SKA3促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲

丁紅巖，徐洪閣，張 磊，韓亞青

南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安市第一人民醫(yī)院 婦科(淮安 223300)

子宮內(nèi)膜癌的病死率約20%，每年有近20萬(wàn)的新發(fā)病例，全世界每年約有74 000例死亡[1]。在過(guò)去的20年中，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率增加了21%，病死率增加了100%以上[2]。紡錘體與著絲粒相關(guān)蛋白3(SKA3)位于第13q號(hào)染色體上，與紡錘體和著絲粒有關(guān)，它不僅能調(diào)節(jié)NDC80復(fù)合體的有絲分裂，還會(huì)調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡。有研究[3]表明，SKA3參與多種癌癥的發(fā)生與發(fā)展，且在肝癌中高表達(dá)，可促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖。而磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白質(zhì)絲氨酸蘇氨酸激酶(AKT)信號(hào)通路的改變可影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。本研究旨在研究SKA3在子宮內(nèi)膜癌中的作用與機(jī)制，為治療子宮內(nèi)膜癌尋找有效的新的治療方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

脂質(zhì)體2000(Invitrogen公司，美國(guó))；siRNA-SKA3、NC(廣州銳博生物科技公司)；所有引物(上海生工生物工程公司)；Trizol試劑盒、SYBR一步法熒光定量PCR試劑盒(北京安諾倫生物科技有限公司)；10%胎牛血清、達(dá)爾貝科極限必需培養(yǎng)液(Dulbecco minimum essential medium,DMEM)、無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)、含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco公司，美國(guó))；子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞HEECs、子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞KLE、JEC、Ishikawa細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心)；Transwell(8 μm)小室(Millipore公司，美國(guó))；CCK8試劑(上海東仁化學(xué)公司)；細(xì)胞裂解液(上海碧云天公司)；SKA3兔多克隆抗體(ab186003)、β-actin兔單克隆抗體(ab115777)、山羊抗兔IgG二抗(ab6721，上海艾博抗貿(mào)易有限公司)；CyclinD1兔單克隆抗體(IMG-80118，Imgenex公司，美國(guó))；MMP-2兔單克隆抗體(AF1420)、AKT兔多克隆抗體(AA326-1，上海碧云天公司)；p-AKT兔單克隆抗體(44-621G，Thermo Fisher公司，美國(guó))。

Bio-Rad CFX Manager3.1軟件(BD Biosciences公司，美國(guó))；酶標(biāo)儀(上海赫冠公司)；培養(yǎng)箱、化學(xué)發(fā)光成像儀(Thermo Fisher公司，美國(guó))；高壓滅菌鍋(青島海爾生物醫(yī)療公司)。

1.2 RT-qPCR和蛋白質(zhì)印跡技術(shù)檢測(cè)SKA3 mRNA和蛋白表達(dá)水平

使用Trizol試劑盒提取細(xì)胞(子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞HEECs、子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞KLE、JEC、Ishikawa細(xì)胞)的總RNA。將RNA模板、引物、2×UltraSYBR One Step RT-qPCR Buffe(r+With+ROX)、SuperEnzyme Mix和RNase-Free Water溶解并置于冰上備用。根據(jù)SYBR一步法熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)，配制RT-qPCR反應(yīng)體系，按以下反應(yīng)條件進(jìn)行反應(yīng)。逆轉(zhuǎn)錄45 ℃ 10 min，預(yù)變性95 ℃ 5 min，變性95 ℃ 10 s，退火60 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 2 min，循環(huán)35次。使用Bio-Rad CFX Manager 3.1軟件進(jìn)行分析，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，以β-actin作為內(nèi)參基因，采用2-△Ct的方法進(jìn)行相對(duì)定量分析，引物如下(表1)。

表1 RT-qPCR引物

將子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞HEECs和子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞KLE、JEC、Ishikawa細(xì)胞在裂解液中裂解，超聲處理后4 ℃下以離心半徑6.5 cm，轉(zhuǎn)速14 000 r/min離心15 min，收集上清液(組織裂解物)。取30 μg蛋白質(zhì)樣品并通過(guò)10%SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，用TBST配置的5%脫脂奶封閉1 h。將聚偏二氟乙烯膜與SKA3抗體(1∶2 000)、β-actin(1∶200)中4 ℃孵育過(guò)夜。第2天復(fù)溫1 h后TBST洗滌3次，與山羊抗兔IgG二抗(1∶10 000)孵育抗體1 h。漂洗后用超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑在化學(xué)發(fā)光成像儀內(nèi)顯影。使用GeneTools軟件對(duì)免疫印跡圖像進(jìn)行定量，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

所有細(xì)胞均在37 ℃ 5%CO2中的10%胎牛血清、青霉素和鏈霉素的達(dá)爾貝科極限必需培養(yǎng)液(Dulbecco minimum essential medium,DMEM)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染時(shí)，將Ishikawa細(xì)胞以6×104個(gè)/孔的密度接種到12孔組織培養(yǎng)板中，在培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h。對(duì)照組：正常培養(yǎng)Ishikawa細(xì)胞；si-SKA3組：根據(jù)脂質(zhì)體2000說(shuō)明書(shū)，將50 nmol/L siRNA-SKA3轉(zhuǎn)染至Ishikawa細(xì)胞；NC組：根據(jù)脂質(zhì)體2000說(shuō)明書(shū)，將50 nmol/L siRNA-NC轉(zhuǎn)染至Ishikawa細(xì)胞。37 ℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 CCK8和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況

在96孔板中接種各組細(xì)胞懸液(2×104個(gè)/mL，100 μL/孔)，將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)一段時(shí)間(37 ℃，5% CO2)。每孔加入10 μL CCK8試劑，在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h。在24、48、72、96 h用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度值，繪制細(xì)胞增殖曲線,重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。取各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液(2×104個(gè)/mL)，梯度倍數(shù)稀釋后分別接種于含培養(yǎng)液的皿中，培養(yǎng)2周。棄上清液后用4%多聚甲醛固定，GIMSA染色液染20 min。根據(jù)公式計(jì)算克隆形成率。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.5 Transwell和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲和遷移情況

在Transwell上室加入250 μL的無(wú)血清培養(yǎng)基，室溫下靜置20 min。取無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)的濃度為5×104個(gè)/mL的各組細(xì)胞懸液200 μL加置Transwell小室。下室加入500 μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基。24 h后棄去孔中培養(yǎng)液，無(wú)鈣的磷酸緩沖鹽溶液洗滌3次后加入甲醇固定30 min，將小室適當(dāng)風(fēng)干。結(jié)晶紫染色后擦掉上層未遷移細(xì)胞，磷酸緩沖鹽溶液漂洗3次。在顯微鏡下觀察細(xì)胞并記數(shù)。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

將與實(shí)驗(yàn)相關(guān)的器械進(jìn)行高溫和紫外線滅菌后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。先在6孔板背后均勻地劃?rùn)M線，約隔0.5～1.0 cm一道，橫穿過(guò)孔。每孔至少穿過(guò)5條線。在空中加入約5×105個(gè)細(xì)胞，第2天用槍頭比著直尺，垂直于橫線劃線。磷酸緩沖鹽溶液漂洗3次，加入無(wú)血清的培養(yǎng)基后置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)。第0、24 h從培養(yǎng)皿中取樣，進(jìn)行觀察與拍照。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.6 蛋白質(zhì)印跡技術(shù)檢測(cè)CyclinD1、MMP-2、AKT、p-AKT蛋白表達(dá)水平

各組細(xì)胞裂解后，10%SDS-PAGE進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜后進(jìn)行封閉。加入CyclinD1(1∶2 000)、MMP-2(1∶1 000)、AKT(1∶3 000)、p-AKT(1∶2 000)、β-actin(1∶2 000)在4 ℃下孵育過(guò)夜。第2天室溫復(fù)溫，漂洗后加入山羊抗兔IgG二抗(1：10 000)進(jìn)行二抗孵育，在化學(xué)發(fā)光成像儀內(nèi)顯影。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 SKA3在各細(xì)胞系中的表達(dá)

與子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞HEECs比，SKA3 mRNA和蛋白在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞KLE、JEC、Ishikawa細(xì)胞中的表達(dá)量升高(F=206.926、541.391；P均<0.001)(圖1、表2)。選取相對(duì)表達(dá)量最高的Ishikawa細(xì)胞作為研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)染，與對(duì)照組和NC組比，si-SKA3組SKA3 mRNA表達(dá)水平下降(F=205.138，P<0.001)，提示轉(zhuǎn)染效果佳(圖2、表3)。

圖1 SKA3在各細(xì)胞系中的表達(dá)

表2 各細(xì)胞系SKA3 mRNA和蛋白表達(dá)

圖2 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞SKA3 mRNA表達(dá)量

表3 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞SKA3 mRNA表達(dá)量(n=3)

2.2 SKA3對(duì)各組細(xì)胞增殖的影響

CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組和NC組比，si-SKA3組細(xì)胞增殖能力在48、72、96 h受到明顯抑制(F=35.131，P<0.001;F=19.400，P=0.002；F=31.457,P=0.001)?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組和NC組比，si-SKA3組細(xì)胞數(shù)目減少(F=76.651，P<0.001)。蛋白質(zhì)印跡技術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組和NC組比，si-SKA3組CyclinD1蛋白表達(dá)量明顯下降(F=323.641，P<0.001)(圖3、表4)。

圖3 SKA3對(duì)各組細(xì)胞增殖情況的影響

表4 SKA3對(duì)各組細(xì)胞克隆和CyclinD1蛋白表達(dá)量的影響

2.3 SKA3對(duì)各組細(xì)胞侵襲和遷移的影響

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組和NC組比，si-SKA3組細(xì)胞穿膜數(shù)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=28.720，P=0.001)。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組和NC組比，si-SKA3組劃痕寬度明顯增大(F=71.590，P<0.001)。蛋白質(zhì)印跡技術(shù)結(jié)果顯示，與對(duì)照組和NC組比，si-SKA3組細(xì)胞MMP-2蛋白表達(dá)量明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=77.932，P<0.001)(圖4、表5)。

圖4 SKA3對(duì)各組細(xì)胞侵襲和遷移的影響

表5 SKA3對(duì)各組細(xì)胞侵襲和遷移的影響

2.4 SKA3對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路的影響

蛋白質(zhì)印跡技術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，si-SKA3組與對(duì)照組和NC組比，細(xì)胞中AKT蛋白表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.091，P=0.394)，p-AKT蛋白表達(dá)量明顯下降(F=226.891，P<0.001)(圖5、表6)。

圖5 SKA3對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路的影響

表6 SKA3對(duì)各組細(xì)胞AKT、p-AKT蛋白表達(dá)量的影響

3 討論

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖器的三大惡性腫瘤之一，是占女性全身惡性腫瘤的7%和女性生殖器惡性腫瘤的20%～30%。其中，被診斷為子宮內(nèi)膜癌的婦女中約有67%處于早期階段，約21%局部擴(kuò)散至盆腔淋巴結(jié)和周?chē)鞴?，約8%發(fā)生轉(zhuǎn)移，其死亡的主要原因與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)[4-5]。

SKA3是一種紡錘體和線粒體相關(guān)的復(fù)雜亞基，是減數(shù)分裂紡錘體遷移和后期紡錘體穩(wěn)定性的關(guān)鍵，且參與促進(jìn)癌癥的惡性轉(zhuǎn)化，如SKA3促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)[6]。而過(guò)表達(dá)SKA3與多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)，Hou等[7]研究發(fā)現(xiàn)，SKA3在肝癌組織和肝癌細(xì)胞中的表達(dá)水平高于正常肝組織和正常細(xì)胞；且過(guò)表達(dá)SKA3肝癌細(xì)胞的增殖明顯增強(qiáng)，而干擾SKA3表達(dá)后肝癌細(xì)胞的增殖顯著減弱，SKA3可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖，減少肝癌細(xì)胞的凋亡。Chuang等[8]發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)SKA3導(dǎo)致結(jié)直腸腺瘤癌變，而敲除結(jié)直腸腺瘤細(xì)胞中的SKA3會(huì)大大降低細(xì)胞生長(zhǎng)速率，誘導(dǎo)G2/M阻滯并減少細(xì)胞遷移和侵襲。

周期蛋白D1(CyclinD1)是高度保守的細(xì)胞周期蛋白家族的成員之一，通過(guò)抑制細(xì)胞周期來(lái)控制細(xì)胞周期G1/S的轉(zhuǎn)變。研究[9]表明，CyclinD1可與核受體結(jié)合以促進(jìn)某些類(lèi)型細(xì)胞的增殖，并與組蛋白乙?；负兔撘阴；附Y(jié)合以表觀遺傳地調(diào)控基因表達(dá)。另外，CyclinD1過(guò)表達(dá)會(huì)使基因突變、擴(kuò)增和重排，從而導(dǎo)致不同類(lèi)型的惡性腫瘤。Liao等[10]研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中CyclinD1的表達(dá)上調(diào)。但是，目前還不清楚CyclinD1是否以及如何調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜癌的表達(dá)。而基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)是鋅依賴(lài)性金屬蛋白酶基因家族的成員，在癌癥的侵襲，轉(zhuǎn)移和進(jìn)展中起著至關(guān)重要的作用。Liu等[11]發(fā)現(xiàn)，在子宮內(nèi)膜癌中MMP-2高表達(dá)，且與子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的侵襲有關(guān)。Hu等[12]發(fā)現(xiàn)，SKA3可通過(guò)PI3K/AKT依賴(lài)性方式增加MMP-2的表達(dá)，促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的遷移與侵襲能力。本研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系的SKA3 mRNA和蛋白表達(dá)水平較高，而干擾SKA3表達(dá)后，細(xì)胞的增殖、侵襲能力降低，劃痕寬度變大，CyclinD1和MMP-2蛋白表達(dá)量均明顯下降，這表明干擾SKA3能夠抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)途徑通過(guò)激活下游相應(yīng)的效應(yīng)子分子參與多種細(xì)胞生理過(guò)程的調(diào)控，在細(xì)胞周期，生長(zhǎng)和增殖中起著重要作用。有研究[13]表明，該信號(hào)通路與子宮內(nèi)膜癌關(guān)系密切。Chen等[14]發(fā)現(xiàn)，組蛋白賴(lài)氨酸特異性脫甲基酶1通過(guò)影響PI3K/AKT信號(hào)抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖。另外，也有研究[15]表明，該信號(hào)通路與SKA3也有緊密聯(lián)系，SKA3過(guò)表達(dá)通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程和激活PI3K/AKT信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖與遷移。本研究發(fā)現(xiàn)，si-SKA3組細(xì)胞AKT蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化，但p-AKT蛋白表達(dá)下降，提示SKA3可能通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

綜上所述，干擾SKA3可能通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，表明干擾SKA3可能是治療子宮內(nèi)膜癌新的治療選擇。