全轉(zhuǎn)錄組測序分析精子發(fā)生中RNA結(jié)合蛋白質(zhì)的動態(tài)表達(dá)

李 凱，邙新雨，鄒定峰，李夢真，繆時英，王琳芳，宋 偉

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)系醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點實驗室，北京 100005)

精子發(fā)生是從精原細(xì)胞發(fā)育成為成熟精子的一個復(fù)雜有序的連續(xù)細(xì)胞分化過程，主要分為3個時期：精原細(xì)胞有絲分裂期、精母細(xì)胞減數(shù)分裂期和精子形成期[1]。該過程眾多階段特異性基因的表達(dá)與調(diào)控是維持精子發(fā)生正常進行的分子基礎(chǔ)。目前，大量單細(xì)胞組學(xué)研究高精度解析了精子發(fā)生中生精細(xì)胞有序性發(fā)生的轉(zhuǎn)錄圖譜[2-6]，然而，在轉(zhuǎn)錄后水平如何操控這些轉(zhuǎn)錄生成物的命運和功能進而影響生精細(xì)胞的增殖或分化仍未詳細(xì)闡明。

RNA結(jié)合蛋白質(zhì)(RNA-binding proteins，RBPs)是一類通過其功能結(jié)構(gòu)域與RNA互作并操控RNA命運和功能的蛋白質(zhì)[7]。RBPs在轉(zhuǎn)錄后水平以多種方式參與調(diào)控RNA命運，例如mRNA選擇性剪接、運輸、編輯和翻譯等，這些方式均會引起相應(yīng)的基因表達(dá)變化[8]。目前，在精子發(fā)生中已發(fā)現(xiàn)部分RBPs在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮關(guān)鍵的基因表達(dá)調(diào)控作用[9-10]，然而有關(guān)RBPs在精子發(fā)生全程的動態(tài)表達(dá)圖譜仍缺乏完整認(rèn)識。本研究整合小鼠6種類型生精細(xì)胞的全轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，系統(tǒng)分析RBPs在精子發(fā)生中的動態(tài)表達(dá)全貌、階段特異性及協(xié)同表達(dá)模式，并對其潛在功能進行預(yù)測，為闡釋精子發(fā)生的分子機制及診治男性不育相關(guān)疾病提供新的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠睪丸組織6種類型生精細(xì)胞的全轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)(Bulk RNA-seq)來源于本實驗室前期的研究成果[11]。該數(shù)據(jù)可從美國國立生物信息中心的基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫GEO下載(https://www.ncbi. nlm.nih.gov/geo/)，其登錄號為GSE145130。6種類型生精細(xì)胞分別為原始A型精原細(xì)胞(primitive type A spermatogonia, priSG-A)、B型精原細(xì)胞(type B spermatogonia, SG-B)、前細(xì)線期精母細(xì)胞(preleptotene spermatocytes, plpSC)、粗線期精母細(xì)胞(pachy-tene spermatocytes, pacSC)、圓形精子(round spermatids, rST)和長形精子(elongating spermatids, elST)。

1.2 方法

1.2.1 RNA-seq數(shù)據(jù)處理：6種類型生精細(xì)胞RNA-seq的文庫構(gòu)建、測序數(shù)據(jù)質(zhì)控、基因組比對及基因表達(dá)分析方法見參考文獻(xiàn)[11]。

1.2.2 基因表達(dá)熱圖：利用R語言pheatmap工具包展示RBPs在6種類型生精細(xì)胞中的基因表達(dá)水平(Fragments Per Kilobase of transcript sequence per Millions base pairs mapped, FPKM≥1)。

1.2.3 RBPs差異表達(dá)分析及功能預(yù)測：利用R語言DESeq2工具包分析6種類型生精細(xì)胞差異表達(dá)的RBPs，篩選標(biāo)準(zhǔn)為：|log2FoldChange|≥1.5且P.adjust<0.05。利用時間序列分析軟件(Short Time-series Expression Miner, STEM)分析差異表達(dá)RBPs動態(tài)表達(dá)模式，基因簇最大數(shù)目設(shè)置為50。利用ClusterProfiler工具包對6種類型生精細(xì)胞中差異表達(dá)的RBPs分別進行GO(Gene Ontology)功能富集分析(P.adjust<0.05)。

1.2.4 RBPs共表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析：WGCNA(Weighted Gene Co-Expression Network Analysis)稱為加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析，通過計算基因間表達(dá)關(guān)系鑒定表達(dá)模式相似的基因模塊(Module，ME)，位于同一模塊的基因共表達(dá)程度較高并且具有相似的調(diào)控作用。利用該方法分析RBPs在精子發(fā)生中的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，算法軟閾值設(shè)置為22，其他為默認(rèn)參數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 RBPs在精子發(fā)生中的階段特異性及動態(tài)表達(dá)模式

目前小鼠物種RBPs的數(shù)目預(yù)計為1 913個[7]。基于6種類型生精細(xì)胞的全轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析RBPs在精子發(fā)生過程的全局轉(zhuǎn)錄圖譜，結(jié)果顯示，在這6種類型生精細(xì)胞中共檢測到1 835個RBPs(FPKM≥1)(圖1A)。根據(jù)差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)進一步在精子發(fā)生中鑒定了519個階段相對特異表達(dá)的RBPs，其在priSG-A、SG-B、plpSC、pacSC、rST和elST中的數(shù)目分別為71、102、97、134、80和35個，其中減數(shù)分裂時期(plpSC與pacSC)的RBPs比例最高(44.5%)，有絲分裂時期(priSG-A與SG-B)RBPs比例次之(33.3%)，精子形成時期(rST與elST)的RBPs比例最低(22.2%)。STEM軟件分析結(jié)果顯示階段特異表達(dá)的RBPs在精子發(fā)生中主要具有7種動態(tài)表達(dá)模式(Cluster 1-7)(圖1B)。

2.2 RBPs在精子發(fā)生中的潛在調(diào)控作用

為了進一步預(yù)測RBPs在精子發(fā)生中的潛在調(diào)控作用，分別對階段特異表達(dá)的RBPs進行GO功能富集分析(P.adjust<0.01)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)priSG-A特異表達(dá)RBPs主要富集在RNA剪接(RNA splicing)和mRNA加工(mRNA processing)等(圖2A)；SG-B特異表達(dá)RBPs主要富集在核糖核蛋白復(fù)合物生成(ribonucleoprotein complex biogenesis)和核糖體生成(ribosome biogenesis)等(圖2B)；plpSC特異表達(dá)RBPs主要富集在RNA剪接(RNA splicing)和mRNA加工(mRNA processing)等(圖2C)；pacSC特異表達(dá)RBPs主要富集在核糖核蛋白復(fù)合物生成(ribonucleoprotein complex biogenesis)和核糖體生成(ribosome biogenesis)等(圖2D)；rST特異表達(dá)RBPs主要富集在RNA代謝(mRNA metabolic process)和翻譯(regulation of translation)等(圖2E)；elST特異表達(dá)RBPs主要富集在RNA翻譯(regulation of translation)和RNA代謝(mRNA metabolic process)(圖2F)。

2.3 RBPs在精子發(fā)生中的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析

RBPs在細(xì)胞發(fā)育過程中通常會形成互作復(fù)合體與RNA互作并操控RNA命運和功能，因此鑒定RBPs共表達(dá)模式將有利于進一步發(fā)現(xiàn)其在精子發(fā)生中的重要調(diào)控作用。利用WGCNA分析階段特異表達(dá)RBPs在精子發(fā)生中共表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果共獲得5個共表達(dá)基因模塊(ME 1-5)，并計算各模塊間的關(guān)聯(lián)性(相關(guān)系數(shù)>0.9)(圖3A)。根據(jù)RBPs之間的表達(dá)量進行聚類繪制得到RBPs共表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò), 這5個共表達(dá)基因模塊內(nèi)的RBPs數(shù)量分別為285、145、219、77和76個(圖3B)。將關(guān)聯(lián)性得分最高的RBPs作為某一RBPs的潛在共表達(dá)對象，取交集去掉重復(fù)后共獲得246個共表達(dá)RBPs。STEM軟件分析結(jié)果顯示這些共表達(dá)RBPs在精子發(fā)生中主要具有7種動態(tài)表達(dá)模式(Cluster 1-7)，每一種表達(dá)模式內(nèi)的RBPs數(shù)目分別為19、28、45、36、21、30和26個，其中減數(shù)分裂時期(Cluster 3-5)共表達(dá)RBPs比例最高(49.8%)，精子形成時期(Cluster 6-7)共表達(dá)RBPs比例次之(27.3%)，有絲分裂時期(Cluster 1-2)共表達(dá)RBPs比例最低(22.9%)(圖3C)。

A.heat map showing global transcriptional profile of RBPs in spermatogenesis; B.STEM showing the stage specificity and dynamic expression pattern of RBPs in spermatogenesis

A-F.enriched GO terms of stage-specific RBPs in priSG-A, SG-B, plpSC, pacSC, rST and elST圖2 階段特異表達(dá)的RBPs在精子發(fā)生中的GO功能富集分析Fig 2 GO enrichment analysis of stage-specific RBPs in spermatogenesis

A.heatmap showing the correspondence between co-expression modules; B.heatmap showing WGCNA analysis of RBPs; C.heatmap showing the dynamic expression pattern of RBPs co-expression in spermatogenesis

2.4 共表達(dá)RBPs在精子發(fā)生中的潛在調(diào)控作用

利用GO功能富集分析預(yù)測共表達(dá)RBPs在精子發(fā)生中的潛在調(diào)控作用(P.adjust<0.05)。priSG-A共表達(dá)RBPs數(shù)量較少，并未富集到明顯的GO功能條目。SG-B共表達(dá)RBPs主要富集在核糖核蛋白復(fù)合物生成(ribonucleoprotein complex biogenesis)和核糖體RNA代謝(rRNA metabolic process)等(圖4A)；plpSC共表達(dá)RBPs主要富集在RNA剪接(RNA splicing)和mRNA加工(mRNA processing)等(圖4B)；pacSC共表達(dá)RBPs主要富集在蛋白質(zhì)定位(protein localization)和核糖核蛋白復(fù)合物生成(ribonucleoprotein complex biogenesis)等(圖4C)；rST和elST共表達(dá)RBPs表達(dá)模式較為相似，作為一個基因集進行GO富集分析，主要富集在核糖體生成(ribosome biogenesis)和翻譯調(diào)控(regulation of translation)等(圖4D)。

3 討論

根據(jù)分子生物學(xué)中心法則，以往被視為遺傳信息傳遞中間站的信使RNA (mRNA)其實具有遠(yuǎn)超人們所理解的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控方式，例如mRNA選擇性剪接、編輯、運輸和翻譯等，而這些調(diào)控方式主要是由RBPs介導(dǎo)完成，最終引起相應(yīng)的基因表達(dá)變化。本研究系統(tǒng)描繪了RBPs在精子發(fā)生中的動態(tài)表達(dá)全貌、階段特異性及協(xié)同表達(dá)模式，并對其潛在功能進行了預(yù)測。

基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控對于維持精子發(fā)生的正常進行至關(guān)重要[12]。精子發(fā)生早期階段基因轉(zhuǎn)錄異?；钴S，大量mRNA被轉(zhuǎn)錄生成后，可與RBPs相互作用形成mRNP復(fù)合物進行存儲，在精子發(fā)生后期階段由于染色質(zhì)高度壓縮，基因轉(zhuǎn)錄活性逐漸降低。然而，為了維持生精細(xì)胞的正常發(fā)育，早期轉(zhuǎn)錄并存儲的mRNA在此時開始進行翻譯，該現(xiàn)象稱為“轉(zhuǎn)錄-翻譯”解偶聯(lián)[13]。目前，在精子發(fā)生中已發(fā)現(xiàn)部分RBPs在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮關(guān)鍵的基因調(diào)控作用[14-16]。中科院生化與細(xì)胞研究所劉默芳教授團隊發(fā)現(xiàn)MIWI/piRNA通過與翻譯起始因子eIF3f及AU-rich元件結(jié)合蛋白HuR等相互作用，激活生精細(xì)胞mRNA的翻譯并調(diào)控生精細(xì)胞發(fā)育[9]。本研究發(fā)現(xiàn)RBPs在精子發(fā)生過程呈現(xiàn)階段特異性表達(dá)，并且在早期階段(例如priSG-A、SG-B及plpSC)主要參與調(diào)控mRNA加工、選擇性剪接或穩(wěn)定等過程，而在后期階段(例如rST及elST)主要參與調(diào)控核糖體組裝或mRNA翻譯等過程，提示這些階段特異表達(dá)的RBPs在生精細(xì)胞發(fā)育過程發(fā)揮了重要調(diào)控作用，并為精子發(fā)生中的“轉(zhuǎn)錄-翻譯”解偶聯(lián)提供了潛在分子基礎(chǔ)。此外，RBPs在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)常以共表達(dá)形式存在并能驅(qū)動靶標(biāo)mRNA的協(xié)同表達(dá)，進而調(diào)控細(xì)胞分化或組織發(fā)育。本研究發(fā)現(xiàn)RBPs在精子發(fā)生過程具有明顯的共表達(dá)特征，并主要參與mRNA代謝、mRNP組裝或翻譯等過程，提示精子發(fā)生中共表達(dá)的RBPs是操控RNA命運和功能的潛在重要參與者。然而，這些共表達(dá)的RBPs需要在細(xì)胞和動物水平進行分子生物學(xué)驗證，深入解析RBPs與RNA的相互作用機制、生化特征及生理功能可為理解、診斷和治療男性不育相關(guān)疾病提供新的線索。

A-D.enriched GO terms of RBPs co-expression in SG-B, plpSC, pacSC, rST and elST圖4 共表達(dá)RBPs在精子發(fā)生中的GO功能富集分析Fig 4 GO enrichment analysis of RBPs co-expression in spermatogenesis