白藜蘆醇抑制腎移植大鼠腎損傷

王 凱，李 明，喬良偉，曲青山

(鄭州人民醫(yī)院 器官移植科, 河南 鄭州 450003)

腎缺血再灌注損傷(renal ischemic reperfusion injury, RIRI)是指腎臟經(jīng)歷一定時間缺血再次恢復血流供應后，功能代謝障礙及結構功能破壞出現(xiàn)加重的現(xiàn)象，是影響腎移植術后移植物功能恢復和長期存活的重要因素[1-2]。白藜蘆醇(resveratrol)是一種天然多酚類化合物，具有抗癌、抗感染、抗氧化、保護心血管和神經(jīng)系統(tǒng)、免疫調(diào)節(jié)等生物學活性[3]。研究表明，白藜蘆醇可治療腎缺血再灌注損傷，對抗氧化應激和炎性級聯(lián)反應，但其作用機制尚不清晰[4-5]。核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)信號通路是經(jīng)典促炎信號傳導途徑，可激活并擴大機體炎性反應，加重缺血再灌注損傷[6-7]。本研究以NF-κB信號通路為切入點，觀察白藜蘆醇對腎移植大鼠腎損傷的改善作用，并探究其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物：SPF級SD大鼠70只，6周齡，體質(zhì)量180～220 g，雌雄各半，北京維通利華實驗動物技術有限公司。研究方案獲鄭州人民醫(yī)院倫理委員會批準(20210003)。

1.1.2 試劑：白藜蘆醇(純度>98%，上海一基實業(yè)有限公司)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所有限公司)；Revert AidTMfirst Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Fisher Scientificals公司)；引物(TaKaRa公司)；IKK-α、IκB-α、p-IκB-α、NF-κB p65、GAPDH兔源單克隆抗體，羊抗兔二抗(CST公司)；Marker(SMOBiO公司)；RIPA裂解液、蛋白定量試劑盒、HE染色試劑盒、脫脂奶粉、ECL發(fā)光液、PVDF轉印膜(北京索萊寶科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分組及處理：將大鼠分為假手術組、模型組(從陰莖背靜脈注射125 U/mL的腎素0.5 mL，造成大鼠腎素化，結扎左腎動靜脈，取出左腎，灌注4 ℃乳酸林格氏液至腎臟呈黃白色，置于器官保存盒備用。受體大鼠取腎方法同上，將供體腎在顯微鏡下吻合腎動脈、靜脈和神經(jīng)，縫合腹部，消毒，給予適量慶大霉素抗感染)、白藜蘆醇高和低劑量組[造模前7 d腹腔注射40和20 mg/(kg·d)白藜蘆醇]，每組10只。術后24 h取標本。

1.2.2 血清Cr、BUN、MDA含量和SOD活性的檢測：術后24 h分離血清，分裝在EP管中，置于-80 ℃超低溫冰箱中凍存。通過Au2700型全自動生化分析儀檢測各組大鼠血清中Cr、BUN的含量。MDA含量檢測：取各組待測血清100 μL，按照說明書依次加入反應試劑，置于100 ℃水浴中孵育60 min，冰浴冷卻，10 000×g常溫離心10 min，吸取200 μL上清液加入玻璃比色皿中，測定各樣品在450、532和600 nm處的吸光度A值，計算ΔA450=A450測定-A450空白，ΔA532=A532測定-A532空白，ΔA600=A600測定-A600空白，MDA含量(μmol/L)=5×[12.9×(ΔA532-ΔA600)-2.58×ΔA450]。SOD活性檢測：取各組待測血清20 μL，按照說明書依次加入反應試劑，37 ℃孵育30 min，450 nm波長測定吸光度(A)值，計算抑制百分率，按照標準曲線計算待測樣品的SOD酶活力(U/mL)。

1.2.3 RT-qPCR法檢測腎組織Bax和Bcl-2 mRNA表達水平：術后24 h分離腎組織，每組稱取0.1 g，冰上研磨，加1 mL Trizol裂解液提取組織總RNA，使用RevertAidTMfirst Strand cDNA Synthesis Kit反轉錄試劑盒合成cDNA，作為熒光定量模版，所有樣品均以GAPDH為內(nèi)參。反應體系：dNTPs 0.5 μL+5×緩沖液2.5 μL+Taq 酶0.3 μL+MgCl21.5 μL+cDNA 模板2 μL +上下游引物分別1 μL，加去離子水至總體積25 μL。反應條件為：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s、62 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，重復40個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃ 5 min終止反應，實驗重復3次。采用2-△△Ct的方法計算目的基因mRNA相對表達水平的變化。引物序列見表1。

表1 基因的引物序列Table 1 Gene primer sequence

1.2.4 Western blot檢測腎組織IKKα、p-IκBα和NF-κB p65蛋白表達:稱取各組大鼠腎組織0.1 g，剪碎后置于研磨器中冰上研磨，離心后取沉淀，沉淀中加入RIPA裂解液處理組織勻漿，提取組織蛋白，BCA法蛋白定量，確定蛋白濃度，隨后配置15%的分離膠和5%的濃縮膠進行SDS-PAGE電泳，上樣后80 V電泳2 h，60 V轉膜2 h，5%脫脂奶粉封閉2 h，將條帶放入10 mL的IKK-α(1∶2 000)、NF-κB p65(1∶2 000)兔源一抗稀釋液中，條帶在一抗稀釋液中4 ℃過夜，第2天用TBST緩沖液清洗3次，每次10 min，然后加入羊抗兔二抗(1∶1 000)，37 ℃孵育2 h，TBST緩沖液清洗3次后滴加ECL發(fā)光液，反應1 min后置于凝膠成像系統(tǒng)顯影。免疫印跡實驗的內(nèi)參蛋白為GAPDH，用Image J軟件分析各個蛋白對應的吸光度值，計算蛋白的相對表達量，蛋白相對表達量=目的蛋白吸光度值/內(nèi)參蛋白吸光度值。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 白藜蘆醇對各組大鼠血清Cr、BUN、SOD和MDA的影響

與假手術組比較，模型組大鼠血清Cr、BUN和MDA含量均增高，而SOD活性降低；與模型組比較，白藜蘆醇高和低劑量組大鼠血清Cr、BUN和MDA含量均降低，SOD活性增加(P<0.05)(表2)。

表2 各組大鼠血清Cr、BUN、MDA含量和SOD活性比較Table 2 Comparison of serum Cr, BUN, MDA content and SOD activity of rats in each n=10)

2.2 白藜蘆醇對各組大鼠腎組織Bax和Bcl-2 mRNA表達水平的影響

與假手術組比較，模型組大鼠腎組織中Bax mRNA表達水平顯著增加，而Bcl-2 mRNA表達水平顯著降低；與模型組比較，白藜蘆醇高劑量組和低劑量組大鼠腎組織中Bax mRNA表達水平顯著降低，Bcl-2 mRNA表達水平顯著增加(P<0.05)(表3)。

表3 各組大鼠腎組織Bax和Bcl-2 mRNA表達水平比較

2.3 白藜蘆醇對各組大鼠腎組織IKKα、p-IκBα、NF-κB p65蛋白表達的影響

與假手術組比較，模型組大鼠腎組織中IKKα、p-IκBα、NF-κB p65蛋白表達均增加；與模型組比較，白藜蘆醇高劑量組和低劑量組大鼠腎組織中IKKα、p-IκBα、NF-κB p65表達水平顯著降低(P<0.05)(圖1，表4)。

表4 各組大鼠腎組織IKKα、p-IκBα、NF-κB p65蛋白相對表達水平比較

3 討論

目前，RIRI是除免疫排斥反應之外腎移植手術的另一主要難題，是導致腎移植手術失敗和移植腎臟功能喪失的重要原因[8]。造成RIRI的主要因素是活性氧的氧化損傷和其激活的炎性級聯(lián)反應，目前尚無有效治療方法[9]。白藜蘆醇是一種天然多酚類化合物，研究表明，白藜蘆醇可改善疾病、藥物、缺血再灌注等導致的腎臟損傷，是預防腎損傷的補充療法，但其作用機制尚不清晰[10]。本研究建立了大鼠腎移植模型，觀察白藜蘆醇對大鼠腎移植后腎損傷的改善作用并探究其作用機制。

A.sham group; B.model group; C.resveratrol high-dose group; D.resveratrol low-dose group圖1 白藜蘆醇對各組大鼠腎組織IKKα、p-IκBα、NF-κB p65蛋白表達的影響Fig 1 Effect of resveratrol on the expression of IKKα, p-IκBα, and NF-κB p65 protein in renal tissues of rats in each group n=10)

本研究結果顯示，模型組大鼠血清中Cr、BUN和MDA的含量增高，SOD活性降低，而使用白藜蘆醇進行預處理后，白藜蘆醇高和低劑量組大鼠血清中Cr、BUN和MDA的含量均降低，SOD活性增加，表明白藜蘆醇能夠抑制腎缺血再灌注損傷產(chǎn)生的氧化應激反應，提高機體抗氧化能力。Bcl-2和Bax是調(diào)控細胞凋亡的關鍵基因，Bax過表達可促進細胞凋亡，而Bcl-2可與Bax形成二聚體，抑制Bax基因的表達，從而抑制細胞凋亡[11]。與假手術組比較，模型組大鼠腎組織中Bax mRNA表達顯著增加，Bcl-2 mRNA表達顯著降低，而采用白藜蘆醇對大鼠進行預處理后，白藜蘆醇高和低劑量組大鼠腎組織Bax mRNA表達顯著降低，Bcl-2 mRNA表達顯著增加，表明白藜蘆醇可減輕腎缺血再灌注損傷導致的細胞凋亡。NF-κB信號通路是經(jīng)典炎性信號通路，NF-κB在靜息狀態(tài)下與IκB結合，在IKK的誘導下發(fā)生磷酸化，使NF-κB活化并向細胞核轉移，調(diào)節(jié)炎性因子釋放，從而促進缺血再灌注損傷[12-13]。與假手術組比較，模型組大鼠腎組織中IKKα、p-IκBα、NF-κB p65蛋白表達均增加，白藜蘆醇預處理可顯著降低大鼠腎組織IKKα、p-IκBα、NF-κB p65的表達水平，表明白藜蘆醇可抑制腎移植大鼠NF-κB信號通路的活化。

綜上所述，白藜蘆醇對腎移植大鼠腎損傷具有保護作用，可改善移植腎功能，提高機體抗氧化能力，抑制細胞凋亡，其作用機制與抑制NF-κB信號通路的活化有關。