溫腎宣痹方對大鼠膝骨關節(jié)炎軟骨的保護作用研究

樊燕鑫 夏天衛(wèi) 沈計榮△

膝骨關節(jié)炎(Osteoarthritis,OA)在骨科臨床常見，其發(fā)病機制仍不明確且無良好療法[1]。溫腎宣痹方是諸方受教授創(chuàng)制的名方，臨床應用廣泛[2-4]。其治療骨與關節(jié)退行性疾病[5-7]，及膝骨關節(jié)炎有較好療效，但作用機制尚不清晰。膝骨關節(jié)炎的主要病理特征是軟骨破壞，研究表明基質金屬蛋白酶在膝骨關節(jié)炎關節(jié)軟骨細胞外基質的降解及重構過程中發(fā)揮重要作用[8]，且前人發(fā)現(xiàn)miR-146a高表達能抑制NF-κB信號通路，延緩OA[9-10]，故設計實驗探討溫腎宣痹方治療膝骨關節(jié)炎的潛在分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級SD大鼠(200～220 g)24只，上海西普爾-必凱實驗動物有限公司(中國)，動物許可證批號為SCXK(滬)-2018-0006。

1.2 實驗藥物及試劑

水合氯醛(C104202，阿拉丁試劑(上海)有限公司，中國)；4%多聚甲醛(G1101，武漢谷歌生物科技，中國)；PBS(G002，賽維爾生物科技有限公司，中國)；番紅-固綠染液(G1005，武漢谷歌生物科技，中國)；油紅O(A600395，生工生物工程上海(股份)有限公司，中國)；異丙醇(A0004338，上海潤捷化學試劑有限公司，中國)；無水乙醇(A0010074，上海潤捷化學試劑有限公司，中國)；二甲苯(A0000542，上海潤捷化學試劑有限公司，中國)；中性樹脂(E675007，生工生物工程上海(股份)有限公司，中國)；0.9%生理鹽水(H37022337，辰興藥業(yè)股份有限公司，中國)。純凈水(LA0727，飛凈生物科技有限公司，中國)。溫腎宣痹方：附子、桂枝、狗脊、細辛、茯苓、生薏苡仁、木香、天麻、山茱萸、澤瀉、白術、生甘草的比例為 10∶10∶10∶10∶12∶15∶10∶10∶10∶10∶10∶10，由江蘇省中醫(yī)院制劑部提供。

1.3 實驗儀器

microCT(skyscan1172，Bruker，比利時)；X-線放射儀(MX-20，F(xiàn)axitron，美國)；生物潔凈安全柜(BHC-1300 ⅡA/B3，蘇州凈化設備有限公司，中國)；脫水機(JJ-12J，武漢俊杰電子有限公司，中國)；包埋機(JB-P5，武漢俊杰電子有限公司，中國)；病理切片機(RM2016，徠卡儀器有限公司，德國)；凍臺(JB-L5，武漢俊杰電子有限公司，中國)；組織攤片機(KD-P，浙江省金華市科迪儀器設備有限公司，中國)；烤箱(DHG-9140A，上海慧泰儀器制造有限公司，中國)；載玻片及蓋玻片(10212432C，江蘇世泰實驗器材有限公司，中國)；倒置熒光顯微鏡(ECLIPSE Ni，Nikon，日本)；載玻片和蓋玻片(10212432C，江蘇世泰實驗器材有限公司，中國)；電子天平(JA2003，上海舜宇恒平科學儀器有限公司，中國)；EDTA(E112486，阿拉丁試劑(上海)有限公司，中國)；NaOH(S140903，阿拉丁試劑(上海)有限公司，中國)。

1.4 方法

1.4.1造模與分組 采用改良Hulth法。首先將24只大鼠分為3組：空白組，實驗組，對照組，每組各8只。實驗組與對照組按大鼠體質量，用水合氯醛行腹腔注射麻醉，常規(guī)備皮、消毒，右側髕旁內側直切口逐層分離、切開右膝關節(jié)，打開關節(jié)腔，顯露膝關節(jié)，將髕骨向外側脫位后顯露前交叉韌帶，用手術刀前端切斷前交叉韌帶，并摘除內側半月板。術中避免損傷軟骨面，徹底止血后復位髕骨，逐層閉合切口。術后大鼠置于3～10 ℃環(huán)境中，相對濕度保持在70%以上，每天活動6 h以上。

1.4.2制作溫腎宣痹方水煎劑 將上述藥物按照處方比例投料，加10倍量水，水煎1次過濾藥渣，冷凝濃縮至每毫升含溫腎宣痹方1 g，如10 g溫腎宣痹方飲片濃縮成10 mL煎液。依據(jù)相關文獻把人的臨床劑量轉換為大鼠的給藥劑量[11]，若人的臨床劑量為xmg/kg，則大鼠的給藥劑量=xmg/kg×70 kg×0.018/200 g=6.3xmg/kg。因溫腎宣痹方臨床使用日劑量為127 g，故確定溫腎宣痹方實驗組的給藥劑量11 g/(kg·d)。

1.4.3干預方法 完成造模后的第2天開始，實驗組給予溫腎宣痹方灌胃處理，每次灌胃含溫腎宣痹方水溶液(給藥體積11 mL/kg)，每日一次，持續(xù)8周。對照組、空白組在每次給藥處理時，灌胃給予相同劑量的純凈水(給藥體積11 mL/kg)，1次/d，持續(xù)8周。

1.4.4標本制作方法 完成8周灌胃后的第2天，處死大鼠。每組各隨機選取3只大鼠的膝關節(jié)，放入4%多聚甲醛保存，準備做病理。用手術刀片離斷每組剩余5只大鼠膝關節(jié)的周圍組織、前后交叉韌帶，暴露脛骨平臺，切取軟骨、滑膜，并將軟骨組織與滑膜組織放入凍存管，-80 ℃保存。準備進行病理檢查的大鼠膝關節(jié)依次行多聚甲醛固定、脫鈣、梯度脫水、透明、組織切片(切片厚度10 μm)、番紅-固綠染色，進行鏡下觀察。

1.5 實驗指標測定

每個膝關節(jié)組織選取至少5張切片，每張切片分別由兩名研究者對大鼠切片進行國際骨關節(jié)炎研究協(xié)會(Osteoarthritis Research Society International，OARSI)評分。最后對每個膝關節(jié)組織切片的OARSI評分結果取平均值并匯總統(tǒng)計。按照Trizol法提取總RNA，從軟骨與滑膜組織里各提取1 μL RNA，按照TAKARA逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄，并進行熒光定量。PCR熒光定量參數(shù)為95 ℃，擴增40個循環(huán)。檢測軟骨組織中MMP-1和MMP-13的表達量以及滑膜組織中miR-146a的表達量。

1.6 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 一般情況

24只大鼠造模后均存活，并完成全部給藥工作。

2.2 組織病理學結果

膝關節(jié)軟骨組織切片(×100)番紅-固綠染色結果顯示：空白組膝關節(jié)關節(jié)面基本平滑，番紅-固綠染色較深、均勻，軟骨面無明顯裂隙，OARSI評分較低(見圖1)。實驗組膝關節(jié)軟骨表面基本平滑，軟骨基質內較多空泡，番紅染色較淺。OARSI評分較對照組低(見圖1)。對照組膝關節(jié)軟骨面接近剝脫，透明軟骨幾乎全部糜爛，軟骨下骨暴露，番紅染色缺失較多。局部可見軟骨下骨增生，OARSI評分較高(見圖1)。

圖1 各組大鼠灌胃8周膝關節(jié)軟骨組織切片番紅-固綠染色結果比較(×100)

2.3 大鼠膝關節(jié)軟骨PCR檢測結果

提取各組大鼠膝關節(jié)軟骨組織，行PCR檢測，結果顯示：實驗組和對照組軟骨組織中MMP-1表達水平相較空白組顯著增加，實驗組軟骨組織中MMP-1基因的相對表達量相比對照組MMP-1基因的相對表達量降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。實驗組和對照組軟骨組織中MMP-13表達水平相較空白組顯著增加，實驗組軟骨組織中MMP-13基因的相對表達量相比對照組MMP-13基因的相對表達量降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。實驗組和對照組滑膜組織中miR-146a表達水平相較空白組顯著降低，實驗組滑膜組織中miR-146a的相對表達量相比對照組miR-146a的相對表達量顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 三組大鼠的OARSI評分及軟骨組織中MMP-1基因、MMP-13基因、miR-146a相對表達量

3 討論

骨性關節(jié)炎是一種以軟骨損傷為基本病理改變的退行性疾病，與炎癥密切相關。目前現(xiàn)代醫(yī)學尚無有效的軟骨保護相關藥物。溫腎宣痹方由桂枝附子湯、五苓散、麻杏薏甘湯加減而成。以桂枝、附子二藥為君，助陽化氣，溫經(jīng)散寒止痛；狗脊祛風除濕，補益肝腎；澤瀉滲濕宣痹；茯苓、薏苡仁健脾利濕；白術、天麻益氣健脾，祛風通絡；木香行氣止痛；山萸肉滋腎填精；細辛加強止痛之效力；甘草調和諸藥，緩急止痛。全方共奏溫補腎陽、宣痹通絡、除濕散寒止痛之功。江蘇省中醫(yī)院已運用該方治療骨性關節(jié)炎60余年，療效確切。本研究前期研究發(fā)現(xiàn)溫腎宣痹方中君藥桂枝的活性成分桂皮醛在IL-1β誘導的SW1353細胞與人軟骨細胞炎癥中，能夠發(fā)揮抗炎、軟骨保護效果[7]。此外，溫腎宣痹方中君藥附子，臣藥細辛、狗脊、薏苡仁，使藥甘草也有一定的抗炎作用。

改良Hulth法是經(jīng)典的骨性關節(jié)炎造模方法，該方法通過切斷大鼠前交叉韌帶與內側半月板，破壞大鼠膝關節(jié)的穩(wěn)定性達到誘發(fā)大鼠骨性關節(jié)炎的目的。本研究采用該法造模取得成功，并且本研究顯示持續(xù)8周、灌胃溫腎宣痹方的復方煎劑能夠降低改良Hulth法建立的骨性關節(jié)炎大鼠膝關節(jié)的OARSI評分，減少軟骨組織MMP-1、MMP-13的表達，保護關節(jié)軟骨。

前期研究提示溫腎宣痹方及其君藥桂枝治療骨性關節(jié)炎的作用機制與miRNA、TLRs/ NF-κB等炎癥相關信號通路相關[9]。miR-146a被發(fā)現(xiàn)可調節(jié)免疫系統(tǒng)的微小RNA，其在骨性關節(jié)炎發(fā)病中的作用已被諸多研究證實[9]。研究顯示關節(jié)滑膜組織中存在巨噬細胞，巨噬細胞中miR-146a可負反饋循環(huán)控制TLRs/NF-κB信號通路，抑制細胞因子與金屬蛋白酶表達[10]。并且有研究發(fā)現(xiàn)在巨噬細胞中miR-146a低表達可激活經(jīng)典的炎癥信號轉導通路NF-κB加劇炎癥反應[11]，如在小鼠過敏性鼻炎中miR-146a上調可通過抑制TLR4/TRAF6/NF-κB信號通路發(fā)揮抗炎作用[12]?；罨霓D錄因子NF-κB遷移至核內，與基因上的κB位點發(fā)生特異性結合，從而促進各種炎癥因子的轉錄，釋放大量炎癥細胞因子，產(chǎn)生級聯(lián)炎癥反應。此外多項研究表明miR-146a下調參與促進M1巨噬細胞的極化，會加劇青少年特發(fā)性關節(jié)炎等疾病[13-14]。這提示溫腎宣痹方可能通過增加關節(jié)滑膜組織里巨噬細胞中miR-146a的表達，抑制下游炎癥通路，發(fā)揮治療骨性關節(jié)炎作用。本研究顯示持續(xù)8周、灌胃溫腎宣痹方的復方煎劑能夠增加滑膜組織中miR-146a的表達，是其保護軟骨的作用機制。這提示下一步，在基礎研究方面，可聚焦miR-146a，結合其上游的LncRNA PVT1及其下游的NF-κB信號通路，對溫腎宣痹方治療骨性關節(jié)炎的具體作用機制展開深入探討。此外，考慮到溫腎宣痹方目前尚未制成中成藥，下一步可對溫腎宣痹方進行現(xiàn)代劑型改革方面的研究。

總之，灌胃溫腎宣痹方水煎劑對大鼠骨性關節(jié)炎軟骨具有一定的保護效果，可延緩OA進程，具體機制與增加滑膜組織中miR-146a的表達、抑制炎癥相關。