基于miRNA芯片對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡的生物信息學(xué)分析

孔 杰，高瑛瑛，王雪琴

(南通市第一人民醫(yī)院 南通大學(xué)第二附屬醫(yī)院 風(fēng)濕免疫科，江蘇 南通 226000)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE)是一種異質(zhì)性的自身免疫性疾病，累及全身多個(gè)臟器和組織，包括關(guān)節(jié)、皮膚、腎臟、心臟及中樞神經(jīng)系統(tǒng)等，男女發(fā)病率之比為1∶7～9[1]。固有免疫及適應(yīng)性免疫應(yīng)答在SLE的發(fā)病機(jī)制中起到了重要作用，樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells, DC)主要分為經(jīng)典DC(classical DC, cDC)和漿細(xì)胞樣DC(plasmacytoid DC, pDC)，處于啟動(dòng)及調(diào)控免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)[2]。單核細(xì)胞起源的DC(monocyte derived DC，moDCs)屬于cDC，SLE患者的moDCs在發(fā)育的各個(gè)階段都存在明顯的表型和功能缺陷，其MHC-Ⅱ的表達(dá)與疾病活動(dòng)度呈負(fù)相關(guān)，在SLE的發(fā)病過(guò)程中起到了重要作用[3]。miRNA是一類(lèi)由21～23個(gè)核苷酸組成的非編碼RNA，通過(guò)結(jié)合mRNA的3′非翻譯區(qū)調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化及凋亡等各種生理和病理過(guò)程。

近幾年基因芯片技術(shù)及生物信息學(xué)的快速發(fā)展，使我們能夠分析SLE患者moDCs中miRNA與健康人的差異，但目前這方面的研究還不是很多。本文從公共基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)(gene expression omnibus, GEO)中下載GSE79240數(shù)據(jù)集，篩選出差異miRNA，對(duì)其進(jìn)行The gene ontology (GO)富集、Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG)信號(hào)通路、轉(zhuǎn)錄因子及靶基因的預(yù)測(cè)，為SLE發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 基因芯片的來(lái)源

從美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)的GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中下載GSE79240數(shù)據(jù)集，該數(shù)據(jù)集包含了5名健康人及5例SLE患者的moDCs樣本，采用的平臺(tái)是GPL18402。

1.2 方法

1.2.1 差異miRNA的篩選：5名健康人及5例SLE患者moDCs的miRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)采用R語(yǔ)言的limma包進(jìn)行分析，篩選標(biāo)準(zhǔn)為：P<0.05及l(fā)ogFC的絕對(duì)值>0.5。采用R語(yǔ)言繪制miRNA聚類(lèi)分析熱圖及火山圖。

1.2.2 差異miRNA的GO富集、KEGG信號(hào)通路及轉(zhuǎn)錄因子分析：GO富集包括生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組成及分子功能3個(gè)部分，采用Funrich軟件對(duì)差異miRNA分別進(jìn)行生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組成、分子功能、KEGG信號(hào)通路及轉(zhuǎn)錄因子的分析，篩選標(biāo)準(zhǔn)為：P<0.05。

1.2.3 miRNA靶基因預(yù)測(cè)：采用MiRTarBase數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，篩選出經(jīng)過(guò)熒光素酶報(bào)告基因、Western blot及PCR驗(yàn)證的靶基因。

2 結(jié)果

2.1 差異miRNA的篩選

SLE患者與健康人moDCs之間有19個(gè)差異miRNA，其中11個(gè)上調(diào)，8個(gè)下調(diào)，上調(diào)的miRNA中，hsa-miR-551b-3p、hsa-miR-3127-5p及hsa-miR-622差異最為顯著；下調(diào)的miRNA中，hsa-miR-602、hsa-let-7i-3p及hsa-miR-338-5p差異最為顯著(表1)。運(yùn)行R語(yǔ)言的pheatmap包繪制差異miRNA聚類(lèi)分析熱圖(圖1)，R語(yǔ)言繪制差異miRNA火山圖(圖2)。

圖1 差異miRNA熱圖Fig 1 Heat map of differential miRNA

圖2 差異miRNA火山圖Fig 2 Volcano plot of differential miRNA

2.2 差異miRNA的GO富集分析

GO富集分為生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組成及分子功能3個(gè)部分，生物學(xué)過(guò)程主要為信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞間通訊及核堿基、核苷、核苷酸及核酸代謝的調(diào)節(jié)，其中信號(hào)傳導(dǎo)富集程度最高為25.1%(圖3A)；細(xì)胞組成主要在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、溶酶體及胞質(zhì)溶膠，其中細(xì)胞核富集程度最高為48.9%(圖3B)；分子功能主要為轉(zhuǎn)錄因子、泛素特異性蛋白酶、受體信號(hào)復(fù)合物支架、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶及GTP酶，其中轉(zhuǎn)錄因子富集程度最高為7.4%(圖3C)。

2.3 差異miRNA的KEGG信號(hào)通路及轉(zhuǎn)錄因子分析

miRNA主要集中在蛋白多糖信號(hào)通路、TRAIL信號(hào)通路、S1P信號(hào)通路、VEGF、VEGFR信號(hào)通路及ErbB受體信號(hào)通路，其中蛋白多糖信號(hào)通路的富集程度最高為35.1%(圖3D)。與miRNA相互作用的轉(zhuǎn)錄因子主要包括：SP1、SP4、EGR1及POU2F1，其中SP1的富集程度最高為57.4%(圖4)。

圖4 差異miRNA轉(zhuǎn)錄因子分析Fig 4 Transcription factor analysis of differential miRNA

2.4 差異miRNA靶基因的預(yù)測(cè)

篩選出經(jīng)過(guò)熒光素酶報(bào)告基因、Western blot及PCR驗(yàn)證的靶基因，其中14個(gè)miRNAs的靶基因經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，5個(gè)miRNAs的靶基因尚未經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，分別為：hsa-miR-551b-3p、hsa-miR-5703、hsa-miR-6125、hsa-miR-602及hsa-miR-1260a(表2)。

表2 在SLE中差異表達(dá)的miRNA的靶基因Table 2 Target genes of differential miRNA of SLE

3 討論

SLE是一種能夠?qū)е露嗯K器損害的自身免疫性疾病，自身反應(yīng)性T細(xì)胞可激活自身反應(yīng)性B細(xì)胞產(chǎn)生大量自身抗體，并與循環(huán)中的自身抗原結(jié)合形成免疫復(fù)合物，沉積于外周組織并激活補(bǔ)體，招募自身反應(yīng)性細(xì)胞如：?jiǎn)魏思?xì)胞、巨噬細(xì)胞、DC、中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞至各臟器，導(dǎo)致慢性炎癥的發(fā)生[4]。DC是專職的抗原提呈細(xì)胞，能夠激活初始T細(xì)胞，處于啟動(dòng)及調(diào)控免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)。DC表面有一系列的病原識(shí)別受體如TLRs、CLRs、RLRs和NLRs，能夠識(shí)別內(nèi)源性及外源性病原及損傷相關(guān)分子，另外DC在維持外周T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)及防止T細(xì)胞異?；罨矫嬉财鹬匾饔肹5]。DC細(xì)胞異常會(huì)導(dǎo)致SLE及類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)等自身免疫性疾病自身免疫耐受的打破，在這些患者外周血及受累臟器中數(shù)目及比例發(fā)生異常、凋亡細(xì)胞吞噬能力受損、凋亡細(xì)胞的自身抗原交叉提呈增強(qiáng)及細(xì)胞因子分泌異常[6]。DC還能通過(guò)釋放B細(xì)胞刺激因子及釋放因子激活B細(xì)胞，導(dǎo)致靶器官淋巴組織增生。MoDCs屬于cDC，在SLE中，單核細(xì)胞在炎性因子的刺激下被招募至靶器官，分化為moDCs，通過(guò)釋放炎性因子及激活T細(xì)胞等機(jī)制損傷靶器官[3]。SLE的發(fā)病機(jī)制涉及眾多基因、信號(hào)通路及轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)挖掘SLE患者moDCs中miRNA的表達(dá)、GO富集、KEGG信號(hào)通路、轉(zhuǎn)錄因子及靶基因的表達(dá)情況，可能為SLE的診斷提供新的依據(jù)及治療靶點(diǎn)。

A.biological process; B.cellular component; C.molecular function; D.biological pathway圖3 差異miRNA的GO富集和KEGG通路分析Fig 3 GO enrichment and KEGG pathway analysis of differential miRNA

本文篩選出19個(gè)在SLE患者moDCs中差異表達(dá)的miRNA，其中11個(gè)上調(diào)，8個(gè)下調(diào)，有部分miRNA在SLE等自身免疫性疾病中的作用已被實(shí)驗(yàn)證實(shí)。miR-142能夠調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞及CD4+CD25+Treg細(xì)胞的功能，在SLE患者moDCs中的表達(dá)明顯增加，促進(jìn)CCL2、CCL5、CXCL8、IL-6及TNF-α等炎性因子的分泌，招募CD4+T細(xì)胞及減少Treg細(xì)胞的比例，促進(jìn)SLE的發(fā)生發(fā)展[7]。miR-338能夠調(diào)節(jié)固有免疫及適應(yīng)性免疫應(yīng)答，在NZB/W F1小鼠模型中，mmu_circRNA_34428通過(guò)miR-338促進(jìn)狼瘡腎炎(lupus nephritis, LN)的發(fā)生發(fā)展，在多發(fā)性硬化患者血漿中miR-338表達(dá)下降[8]。miR-125a在SLE患者T細(xì)胞中表達(dá)下降，通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子KLF13調(diào)控CCL5的表達(dá)，招募T細(xì)胞至靶器官，造成靶器官的慢性炎癥，還能通過(guò)靶分子VEGFA及ERBB2、3調(diào)控細(xì)胞的增殖[9]。

KEGG信號(hào)通路方面，TRAIL、S1P及VEGF信號(hào)通路在SLE中的研究比較成熟。TRAIL信號(hào)通路屬于TNF家族，在SLE患者中表達(dá)增加，引起單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞凋亡促進(jìn)SLE的發(fā)生發(fā)展[10]。S1P信號(hào)通路能夠調(diào)節(jié)固有免疫及適應(yīng)性免疫應(yīng)答，在幼年SLE中表達(dá)升高，F(xiàn)TY720是S1P的抑制劑，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，F(xiàn)TY720能夠緩解SLE的進(jìn)展[11]。VEGF能夠促進(jìn)血管生成及增加血管通透性，VEGF的水平與SLE的疾病活動(dòng)度呈正相關(guān)，在LN患者中表達(dá)更高[12]。因此監(jiān)測(cè)以上通路能更好的了解疾病的進(jìn)展。

同時(shí)本文對(duì)差異miRNA進(jìn)行GO富集分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，分子功能集中在轉(zhuǎn)錄因子方面，轉(zhuǎn)錄因子可與基因特定序列靶向結(jié)合，調(diào)節(jié)目的基因的表達(dá)。SP1、EGR1及POU2F1為研究較多的轉(zhuǎn)錄因子。SP1在幼年SLE患者PBMC中表達(dá)增加，與IRF5成正相關(guān)，IRF5升高促進(jìn)I型干擾素、促炎因子及趨化因子的分泌，引起組織及器官的炎性反應(yīng)[13]。EGR1能夠調(diào)節(jié)血細(xì)胞的分化，經(jīng)B細(xì)胞受體刺激，在SLE患者靜止的初始B細(xì)胞中表達(dá)增加[14]。在SLE患者中，POU2F1通過(guò)染色體相互作用調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞的功能，與GATA3結(jié)合促進(jìn)Th2細(xì)胞的分化及IL4的分泌[15]。

綜上所述，本研究在SLE患者moDCs細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的差異miRNA，可能在SLE的發(fā)病機(jī)制中起到了重要作用，為SLE的診治提供了新的研究思路及理論依據(jù)。