不同分子分型膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中NTSR1的表達(dá)及意義

曾 英，鐘 鵬，毛成毅，林 俐，杜 娟，付 萍，馬 瑜，肖華亮，郭喬楠

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma, GBM)是成人常見(jiàn)的惡性程度最高的腦腫瘤，其具有高度侵襲性，腫瘤極易復(fù)發(fā)，預(yù)后差。手術(shù)完整切除后輔以放、化療，GBM患者的中位總生存期(overall survival, OS)也僅為15～20個(gè)月[1]。因此，需要探尋新的治療靶位以改善患者預(yù)后。神經(jīng)降壓素(neurotensin, NTS)作為一種在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)廣泛表達(dá)的神經(jīng)肽，主要通過(guò)神經(jīng)降壓素受體1(neurotensin receptor 1, NTSR1)介導(dǎo)激活下游信號(hào)通路。NTSR1通過(guò)激活多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，包括蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPKs)、c-jun-NH-激酶、Rho家族的鳥(niǎo)苷三磷酸酶(RhoGTPase)、黏著斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)、核因子κB(nuclear factor kappa-B, NF-κB)以及Wnt/β-catenin，促進(jìn)細(xì)胞存活、增殖、遷移及侵襲[2-5]。研究發(fā)現(xiàn)NTS和NTSR1在膠質(zhì)瘤組織中高表達(dá)，特別是在GBM，其表達(dá)和膠質(zhì)瘤級(jí)別呈正相關(guān)，利用數(shù)據(jù)庫(kù)信息分析發(fā)現(xiàn)NTS和NTSR1表達(dá)預(yù)測(cè)膠質(zhì)瘤患者預(yù)后差[6]，是GBM患者預(yù)后的重要預(yù)測(cè)指標(biāo)，然而其在組織樣本中的表達(dá)及與患者預(yù)后的關(guān)系尚不清楚，因此本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)GBM中NTSR1的表達(dá)，分析NTSR1與GBM分子分型、重要分子改變及預(yù)后之間的關(guān)系，探索NTSR1在GBM靶向治療中可能發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1 材料收集2010～2017年陸軍特色醫(yī)療中心/陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院病理科存檔的138例具有完整臨床和病理資料的GBM，根據(jù)WHO(2016)中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類(lèi)，由高年資病理醫(yī)師復(fù)核組織切片。本實(shí)驗(yàn)獲陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)2018-125)，所有患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1臨床資料收集 通過(guò)查閱住院病歷及詢問(wèn)患者收集患者的臨床資料，包括患者年齡、性別、病程、腫瘤發(fā)生部位、病變大小、主要癥狀、影像學(xué)特征、治療方法、治療效果和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等，并進(jìn)行追蹤隨訪。隨訪開(kāi)始以病例確診之日起計(jì)算，按月記錄。隨訪截止原因有：死亡、中途失訪或隨訪截止(2019年6月)。

1.2.2組織芯片制備 選取腫瘤組織，HE切片由2名主治及以上職稱(chēng)醫(yī)師分別評(píng)片，避開(kāi)壞死及變性部位，選取腫瘤細(xì)胞富集區(qū)，并圈注；融蠟，制備空白蠟塊；設(shè)計(jì)點(diǎn)位組織陣列；加載設(shè)計(jì)圖標(biāo)，啟動(dòng)組織芯片制作程序，將一個(gè)空白受體蠟塊置于組織芯片儀1號(hào)位，其余按設(shè)計(jì)順序從2～8依次放置并全部鎖緊。對(duì)選擇區(qū)域依次拍照，后通過(guò)調(diào)整取樣針依次取出空白蠟，填加選取的腫瘤組織芯。最后將填好組織芯的受體蠟塊放置于模具中，輕壓蠟塊使組織芯在模具中處于同一平面。將模具置于65 ℃組織芯片融合臺(tái)上融合15 min，冷卻后取下，常規(guī)切片，備用。

1.2.3免疫組化 采用免疫組化EnVision兩步法染色，抗原標(biāo)記NTSR1、CHI3L1購(gòu)自O(shè)rigen公司，IDH1R132H(H09)、ATRX、p53、Ki-67和CD44(DF1485)購(gòu)自福州邁新公司，EGFR、PTEN、vimentin購(gòu)自北京中杉金橋公司。結(jié)果判斷以出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞表達(dá)為陽(yáng)性。NTSR1抗體以肺腺癌組織作為陽(yáng)性對(duì)照，其余抗體設(shè)置相應(yīng)陽(yáng)性對(duì)照，以PBS(0.01 mol/L，pH 7.2)代替一抗作為空白對(duì)照。

1.2.4GBM分子分型 根據(jù)文獻(xiàn)[7]報(bào)道的方法并加以優(yōu)化，用于GBM分子分型：IDH1陽(yáng)性，歸為前神經(jīng)元型；IDH1陰性，EGFR高表達(dá)，歸為經(jīng)典型；IDH1、EGFR陰性，2個(gè)以上間葉標(biāo)志物高表達(dá)(PTEN、vimentin、CHI3L1、CD44)，歸為間葉型；IDH1、EGFR和間葉標(biāo)志物均陰性，歸為其他/不能分類(lèi)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩組與多組間構(gòu)成比比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。一致性檢驗(yàn)(Kappa檢驗(yàn))分析不同蛋白表達(dá)的相關(guān)性。不同蛋白表達(dá)組患者的總生存采用Kaplan-Meier法，并用對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)(Log-rank test)比較組間生存時(shí)間差異；單因素和多因素Cox生存回歸分析與OS相關(guān)的預(yù)后因素。檢驗(yàn)水準(zhǔn)P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征138例GBM患者平均年齡61.4歲，中位年齡53歲；男性74例，女性64例，男女比為1.16 ∶1；幕上好發(fā)，幕下罕見(jiàn)，額葉、顳葉好發(fā)，約26.08%的患者累及2葉；以頭昏頭痛、嘔吐等為主要癥狀，23.19%的患者復(fù)發(fā)，中位無(wú)進(jìn)展生存期(progression free survival, PFS)為6.0個(gè)月，中位OS為9.0個(gè)月。

2.2 免疫表型及分子分型免疫組化顯示ATRX陽(yáng)性定位于細(xì)胞核，細(xì)胞核表達(dá)缺失提示ATRX突變(圖1)，核陽(yáng)性提示ATRX保留，腫瘤周?chē)M織可見(jiàn)ATRX表達(dá)；IDH1陽(yáng)性信號(hào)位于細(xì)胞質(zhì)(圖2)，提示為IDH1突變型GBM；瘤細(xì)胞胞質(zhì)未見(jiàn)IDH1表達(dá)，提示為IDH1野生型GBM，腫瘤周?chē)M織未見(jiàn)IDH1表達(dá)；p53表達(dá)定位于細(xì)胞核，彌漫表達(dá)提示p53陽(yáng)性(圖3)，散在強(qiáng)弱不等表達(dá)提示p53陰性(野生型)，腫瘤周?chē)M織p53陰性。138例GBM中，IDH1陽(yáng)性9例，ATRX缺失27例，p53陽(yáng)性52例。

①②③④⑤⑥⑦⑧

EGFR陽(yáng)性信號(hào)定位于細(xì)胞膜和高爾基體(圖4)，CD44陽(yáng)性信號(hào)定位于細(xì)胞膜和高爾基體(圖5)，CHI3L1陽(yáng)性信號(hào)位于細(xì)胞質(zhì)和高爾基體(圖6)。腫瘤周?chē)M織EGFR、CD44、CHI3L1弱陽(yáng)性。138例GBM中，IDH1陽(yáng)性9例，EGFR彌漫陽(yáng)性46例，CHI3L1陽(yáng)性66例，根據(jù)IDH1、EGFR、CD44、CHI3L1表達(dá)結(jié)果，對(duì)138例GBM進(jìn)行分子分型：間葉型66例(47.8%)，經(jīng)典型46例(33.3%)，前神經(jīng)元型9例(6.5%)，其他/不能分類(lèi)17例(12.3%)，分型率為87.7%(121/138)。

2.3 NTSR1與GBM分子分型的關(guān)系免疫組化染色顯示NTSR1陽(yáng)性定位于細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)(圖7)，腫瘤周?chē)M織中陰性(圖8)。138例GBM中NTSR1陽(yáng)性80例，NTSR1在GBM分子亞型中的表達(dá)差異有顯著性(P=0.003，表1)，在經(jīng)典型、間葉型、前神經(jīng)元型和其他/不能確定類(lèi)型的陽(yáng)性率分別是67.4%、63.6%、11.1%和35.3%。

2.4 GBM中NTSR1與IDH1、ATRX、p53表達(dá)的相關(guān)性IDH1的陽(yáng)性率為6.5%(9/138)，NTSR1在IDH1突變型GBM中陽(yáng)性率為11.1%(1/9)，NTSR1在IDH1野生型GBM中的陽(yáng)性率為62.0%(79/129)，NTSR1與IDH1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P=0.001)；ATRX表達(dá)缺失率為19.6%(27/138)，ATRX表達(dá)(保留)率為80.4%(111/138)，NTSR1與ATRX表達(dá)呈正相關(guān)(P=0.043)；p53陽(yáng)性率為37.7%(52/138)，NTSR1與p53表達(dá)無(wú)相關(guān)性(P=0.263，表1)。

表1 NTSR1與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤分子亞型、IDH1、ATRX、p53表達(dá)的關(guān)系

2.5 預(yù)后分析138例GBM預(yù)后分析結(jié)果顯示：患者性別(Log-rank=0.050，P=0.823)、p53表達(dá)(Log-rank=2.815，P=0.093)與OS無(wú)相關(guān)性。患者年齡與OS有相關(guān)性(Log-rank=4.300，P=0.004)，患者年齡越大，死亡風(fēng)險(xiǎn)越高；治療方式與OS有相關(guān)性(Log-rank=52.893，P<0.001)，采取手術(shù)治療患者的中位OS為6個(gè)月，手術(shù)+放療/化療患者的中位OS是11個(gè)月，手術(shù)+化療+放療患者的中位OS是32個(gè)月(圖9A)。上述結(jié)果提示，采取手術(shù)+放療+化療的治療方式的患者預(yù)后最好。

此外，分子亞型與OS有相關(guān)性(Log-rank=9.971，P=0.019，圖9B)，前神經(jīng)元型、經(jīng)典型、間葉型、其他/不能分類(lèi)的中位OS分別是39、10、9、17個(gè)月。IDH1與OS有相關(guān)性(Log-rank=6.189，P=0.013)，IDH1突變型和IDH1野生型患者的中位OS分別是39、10個(gè)月(圖9C)。ATRX與OS有相關(guān)性(Log-rank=5.130，P=0.024，表2)，ATRX缺失和陽(yáng)性患者的中位OS分別是17.0和10.0個(gè)月。NTSR1陰性與陽(yáng)性患者的中位OS分別為17個(gè)月和9個(gè)月，兩組間OS差異有顯著性(P=0.008，表2，圖9D)。單因素Cox回歸分析結(jié)果亦表明，NTSR1陽(yáng)性患者較NTSR1陰性患者死亡風(fēng)險(xiǎn)顯著增加；患者年齡(P=0.004)、治療方式(P<0.001)和IDH1(P=0.022)、分子亞型(P=0.006)是預(yù)后相關(guān)因素(表3)。

表2 Kaplan-Meier生存曲線分析膠質(zhì)母細(xì)胞瘤臨床病理特征與預(yù)后的關(guān)系

多因素Cox回歸分析結(jié)果顯示：在年齡、性別、分子亞型、IDH1、ATRX、治療方式評(píng)分中，只有分子亞型(前神經(jīng)元型vs其他亞型)(P=0.008)、治療方式(手術(shù)+放療/化療vs手術(shù)，手術(shù)+放療+化療vs手術(shù)，P<0.001)是OS的獨(dú)立預(yù)后因素(表4)。

表4 多因素Cox回歸分析

3 討論

3.1 GBM臨床特征本組中GBM男女比為1.16 ∶1，低于美國(guó)的1.60，接近于瑞士的1.28 ∶1[8]；中位OS為9.0個(gè)月，低于文獻(xiàn)報(bào)道[8]，可能與47%患者僅接受手術(shù)治療，缺乏輔助放療與化療有關(guān)。

3.2 GBM異質(zhì)性與分子分型GBM是一種高度異質(zhì)性的腫瘤，患者預(yù)后較差，從組織學(xué)到分子學(xué)均發(fā)現(xiàn)GBM腫瘤內(nèi)和腫瘤間的異質(zhì)性[9-10]。GBM具有不同組織病理亞型如上皮樣膠質(zhì)母細(xì)胞瘤及分子遺傳學(xué)特征(IDH1、ATRX基因改變等)[11]，其IDH1突變、ATRX突變?nèi)笔А?p/19q共缺失、TERT基因啟動(dòng)子突變等與預(yù)后相關(guān)[12]。Verhaak等[13]將GBM分為4個(gè)基因亞型：間葉型、經(jīng)典型、神經(jīng)元型和前神經(jīng)元型，每種類(lèi)型以特定基因差異為特征，預(yù)后為前神經(jīng)元型>神經(jīng)元型>經(jīng)典型>間葉型。盡管間葉型預(yù)后差，但其可能受益于免疫治療。將GBM進(jìn)行分子分型對(duì)指導(dǎo)臨床預(yù)后有重要意義，最初的分子分型基于表達(dá)譜，其操作繁瑣、費(fèi)用高，不利于臨床推廣。本實(shí)驗(yàn)采用文獻(xiàn)[7]報(bào)道的免疫組化法對(duì)GBM進(jìn)行分子分型，將138例GBM中的121例GBM分為間葉型、經(jīng)典型、前神經(jīng)元型，中位OS分別是9.0、10.0、39.0個(gè)月。與文獻(xiàn)報(bào)道的“不同分子分型對(duì)應(yīng)不同預(yù)后”一致，這證實(shí)了基于IDH1、EGFR、PTEN、CD44、CHI3L1標(biāo)記進(jìn)行分子分型的有效性，適用于臨床。對(duì)于不能分類(lèi)的17例可進(jìn)行測(cè)序或基因表達(dá)譜分析再進(jìn)行分類(lèi)。

ATRX、IDH1和TP53突變?cè)谛切渭?xì)胞性膠質(zhì)瘤譜系早期發(fā)展和進(jìn)展中起重要作用，也與治療和預(yù)后相關(guān)[14-16]。ATRX改變發(fā)生于絕大多數(shù)低級(jí)別星形細(xì)胞瘤和IDH1突變(繼發(fā)性)的GBM。ATRX、p53、IDH這三種生物標(biāo)志物單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用，可將GBM分為不同亞組，對(duì)成人GBM預(yù)后有很強(qiáng)的預(yù)測(cè)價(jià)值[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)GBM患者OS與GBM分子亞型、IDH1、ATRX相關(guān)，前神經(jīng)元亞型較其他組預(yù)后好，IDH1突變、ATRX突變均提示患者預(yù)后好，但p53表達(dá)與預(yù)后無(wú)相關(guān)；分子亞型、治療方式是GBM獨(dú)立預(yù)后因素，前神經(jīng)元亞型提示患者預(yù)后良好，手術(shù)完整切除+輔助放、化療可明顯改善患者預(yù)后，新近研究發(fā)現(xiàn)電場(chǎng)治療可使患者的生存期延長(zhǎng)至20個(gè)月[17]。另外，MGMT啟動(dòng)子甲基化也是預(yù)后良好的因素[18]。

近來(lái)研究顯示，NTS/NTSR1在多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要角色。研究發(fā)現(xiàn)NTS及其受體NTSR1的表達(dá)與膠質(zhì)瘤病理學(xué)分級(jí)呈正相關(guān)，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)分析NTSR1是GBM患者預(yù)后的重要預(yù)測(cè)指標(biāo)[6]。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化法檢測(cè)NTSR1表達(dá)并分析NTSR1與OS的關(guān)系，證實(shí)NTSR1是GBM患者預(yù)后的重要預(yù)測(cè)指標(biāo)，但并非獨(dú)立預(yù)后因素；NTSR1表達(dá)是GBM預(yù)后差的因素。NTSR1在IDH1突變型GBM中表達(dá)率極低，提示NTSR1信號(hào)在IDH1突變型GBM中處于失活狀態(tài)，突變的IDH1催化產(chǎn)生過(guò)量原癌代謝產(chǎn)物2-羥戊二酸，而非正常時(shí)的α-酮戊二酸，導(dǎo)致膠質(zhì)瘤超甲基化表型[19]，IDH1突變型GBM超甲基化使NTSR1處于失活狀態(tài)。文獻(xiàn)報(bào)道NTSR1高甲基化水平提示結(jié)直腸癌患者預(yù)后好，NTSR1低甲基化水平有助于腫瘤惡性潛能[20]；有研究亦顯示NTSR1啟動(dòng)子甲基化可調(diào)控NTSR1表達(dá)和沉默[21-22]。NTSR1主要表達(dá)于IDH野生型GBM，NTSR1表達(dá)與IDH野生型、ATRX(保留)呈正相關(guān)，兩者均提示患者預(yù)后差。TP53體細(xì)胞突變?cè)谀z質(zhì)瘤中發(fā)揮重要作用，特別是在低級(jí)別星形細(xì)胞瘤和IDH1突變型GBM。但本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)NTSR1表達(dá)與p53表達(dá)無(wú)關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，NTSR1在各分子亞型間表達(dá)差異有顯著性，在經(jīng)典型和間葉型中的陽(yáng)性率明顯高于前神經(jīng)元型和其他類(lèi)型，經(jīng)典型和間葉型GBM較前神經(jīng)元型GBM預(yù)后差，提示NTSR1陽(yáng)性患者預(yù)后差可能與分子亞型有關(guān)。經(jīng)典型GBM以EGFR高表達(dá)為特征，NTSR1在經(jīng)典型GBM中的陽(yáng)性率為67.4%。EGFR信號(hào)通路反式激活是NTS信號(hào)在腫瘤進(jìn)展中重要下游事件[23]。NTS/NTSR1可激活EGFR、HER-2和HER-3[23-24]，NTS誘導(dǎo)EGFR過(guò)表達(dá)和激活[25]。NTS信號(hào)活化EGFR信號(hào)，誘導(dǎo)IL-8分泌，維持GSC“干樣”特征[26]。作者推測(cè)在經(jīng)典型GBM中NTSR1可能通過(guò)活化EGFR信號(hào)通路起作用。NTSR1在間葉型GBM中的陽(yáng)性率為63.6%。研究發(fā)現(xiàn)NTS/NTSR1共表達(dá)通過(guò)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換和促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[4]。在間葉型GBM中NTSR1活化可能通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路起作用，促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。

綜上可知，NTSR1表達(dá)與GBM分子分型、重要分子標(biāo)志IDH1、ATRX有相關(guān)性，NTSR1表達(dá)是患者預(yù)后差的因素之一。分子分型、治療方式是GBM獨(dú)立的預(yù)后因素。