3種植物提取物對(duì)梨葉黑斑病菌抑制作用研究

高小寬 張眉

摘 要：以梨黑斑病原菌（Alternaria kikuchiana Tanaka）為供試菌株，采用離體葉盤(pán)法、菌絲生長(zhǎng)速率測(cè)定法和病原孢子萌發(fā)率方法，研究了三七、五味子和銀杏3種提取物不同濃度對(duì)梨葉黑斑病原菌的抗菌活性。結(jié)果表明：3種植物提取物在不同的浸泡時(shí)間隨著處理液濃度的增加抑制率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，3種植物提取物對(duì)梨葉黑斑病菌的最佳抑制濃度均為2 000 mg/L，三七提取物對(duì)梨葉黑斑病抑菌浸泡時(shí)間最佳是2 h，而五味子、銀杏提取物浸泡時(shí)間則為3 h。三七提取物對(duì)梨葉黑斑病抑菌效果最好。

關(guān)鍵詞：梨黑斑病;植物提取物;離體葉盤(pán)法

文章編號(hào)：2096-8108（2021）03-0019-05? 中圖分類(lèi)號(hào)：S436.612.1+4? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Study on the Inhibitory Effect of Three Kinds Plants Extracts on Pear Leaf Black Spot

GAO Xiaokuan，ZHANG Mei

（Department of Biology， Hengshui College， Hengshui 053000， China）

Abstract：Taking the pathogen of pear black spot （Alternaria kikuchiana Tanaka） as the trial bacterial strain， using the methods of leaf disc in vitro test， hypha growth ratio test and the pathogen spore germination ratio test， the inhibitory effect of the extracts with different density from panax notoginseng， schisandra and ginkgo biloba was studied. The results showed that the inhibitory effect of the three kinds plants extracts increased first and then decreased with the increase of the concentration of the solution in different soaking time. The optimum inhibitory concentration of the three kinds plants extracts on Pear leaf black spot pathogen was 2 000 mg/L. The optimum soaking time of Panax notoginseng extract for the inhibitory effect on pear leaf black spot was 2 h， while the optimum soaking time of schisandra and ginkgo extracts was 3 h. Panax notoginseng extract had the best antibacterial effect on pear leaf black spot.

Keywords：Pear Leaf Black Spot; plants extracts; leaf disc in vitro test

黑斑病是影響我國(guó)梨產(chǎn)量及質(zhì)量的主要病害之一，鏈格孢菌是導(dǎo)致梨感染黑斑病的主要病菌[1]。梨樹(shù)早期落葉和嫩梢枯死都可能是梨黑斑病菌的出現(xiàn)導(dǎo)致的，而且梨黑斑病的出現(xiàn)會(huì)讓果實(shí)提前掉落并且伴隨著裂果現(xiàn)象，嚴(yán)重削弱樹(shù)的生長(zhǎng)，降低樹(shù)體的生命力和抗病能力[2]。該病的潛伏侵染期在梨樹(shù)的花期和幼果期，在果實(shí)的貯藏期間梨黑斑病仍存在并且不易控制和防范[3]。

防治梨黑斑病的方法很多，但目前仍以化學(xué)防治為主，但是化學(xué)殺菌劑的使用已超過(guò)數(shù)10年，其使用量已經(jīng)達(dá)到最初量的數(shù)倍，這表明病菌的抗藥性正在增強(qiáng)[4]，如果再繼續(xù)使用則會(huì)導(dǎo)致病菌的增長(zhǎng)難以控制，而且污染自然環(huán)境，其次人們的身體健康狀況會(huì)受到殘留在果實(shí)上的化學(xué)藥劑的威脅 [5]。

因此迫切需要篩選出生防活性高和對(duì)環(huán)境安全的新型防治藥劑。

我國(guó)中草藥資源較豐富，含有抗菌、抑菌、殺蟲(chóng)作用的成分，這些成分是自然存在的，一般易于降解，對(duì)環(huán)境積蓄毒性的可能性不大[6]，本實(shí)驗(yàn)用五味子、三七、銀杏提取物開(kāi)展對(duì)梨葉期的梨黑斑病菌抑制試驗(yàn)。

高小寬等研究發(fā)現(xiàn)五味子、三七、銀杏提取物對(duì)貯藏期梨黑斑病的防治有明顯效果[7]。梁魁景等通過(guò)實(shí)驗(yàn)得到三七提取物對(duì)梨黑斑病的菌絲生長(zhǎng)有一定的抑制效果[8]，但是利用植物提取物對(duì)梨樹(shù)葉片期進(jìn)行梨黑斑病防治的方法很少，因此進(jìn)行五味子等提取物對(duì)梨葉片黑斑病的抑制研究很有必要。

本試驗(yàn)通過(guò)植物提取物對(duì)梨葉片黑斑病病菌進(jìn)行抑制效果研究，采用離體葉盤(pán)法測(cè)定五味子、三七、銀杏葉3種提取物對(duì)梨黑斑病菌的抑制效果，從而篩選出五味子等提取物對(duì)梨葉片黑斑病抑制的最佳濃度及梨葉片最佳浸液時(shí)間，以此為防治梨葉片黑斑病提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，并為新型生物防治劑的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料制備

1.1.1 病原菌制備

采集患有梨黑斑病的病葉，用70%酒精進(jìn)行表面擦拭消毒，無(wú)菌水沖洗后切取病健交界處組織，在無(wú)菌操作條件下移置到PDA平板上，于25 ℃保溫培養(yǎng)，表面長(zhǎng)出分生孢子后進(jìn)行單孢分離，純化后在PDA培養(yǎng)基上作為供試菌株在冰箱中保存待用。

1.1.2 3種植物粗提取

分別對(duì)五味子、三七、銀杏葉進(jìn)行粉碎，用80%乙醇進(jìn)行提取，在搖床中以150? rpm，25 ℃振蕩2 d，用離心機(jī)以3 500 r/min離心20 min，離心結(jié)束后取上清液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，最后用80%乙醇定容，最后將定容好的提取物容器進(jìn)行編號(hào)，放入4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 PDA培養(yǎng)基的制備

采用方中達(dá)方法[9]，首先用天平稱(chēng)量去皮的馬鈴薯200 g，將其切成小方形塊，放入鍋中，加無(wú)菌水1 000 mL，煮沸30 min。將紗布對(duì)折用于濾去馬鈴薯殘?jiān)瑢ⅠR鈴薯濾液放回鍋中，加入瓊脂15～20 g，邊加邊攪拌防止糊化，將瓊脂加熱熔化后加入葡萄糖20 g。待葡萄糖溶解后，加入適量的無(wú)菌水以補(bǔ)充加熱過(guò)程中損失的水分，定容至1 000 mL。分裝至250 mL三角瓶中，每瓶100 mL，包裝完成后，在0.103 Mpa，121 ℃下，高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2.2 病原菌的擴(kuò)大化培養(yǎng)

取實(shí)驗(yàn)室冰箱保存菌種，在超凈工作臺(tái)下進(jìn)行菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)。首先利用滅菌的打孔器在保存的菌板約2/3直徑處鉆取菌餅，將鉆取的菌餅用接種針轉(zhuǎn)移到PDA平板中心處，菌面朝下，置于光照培養(yǎng)箱中25 ℃培養(yǎng)。培養(yǎng)期間要定時(shí)觀察，將有雜菌感染的平板處理，當(dāng)梨黑斑病菌菌落直徑接近2/3培養(yǎng)皿直徑時(shí)，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 離體抑菌試驗(yàn)

首先配制所需濃度溶液，即配置五味子、三七、銀杏葉子提取物質(zhì)量濃度分別為50、100、250、500、1 000、1 500、2 000、4 000 mg/L的溶液，將配置完成的五味子、三七、銀杏葉提取物溶液放置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩２捎秒x體葉盤(pán)法測(cè)定梨黑斑病菌對(duì)五味子、三七、銀杏葉提取物的敏感性。從衡水學(xué)院校園采集葉齡相同的梨健康葉片，用自來(lái)水沖洗晾干，葉片正面朝上浸泡于上述不同處理藥液及對(duì)照組中。

每種處理液及對(duì)照按照0.5、1、2、3、4 h的不同時(shí)間浸泡。然后將葉盤(pán)上的藥液用吸水紙吸干，葉背面朝上置于底部墊有用相同藥液潤(rùn)濕的托盤(pán)內(nèi)。每個(gè)葉盤(pán)上接種2個(gè)菌餅，每次處理3次重復(fù)。最后把托盤(pán)用保鮮膜罩好，保持濕潤(rùn)狀態(tài)。設(shè)置對(duì)照。培養(yǎng)7 d觀察結(jié)果。菌落生長(zhǎng)直徑采用十字交叉法測(cè)量，根據(jù)測(cè)量數(shù)據(jù)進(jìn)行抑制率的計(jì)算。

1.2.4 離體抑菌試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

菌絲生長(zhǎng)抑制率=[（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對(duì)照菌落直徑-菌餅直徑）]×100%

用十字交叉法測(cè)量藥液處理后菌斑直徑和對(duì)照組菌斑直徑。將試驗(yàn)數(shù)據(jù)輸入Excel表格，計(jì)算出不同濃度藥液及時(shí)間下的抑制率，并應(yīng)用SPSS15.0 統(tǒng)計(jì)軟件求出藥劑毒力回歸方程和EC50值。

1.3 發(fā)病情況調(diào)查

接種7 d 后，根據(jù)葉盤(pán)發(fā)病面積，采用9級(jí)法記錄病情。0級(jí)，無(wú)病斑;1級(jí)，病斑面積占整個(gè)葉片面積的5%以下;3 級(jí)，病斑面積占整個(gè)葉片面積的5.1%～25.0%;5級(jí)，病斑面積占整個(gè)葉片面積的25.1%～50.0%;7級(jí)，病斑面積占整個(gè)葉片面積的50.1%～75.0%;9級(jí)，病斑面積占整個(gè)葉片面積的75.1%以上。根據(jù)下式計(jì)算各處理的病情指數(shù)。

病情指數(shù)=Σ（各級(jí)發(fā)病葉盤(pán)數(shù)×相對(duì)極值）/（調(diào)查總?cè)~盤(pán)數(shù)×9）

防治效果=[1-（處理葉盤(pán)病情指數(shù)/對(duì)照葉盤(pán)病情指數(shù)）]×100%

2 結(jié)果分析

2.1 3種植物提取物不同濃度及時(shí)間對(duì)梨葉黑斑病菌菌絲生長(zhǎng)的影響

3種植物提取物在不同濃度及不同浸泡時(shí)間對(duì)梨葉黑斑病菌的影響見(jiàn)表1所示，梨葉片浸液0.5 h時(shí)，3種植物提取物在濃度為50 mg/L時(shí)抑制率均較低，其中銀杏提取物的抑制率最低，為6.15，幾乎沒(méi)有抑制效果。隨著3種植物提取物濃度的增加，抑制率隨之升高，但是在各個(gè)濃度梯度之間，抑制率差異不顯著。當(dāng)濃度為2 000 mg/L時(shí)，3種植物提取物抑制效果均達(dá)到最高，但當(dāng)濃度為4 000 mg/L時(shí)，抑制率卻降低。在其他浸泡時(shí)間，葉片在各個(gè)濃度梯度下的變化規(guī)律與0.5 h相似。三七提取物的濃度為2 000 mg/L，葉片浸泡時(shí)間為2 h時(shí)，抑制率達(dá)到最高值，為55.42%，并且隨著浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制率降低。而五味子和銀杏提取物的濃度在2 000 mg/L時(shí)，葉片浸泡時(shí)間達(dá)到3 h時(shí)，抑制率達(dá)到最高值，分別為49.04%和47.76%。另觀測(cè)到，在同樣濃度下，葉片浸液在4 h時(shí)，五味子提取物的抑菌效果降低，但差異不顯著，而銀杏提取物的抑菌效果顯著降低。

綜合以上分析，可知三七提取物對(duì)梨葉黑斑病抑菌效果最好，其次是五味子提取物，最差的是銀杏提取物。

2.2 藥液對(duì)梨黑斑病菌的室內(nèi)毒力測(cè)定

EC50是藥物的安全性指標(biāo)，即為半最大效應(yīng)濃度，是指引起50%個(gè)體有效的藥物濃度。EC50

值越大，表示藥物越安全，數(shù)值越小代表藥劑毒力越強(qiáng)。不同濃度藥液及浸泡時(shí)間對(duì)梨葉黑斑病影響的相關(guān)毒力回歸方程及EC50值、相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表2所示。由表可以看出，每個(gè)毒力回歸方程的相關(guān)系數(shù)均大于0.916 683 443，說(shuō)明離體葉盤(pán)保濕法具有較高的精密度。3種植物提取物在梨葉浸液時(shí)間為0.5 h時(shí)抑菌效果均不明顯，五味子、銀杏提取物在梨葉片浸泡3 h時(shí)抑制作用均最好，毒力最強(qiáng)，EC50分別為3 482.454、3 585.842 mg/L，而三七提取物在梨葉片浸泡2 h時(shí)抑制作用最好，毒力最強(qiáng)，EC50值為1 597.225 291 mg/L。

此結(jié)果與3種植物提取物不同濃度及浸液時(shí)間對(duì)梨葉黑斑病菌菌絲生長(zhǎng)的影響結(jié)果一致。

2.3 病情記錄

通過(guò)9級(jí)法記錄病情，在不同浸泡時(shí)間下各級(jí)發(fā)病葉盤(pán)數(shù)如表3所示，因黑斑病菌常常以小病斑相互聯(lián)合形成不規(guī)則大斑，所以單菌落病情級(jí)數(shù)最大為3級(jí)。在不同浸泡時(shí)間下，各級(jí)發(fā)病葉盤(pán)數(shù)也不同。

1級(jí)發(fā)病葉盤(pán)數(shù)在0.5～3 h隨著浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，如三七提取物浸泡梨葉時(shí)間為2 h時(shí)，發(fā)病葉盤(pán)數(shù)達(dá)到最大值，在3 h時(shí)保持不變; 而五味子、銀杏提取物在對(duì)梨葉浸液時(shí)間為3 h時(shí)，發(fā)病葉盤(pán)數(shù)均達(dá)到最大值，但在4 h時(shí)3種提取物的發(fā)病葉盤(pán)數(shù)開(kāi)始下降，3級(jí)發(fā)病葉盤(pán)數(shù)卻與之相反。

2.4 病情指數(shù)及防治效果

由9級(jí)法得出的各級(jí)病斑，計(jì)算出各個(gè)時(shí)間段的處理葉盤(pán)病情指數(shù)及防治效果。如表4所示，葉片浸泡在對(duì)照組時(shí)，病情指數(shù)為33.33%，五味子提取物在對(duì)梨葉片浸泡3 h時(shí)病情指數(shù)為最小值18.51%，較對(duì)照的病情指數(shù)下降了14.82個(gè)百分點(diǎn)，并且防治效果最好達(dá)到了44.4%，由此可看出梨葉片浸液時(shí)間為3 h時(shí)對(duì)梨葉期的梨黑斑病防治效果達(dá)到最佳。銀杏提取物在梨葉浸泡間達(dá)到3 h時(shí)，發(fā)病指數(shù)亦達(dá)到最低，值為22.22%，其防治效果達(dá)到最大值為33.33%。三七提取物在梨葉片浸泡0.5 h時(shí)病情指數(shù)最高，為26.85%，在2? h，3? h時(shí)葉片病情指數(shù)最低，為14.81%。從防治效果來(lái)看，在0.5～1 h的葉片發(fā)病率最重，防治效果小于50%;浸泡2 h、3 h時(shí)，防治效果最佳，為55.56%。

3 結(jié)論

3種提取物對(duì)梨葉黑斑病在不同濃度及不同浸泡時(shí)間下均有不同程度的抑菌效果。并且發(fā)現(xiàn)3種植物濃度在2 000 mg/L時(shí)均達(dá)到最好的抑菌效果。但是最佳浸泡時(shí)間卻不同，三七提取物對(duì)梨葉浸泡最佳時(shí)間是2 h，而五味子、銀杏提取物對(duì)梨葉浸泡時(shí)間卻為3 h。綜上所述，三七提取物對(duì)梨葉黑斑病抑菌效果最好，其次是五味子提取物，最差的是銀杏提取物。這一結(jié)果與高小寬等[7]關(guān)于3種植物提取物對(duì)貯藏期梨黑斑病的防治研究結(jié)果一致。

本試驗(yàn)通過(guò)室內(nèi)實(shí)驗(yàn)測(cè)定梨黑斑病菌對(duì)五味子、三七、銀杏提取物的敏感性，初步確定了梨葉片最佳浸液時(shí)間及最佳藥劑濃度。

本次試驗(yàn)僅是對(duì)五味子、三七、銀杏3種植物提取物在防治梨黑斑病方面提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，并為新型生物防治劑的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。由于室內(nèi)實(shí)驗(yàn)受到多種因素的影響，實(shí)際抑制效果還要依賴(lài)于室外環(huán)境來(lái)進(jìn)行試驗(yàn)，還需進(jìn)一步研究。

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收稿日期：2021-01-15

基金項(xiàng)目：衡水市科技計(jì)劃研究資助項(xiàng)目（2019014025Z）;衡水學(xué)院自然科學(xué)類(lèi)項(xiàng)目（編號(hào)：2020ZR20）

第一作者簡(jiǎn)介：高小寬（1981-），女，農(nóng)學(xué)碩士，講師，主要從事植物保護(hù)的研究。

E-mail：507105863@qq.com