過敏者外周血DNA甲基化差異

劉明哲，郭華林，馮彥，李建國，李鵬飛，高彩榮，郭相杰

1.山西醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，山西 晉中 030600；2.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院，山西 太原 030000；3.中國輻射防護(hù)研究院，山西 太原030000

近年來，過敏反應(yīng)的發(fā)病率逐年升高，已成為影響人類健康的全球性疾病[1]。雖然過敏與遺傳因素有關(guān)[2]，但傳統(tǒng)的遺傳易感模型不能完全解釋近年來過敏反應(yīng)快速增加的現(xiàn)象。研究表明，過敏反應(yīng)可能與早期環(huán)境暴露有關(guān)[3]，環(huán)境因素可能通過影響DNA 甲基化水平改變基因表達(dá)，進(jìn)而影響過敏的發(fā)生、發(fā)展[4]。

在我國，嚴(yán)重藥物過敏反應(yīng)導(dǎo)致的死亡也時有發(fā)生，法醫(yī)學(xué)實踐中常涉及藥物過敏性休克死亡的鑒定，其中以頭孢類藥物過敏最為多見[5]。本研究通過對頭孢類藥物致過敏性休克死亡者外周血有核細(xì)胞DNA 進(jìn)行甲基化芯片檢測，運用生物信息學(xué)和隨機(jī)森林算法進(jìn)行分析，對DNA 甲基化與頭孢類藥物過敏的相關(guān)性進(jìn)行研究，為過敏性休克死亡提供新的鑒定方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

2100 生物分析儀（美國Agilent 公司），甲基化芯片Infinium MethylationEPIC BeadChip（簡稱“850K芯片”），HiSeqTM2000 高通量測序儀（美國Illumina公司）。

磁珠法基因組DNA 提取試劑盒［生工生物工程（上海）股份有限公司］，Agencourt AMPure XP 核酸純化試劑盒（美國Beckman Coulter 公司），EZ DNA Methylation-GoldTM試劑盒（美國Zymo Research公司）。

1.2 研究對象

收集頭孢類藥物過敏性休克死亡者5 例為實驗組，免疫正常者5 例為對照組，分別采集外周靜脈血，采用磁珠法提取DNA 樣本以備檢測。本實驗已通過山西醫(yī)科大學(xué)科學(xué)研究倫理審查委員會審批（審批號2018LL016）。

頭孢類藥物過敏性休克死亡者樣本從山西醫(yī)科大學(xué)司法鑒定中心獲得，均為山西漢族人，年齡20～60 歲，其中男性3 人、女性2 人。入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）有明確的頭孢類藥物輸注史或血液（或可疑輸注部位皮膚）檢出頭孢類藥物成分；（2）輸注頭孢類藥物后出現(xiàn)休克癥狀，并在短時間內(nèi)死亡；（3）咽喉、肺及胃腸組織免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示類胰蛋白酶、類糜蛋白酶多量陽性表達(dá)；（4）排除其他原因（疾病、中毒）死亡的可能；（5）尸體未發(fā)生腐敗，血清總IgE＞200 IU/mL。

對照組為身體健康的山西漢族人，年齡20～25歲，其中男性2 人、女性3 人，無過敏史、既往無手術(shù)史，實驗室皮膚點刺實驗均為陰性，血清總IgE＜100 IU/mL，中國人群常見過敏原特異性IgE 均為陰性，頭孢類及青霉素類藥物皮試陰性。

1.3 構(gòu)建DNA文庫

（1）樣本DNA 片段化處理后連接甲基化接頭并純化；（2）加接頭的DNA 片段經(jīng)重亞硫酸鹽處理，未發(fā)生甲基化的C 堿基轉(zhuǎn)化為U 堿基；（3）利用PCR 選擇性富集、擴(kuò)增加接頭的DNA 片段，構(gòu)建DNA 文庫；（4）使用定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）進(jìn)行DNA 文庫定量；（5）使用2100 生物分析儀對PCR 富集片段進(jìn)行質(zhì)量控制，驗證DNA 文庫的片段大小及分布。

1.4 DNA甲基化檢測

基于二代測序平臺（HiSeqTM2000高通量測序儀），使用850K 芯片對頭孢類藥物過敏性休克死亡者與免疫正常者進(jìn)行DNA 甲基化檢測。

1.5 過敏相關(guān)DNA甲基化位點的篩選

對數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制和過濾（過濾低質(zhì)量位點、SNP 干擾位點等）后，使用R 語言methylkit 包分析測序數(shù)據(jù)、R 語言ChAMP 包分析芯片數(shù)據(jù)，得到頭孢類藥物過敏性休克死亡者與免疫正常者的DNA 甲基化差異位點，與人類參考基因組37（Genome Reference Consortium human 37，GRCh37；https://grch37.ensembl.org）比對并進(jìn)行注釋。使用R 語言隨機(jī)森林包（randomForest）基于所得DNA 甲基化差異位點進(jìn)行有監(jiān)督的隨機(jī)森林類別回歸（classification）分析，并評估DNA 甲基化差異位點重要性[6]。在R 語言的隨機(jī)森林算法（randomForest 包）中，使用MeanDecreaseAccuracy（變量被替換后的準(zhǔn)確率下降平均值）與MeanDecreaseGini（變量被替換后Gini 指數(shù)下降平均值）參數(shù)對變量的重要性進(jìn)行評估，數(shù)值越大，重要性越高，即對模型準(zhǔn)確分型的貢獻(xiàn)越高，則該變量（DNA 甲基化差異位點）的差異更為顯著。對兩種參數(shù)獲得DNA 甲基化差異位點的可靠性進(jìn)行評估時，認(rèn)為分布梯度（即不同差異位點之間橫坐標(biāo)指數(shù)差異）越明顯，該參數(shù)獲得的DNA 甲基化差異位點越可信[6]。隨機(jī)森林函數(shù)關(guān)鍵參數(shù)：ntree=500，mtry=2，importance=TURE；余為默認(rèn)值。

2 結(jié)果

對頭孢類藥物過敏性休克死亡者與免疫正常者外周血DNA 進(jìn)行甲基化檢測后，分析甲基化差異位點，得到約10000個甲基化差異位點（P＜0.05）。使用R語言randomForest 包進(jìn)行有監(jiān)督的隨機(jī)森林類別回歸分析，評估DNA 甲基化差異位點的重要性，得到前30 個位點（圖1）。由圖1 可見，在評估頭孢類藥物過敏相關(guān)DNA 甲基化位點的可靠性時，MeanDecrease-Accuracy 的梯度分布更優(yōu)，MeanDecreaseAccuracy 前30 個位點的詳細(xì)信息見表1，其中頭孢類藥物過敏相關(guān)前30 個甲基化差異位點對應(yīng)在ETS1、PRR23B、GNAS等27 個基因上。

表1 頭孢類藥物過敏相關(guān)DNA甲基化差異位點信息（MeanDecreaseAccuracy前30個）Tab.1 Information of the DNA methylation differential sites associated with cephalosporin drugs anaphylaxis（top 30 of MeanDecreaseAccuracy）

圖1 頭孢類藥物過敏相關(guān)DNA甲基化差異位點的重要性（前30個）Fig.1 Importance of DNA methylation differential sites associated with cephalosporin drug anaphylaxis（top 30）

3 討論

藥物過敏性休克死亡的死因判定是法醫(yī)病理學(xué)鑒定的一大難題。目前，涉及過敏性休克死亡的鑒定，是在結(jié)合案情、發(fā)病經(jīng)過、臨床癥狀、尸體檢驗結(jié)果和實驗室檢查結(jié)果的基礎(chǔ)上，綜合分析得出的排除性結(jié)論[7]。因此，尋找準(zhǔn)確、客觀的實驗室診斷指標(biāo)是藥物過敏性休克死亡法醫(yī)學(xué)鑒定亟待解決的問題。

已有研究[3-4]表明，DNA 甲基化水平的改變與過敏反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。但是，目前過敏與DNA 甲基化的相關(guān)研究大都局限于過敏性哮喘[8-9]、過敏性紫癜等過敏性疾病中。本研究對頭孢類藥物過敏性休克死亡者外周血DNA 甲基化進(jìn)行檢測、分析，獲得10 000 個甲基化差異位點，其中前30 個位點對應(yīng)ETS1、PRR23B、GNAS等27 個基因。HE 等[10]研究認(rèn)為，ETS1基因甲基化通過調(diào)節(jié)T 細(xì)胞參與了過敏性疾病的發(fā)生，說明頭孢類藥物過敏與DNA 甲基化有關(guān)，通過尋找DNA 甲基化差異可能為藥物過敏性休克死亡的法醫(yī)學(xué)鑒定提供輔助診斷依據(jù)。本實驗篩選獲得的DNA 甲基化差異位點，可將頭孢類藥物過敏性休克死亡者與正常人群區(qū)分開來，說明其有望應(yīng)用于過敏性休克死亡案例的鑒定診斷。但由于本實驗樣本量相對較小，在實際應(yīng)用中還存在一定的局限，下一步實驗還需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行藥物過敏與DNA 甲基化差異研究。

由于不同過敏原的致敏機(jī)制不同[11-12]，致敏的發(fā)生也與環(huán)境影響因素有關(guān)[13-14]，因此，法醫(yī)學(xué)實踐中運用DNA 甲基化差異進(jìn)行藥物過敏性休克死亡法醫(yī)學(xué)輔助診斷時，應(yīng)考慮到藥物種類不同其相關(guān)的DNA甲基化差異位點（基因）也不同。

綜上所述，頭孢類藥物過敏與DNA 甲基化相關(guān)，通過尋找DNA 甲基化差異可能為藥物過敏性休克死亡的法醫(yī)學(xué)鑒定提供輔助診斷依據(jù)。