癌組織中AK4高表達(dá)率與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管侵犯和臨床分期密切相關(guān)，提示AK4不僅可能參與了胃癌的發(fā)生，而且可能在胃癌的侵襲、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。盡管AK4表達(dá)與胃癌的相關(guān)性國內(nèi)外尚未見文獻(xiàn)報(bào)道，但AK4在其他一些惡性腫瘤中的表達(dá)已有相關(guān)研究。Jan等[2]采用微陣列研究發(fā)現(xiàn)AK4在肺腺癌組織中表達(dá)上調(diào)，且AK4高表達(dá)與腫瘤分期晚、疾病復(fù)發(fā)和預(yù)后差有關(guān)，提示AK4促進(jìn)了肺腺癌的惡性進(jìn)展。龐亮等[8]研究了85例肌肉浸潤性膀胱癌及對應(yīng)癌旁組織中AK4的表達(dá)，結(jié)果顯示AK4在癌組織中高表達(dá)，在癌旁組織中無表達(dá)，進(jìn)一步分析膀胱癌組織中AK4表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果顯示AK4高表達(dá)與膀胱癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和脈管內(nèi)瘤栓密切相關(guān)，生存分析顯示膀胱癌中AK4高表達(dá)患者的生存時間明顯低于低表達(dá)者。李辰運(yùn)等[9]研究發(fā)現(xiàn)，胰腺癌組織中AK4的表達(dá)高于對應(yīng)癌旁組織，且AK4表達(dá)與胰腺癌腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)侵犯和脈管內(nèi)瘤栓相關(guān)。綜合文獻(xiàn)報(bào)道與本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提示AK4高表達(dá)可能參與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。

缺氧是實(shí)體性惡性腫瘤的重要特征。研究發(fā)現(xiàn)低氧環(huán)境可增強(qiáng)癌細(xì)胞的侵襲能力，增加腫瘤細(xì)胞對放、化療的抵抗，使腫瘤細(xì)胞更易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移。HIF-1α是目前發(fā)現(xiàn)的一種介導(dǎo)細(xì)胞低氧反應(yīng)中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄抑制因子，其在常氧狀態(tài)下容易被細(xì)胞內(nèi)蛋白酶體系泛素化降解，缺氧時在細(xì)胞內(nèi)聚集，通過正性調(diào)節(jié)細(xì)胞生存、增加新生血管數(shù)量及腫瘤細(xì)胞糖酵解，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[10]。研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α在多種腫瘤中均過表達(dá)，朱園園等[11]研究發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜腺癌中HIF-1α表達(dá)與腫瘤臨床分期、組織學(xué)分級、肌層浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。在胃癌研究中，倪小晴等[12]研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α在胃癌組織中的表達(dá)高于正常組織，且HIF-1α表達(dá)與胃癌分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期相關(guān)。崔立娟等[13]研究發(fā)現(xiàn)腫瘤直徑≥3 cm、中低分化腺癌、Ⅲ+Ⅳ期及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織高表達(dá)HIF-1α。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，胃癌組織中HIF-1α的表達(dá)高于癌旁正常組織，且與胃癌Lauren分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期有關(guān)，與患者性別、年齡、分化程度、浸潤深度和脈管侵犯等無關(guān)，與文獻(xiàn)報(bào)道相符[14]。提示HIF-1α參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展，并可作為預(yù)測胃癌侵襲性生物性行為的一種標(biāo)志物。

Jan等[3]研究發(fā)現(xiàn)肺癌組織中AK4和HIF-1α表達(dá)呈正相關(guān)，且兩者結(jié)合可預(yù)測肺癌患者更差的存活率，同時分子生物學(xué)研究亦發(fā)現(xiàn)AK4過表達(dá)可通過增加細(xì)胞內(nèi)ROS水平來提高HIF-1α表達(dá)，隨后在低氧條件下誘導(dǎo)腫瘤上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化而促進(jìn)肺癌的進(jìn)展。本實(shí)驗(yàn)分析了胃癌組織中AK4和HIF-1α的相互關(guān)系，結(jié)果顯示兩者在胃癌中的表達(dá)呈正相關(guān)，提示AK4可能通過調(diào)控HIF-1α而促進(jìn)胃癌的發(fā)生、發(fā)展，但具體的機(jī)制尚需要更進(jìn)一步進(jìn)行研究。

總之，本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AK4可能通過調(diào)控HIF-1α參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展，檢測胃癌組織中AK4和HIF-1α的表達(dá)可有助于評估胃癌的生物學(xué)行為和患者預(yù)后，并可能為胃癌的治療提供一個基因靶點(diǎn)，但具體的機(jī)制尚需要進(jìn)行深入的分子生物學(xué)研究。