Pdots-RVG-Curcumin納米復(fù)合物穿透體外血腦屏障模型的研究*

文欣宜，蘇炳銀，李淑蓉△，韓玉萍△

1.成都醫(yī)學(xué)院 發(fā)育與再生四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(成都 610500)；2.成都醫(yī)學(xué)院 病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室(成都 610500)；3.成都醫(yī)學(xué)院 組織胚胎學(xué)教研室(成都 610500)

血腦屏障(blood brain barrier，BBB)是存在于血液和中樞神經(jīng)系統(tǒng)之間的屏障結(jié)構(gòu)，由腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接、星形膠質(zhì)細(xì)胞足突、基底膜和周細(xì)胞組成[1]。BBB一方面起神經(jīng)保護(hù)作用，保證中樞神經(jīng)系統(tǒng)較少被外來物質(zhì)侵?jǐn)_，維持高度的穩(wěn)態(tài)，同時(shí)為腦內(nèi)輸送營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；另一方面，BBB也阻礙了用于腦部疾病診斷和治療的藥物通過非侵入性給藥方式進(jìn)入腦內(nèi)。因此，通過各種手段對(duì)藥物進(jìn)行結(jié)構(gòu)等方面的修飾，使藥物能夠穿越BBB[2]，進(jìn)入腦組織發(fā)揮藥效，是近些年研究者重點(diǎn)關(guān)注的方向。腦靶向生物相容性高的納米生物載體可以在分子水平上解決這個(gè)問題。

理想的腦靶向藥物系統(tǒng)包括治療性藥物、藥物載體、靶向分子三部分。姜黃素(curcumin, Cur)是從姜黃根莖中提取的一種多酚類物質(zhì)，有著廣泛的藥理作用，如抗炎、抗氧化，抗腫瘤、抗動(dòng)脈粥樣硬化等[3-6]，近年來逐漸用于神經(jīng)退行性疾病的治療。然而，由于Cur在體內(nèi)半衰期短、口服吸收差、化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，導(dǎo)致其生物利用度較低，限制了Cur在臨床上的運(yùn)用。半導(dǎo)體聚合物量子點(diǎn)(semiconducting polymer dots, Pdots)經(jīng)修飾后可用作靶向藥物載體，提高藥物的靶向運(yùn)輸能力，延長(zhǎng)藥物的半衰期，增強(qiáng)藥物的治療作用，同時(shí)減小藥物的毒性。Pdots的疏水性使其具有載體屏蔽作用，藥物被包覆在Pdots內(nèi)部，或者與Pdots共價(jià)連接[7]?？袢〔《疽職ぶ邪惺壬窠?jīng)性蛋白質(zhì)(rabies virus glycoprotein, RVG)，能被神經(jīng)元表面表達(dá)的尼古丁乙酰膽堿受體特異性識(shí)別。在RVG的作用下，狂犬病病毒很容易越過BBB，侵襲腦組織和神經(jīng)中樞，引起狂犬病發(fā)作[8]。本研究通過構(gòu)建Pdots-RVG-Cur納米復(fù)合物以及體外BBB模型，探討Pdots-RVG-Cur穿透BBB靶向神經(jīng)元的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠中腦多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞系(MN9D)、小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞系(b.End3)由中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)提供，高糖DMEM、DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗(青霉素+鏈霉素)、0.25%胰酶均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，超濾離心管(0.5 mL/100 kd)、0.22 μm親水PVDF微孔濾膜、懸掛式細(xì)胞培養(yǎng)小室(PET 3 μm, 24-well)均購(gòu)自美國(guó)Millipore公司，二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)、9,9-二辛基聚芴苯并噻二唑交替共聚物(F8BT)、四氫呋喃(tetrahydrofuran,THF)、Cur、多聚甲醛、聚苯乙烯-馬來酸酐 (poly styrene-co-maleic anhydride, PSMA)均購(gòu)自德國(guó)sigma-aldrich公司，RVG29-Cys購(gòu)自上海吉爾生化公司，抗熒光淬滅劑(4′,6-二氨基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)、羥乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)購(gòu)自上海碧云天公司，CCK-8試劑盒購(gòu)自日本同仁公司，不含酚紅DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)博士德公司，熒光素鈉購(gòu)自上海阿拉丁公司，鼠尾Ⅰ型膠原、細(xì)胞培養(yǎng)皿均購(gòu)自美國(guó)Corning公司。

1.2 材料制備

1.2.1 Pdots的制備 采用納米共沉淀的方法制備Pdots。將0.75 mg共軛聚合物F8BT、0.187 mg兩親性聚合物PSMA溶解于3 mL THF，將混合液迅速加入正在超聲的雙蒸水中，繼續(xù)超聲20 min直至溶液澄清透亮。將溶液置于通風(fēng)櫥，通風(fēng)過夜以蒸發(fā)溶液中多余的THF。將得到的溶液用100 KDa超濾管離心提純。最后，將提純后的溶液通過0.22 μm的膜過濾得到濃度為250 mg/L的Pdots原液。密封，置于4 ℃冰箱避光保存。

1.2.2 Pdots-RVG的制備 將Pdots與RVG按照1∶1 000 mol/L比例混合，若要配置1 mL含Pdots-RVG的培養(yǎng)基，按照以下比例混合：Pdots原液100 μL、HEPES(1 mol/L) 15 μL、RVG(1 mmol/L)8.8 μL、含2% FBS的細(xì)胞培養(yǎng)基876.2 μL。按照順序依次加入，每步充分混合。其中，加入RVG后要充分混合20 min后再加入培養(yǎng)基。Pdots-RVG混合液現(xiàn)用現(xiàn)配，盡量避光操作。

1.2.3 Cur母液及Pdots-RVG-Cur的配制 Cur溶解于無水乙醇中，配制成濃度為10 g/L的Cur溶液。將合成好的Pdots-RVG與一定量的Cur溶液混合，室溫下?lián)u床輕微搖晃2 h以充分混勻，制備Pdots-RVG-Cur。

1.3 材料的表征

1.3.1 透射電子顯微鏡(transmission electron microscope, TEM)下觀察納米顆粒的形態(tài) 取50 μL樣品滴加到銅網(wǎng)上，干燥后在TEM下對(duì)其形貌進(jìn)行表征。其中Pdots-RVG、Pdots-RVG-Cur經(jīng)過磷鎢酸染色。

1.3.2 動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)(dynamic light scattering, DLS)檢測(cè)納米顆粒粒徑及穩(wěn)定性分析 將樣品稀釋到合適的倍數(shù)，用納米粒度儀測(cè)量，采集數(shù)據(jù)，獲得其平均水力學(xué)直徑及多分散系數(shù)(particle dispersion index, PDI)。將樣品室溫放置24、48 h后采集數(shù)據(jù)。

1.4 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞存活率

MN9D細(xì)胞和b.End3細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后分別接種于96孔板，分為空白組、對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組，空白組不含細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組分別加入含不同濃度Pdots-RVG混合液(Pdots濃度為10～50 mg/L，RVG的濃度按照方法1.2.2相應(yīng)增加)的培養(yǎng)基，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱孵育48 h。吸除培養(yǎng)基，每個(gè)孔內(nèi)加入含10% CCK-8試劑的培養(yǎng)基，避光孵育1.5 h。用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度值，根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率(%)=(A給藥-A空白)/(A對(duì)照-A空白)×100%。

1.5 BBB體外模型的建立

取足夠數(shù)量的懸掛式細(xì)胞培養(yǎng)小室置于24孔板內(nèi)。小室上層加100 μmol/L鼠尾膠原Ⅰ，濕潤(rùn)小室20 min后吸出，超凈工作臺(tái)1級(jí)風(fēng)干6 h，風(fēng)干成膠。將b.End3接種在涂有鼠尾膠原Ⅰ的小室的PET膜上，小室下層加500 μL高糖DMEM培養(yǎng)基以高過PET膜水平面。接種細(xì)胞當(dāng)天，12 h后更換小室上層培養(yǎng)基，以后隔天換液。

1.6 BBB體外模型的評(píng)價(jià)

1.6.1 4 h滲漏實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞貼附在PET膜上后，在小室上層加入300 μL高糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基，在小室下層加入500 μL高糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基以高過上層液面(具有>0.5 cm的液面差)。置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h，取出觀察小室上、下層液面差變化。當(dāng)4 h后液面差沒有明顯變化時(shí)，說明形成了較為致密的細(xì)胞層，行下步熒光素鈉(fluorescein sodiu,FLU)通透性實(shí)驗(yàn)。

1.6.2 FLU通透性實(shí)驗(yàn) 測(cè)定1.000、0.500、0.250、0.125、0.063 g/L FLU溶液在530 nm處的吸光度值，繪制FLU標(biāo)準(zhǔn)曲線。細(xì)胞小室上層加300 μL含1 g/L FLU的無酚紅DMEM培養(yǎng)基，下層加入無酚紅DMEM培養(yǎng)基，加入的量以保持上、下液面相平為準(zhǔn)。培養(yǎng)2 h后，分別從上、下室中取100 μL溶液，加入到96孔板中，酶標(biāo)儀測(cè)溶液在530 nm處的吸光度，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算FLU濃度。以未加入b.End3細(xì)胞的小室作為空白對(duì)照組，4 h試漏實(shí)驗(yàn)成功的b.End3細(xì)胞小室為模型組，比較兩組FLU通透率差異。小室FLU通透率=(下室FLU濃度×下室培養(yǎng)液體積)/(上層FLU濃度×上室培養(yǎng)液體積)×100%。

1.7 觀察BBB模型中MN9D細(xì)胞對(duì)藥物的攝取情況

將MN9D細(xì)胞接種于帶有細(xì)胞爬片的24孔板內(nèi)，將成功建立BBB體外模型的懸掛式細(xì)胞小室移至其內(nèi)(圖1)向小室上層分別加入DMEM/F12培養(yǎng)基、含20 μmol/L Cur的培養(yǎng)基、含相同Cur濃度的Pdots-RVG-Cur的培養(yǎng)基，共孵育48 h。培養(yǎng)結(jié)束后，移去小室，MN9D細(xì)胞爬片PBS洗3次。4%多聚甲醛避光固定細(xì)胞20 min。將細(xì)胞爬片有細(xì)胞的一面朝下蓋在滴有抗熒光淬滅劑(含DAPI)的載玻片上，通風(fēng)櫥避光通風(fēng)，風(fēng)干后后立即用激光共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscope,CLSM)觀察。

圖1 體外BBB模型圖

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 Pdots、Pdots-RVG、Pdots-RVG-Cur的表征

2.1.1 TEM下觀察納米顆粒的形貌 TEM下觀察Pdots的外貌呈相對(duì)均勻的球形，粒徑在0.10 μm左右。Pdots-RVG、Pdots-RVG-Cur同樣呈球形，粒徑分別在0.20、0.33 μm左右(圖2), 表明Pdots-RVG載藥結(jié)構(gòu)具有穩(wěn)定性。

圖2 TEMF觀察Pdots、Pdots-RVG、Pdots-RVG-Cur的形態(tài)

2.1.2 DLS測(cè)試納米顆粒粒徑及及穩(wěn)定性分析 PDI表示粒徑分布的離散程度，PDI越小，說明粒子大小分布越集中，粒徑表征時(shí)PDI的最佳范圍為0.08～0.70。測(cè)量Pdots、Pdots-RVG、Pdots-RVG-Cur的PDI分別為0.206、0.217、0.308,納米粒子分散均勻，粒徑測(cè)量結(jié)果可靠。Pdots平均粒徑為98.4 nm, Pdots-RVG平均粒徑為214.8 nm, Pdots-RVG-Cur平均粒徑為317.2 nm(圖3)。這與TEM下觀察到的粒子粒徑相符合。24、48 h再進(jìn)行DLS測(cè)量。結(jié)果顯示，隨著時(shí)間推移，Pdots、Pdots-RVG、Pdots-RVG-Cur的粒徑分別相對(duì)穩(wěn)定在95、250、320 nm左右，說明三者在溶液中穩(wěn)定性均良好(表1)。

圖3 Pdots、Pdots-RVG、Pdots-RVG-Cur的粒徑分布圖

表1 Pdots、Pdots、Pdots-RVG-Cur不同時(shí)間點(diǎn)的粒徑(nm)

2.2 納米材料的生物相容性

為了研究Pdots-RVG作為載藥體的細(xì)胞毒性，用濃度梯度的Pdots-RVG處理MN9D細(xì)胞和b.End3細(xì)胞48 h,用CCK-8分別檢測(cè)兩種細(xì)胞的存活率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著藥物濃度的增加，兩種細(xì)胞的存活率均下降。在10 mg/L時(shí)，MN9D細(xì)胞和b.End3細(xì)胞的存活率分別為95.1%、94.8%，均高于90.0%。當(dāng)藥物濃度達(dá)到50 mg/L時(shí)，MN9D細(xì)胞和b.End3細(xì)胞的存活率分別為84.5%、80.2%，仍高于80.0%(圖4)。Pdots-RVG表現(xiàn)出較低的細(xì)胞毒性。

圖4 不同濃度Pdots-RVG對(duì)細(xì)胞的損傷作用

2.3 BBB體外模型的建立與評(píng)價(jià)

將b.End3細(xì)胞以每孔8×104個(gè)/cm2的密度接種在涂有鼠尾膠原Ⅰ的小室的PET膜上,12 h后光鏡下觀察到小室內(nèi)無懸浮細(xì)胞，說明細(xì)胞已貼附生長(zhǎng)在PET膜上，此后每隔24 h行一次4 h試漏實(shí)驗(yàn)。

2.3.1 4 h試漏實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞貼膜生長(zhǎng)后，每隔24 h行1次4 h試漏實(shí)驗(yàn)。觀察到在細(xì)胞接種第96 h時(shí)，4 h試漏實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組小室內(nèi)外液面差在4 h后能保持相對(duì)穩(wěn)定，且>0.5 cm, 而未接種細(xì)胞的空白對(duì)照組4 h后，小室內(nèi)、外液面差消失，內(nèi)外液面齊平(圖5)。結(jié)果說明此時(shí)細(xì)胞已生長(zhǎng)融合足夠緊密，形成了致密的細(xì)胞層，對(duì)液體有一定的屏障作用，阻隔了液體間的流動(dòng)。將此小室用于下步FLU通透性檢測(cè)。

圖5 4 h試漏實(shí)驗(yàn)

2.3.2 FLU通透性檢測(cè) 由FLU標(biāo)準(zhǔn)曲線可知， FLU濃度與其吸光度值有較好的相關(guān)性，可以通過吸光度值間接反映FLU的濃度(圖6 A)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及通透率計(jì)算公式計(jì)算兩組的通透率，模型組FLU通透率48.52%，對(duì)照組FLU通透率90.67%(圖6 B)。模型組通透性明顯低于空白對(duì)照組(P<0.001)，說明模型對(duì)小分子物質(zhì)具有一定的阻隔作用，模型組具有較低的通透性，體外BBB模型建立成功，用于下步細(xì)胞攝取Cur、Pdots-RVG-Cur的實(shí)驗(yàn)。

圖6 熒光素鈉通透性測(cè)試

2.4 藥物透過BBB體外模型被神經(jīng)元攝取情況

將成功建立BBB體外模型的細(xì)胞小室移至種植有MN9D細(xì)胞的24孔板內(nèi)。向小室上層分別加入培養(yǎng)基、含Cur的培養(yǎng)基、含相同Cur濃度的Pdots-RVG-Cur的培養(yǎng)基，孵育48 h后，于CLSM下觀察MN9D細(xì)胞對(duì)藥物的攝取情況(圖7)。Cur和Pdots-RVG-Cur均能穿過BBB模型進(jìn)入小室下層被MN9D細(xì)胞攝取，且Pdots-RVG-Cur組細(xì)胞顯示出比相同濃度游離的Cur組細(xì)胞更強(qiáng)的紅色熒光。結(jié)果表明Pdots-RVG-Cur和游離的Cur均能透過體外BBB模型，用Pdots-RVG包裹Cur相比于游離Cur更容易被細(xì)胞攝取，Pdots-RVG增加了Cur的生物利用度；這可能是因?yàn)镻dots的包裹提高了疏水性Cur的溶解度和分散性，而RVG不僅能與神經(jīng)元上特異受體結(jié)合，使納米顆粒進(jìn)入神經(jīng)元，還可以介導(dǎo)納米顆粒穿過BBB。

圖7 CLSM下觀察體外BBB模型中MN9D細(xì)胞對(duì)藥物的攝取情況

3 討論

隨著我國(guó)人口老齡化程度逐年加重，阿爾茲海默病、帕金森病、肌萎縮側(cè)索硬化等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病人群逐年增加[9-10]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療進(jìn)展緩慢，主要的障礙之一是由于血腦屏障限制了治療藥物向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的有效遞送。因此，開發(fā)各種載藥系統(tǒng)，使藥物能穿過血腦屏障進(jìn)入腦部病灶部位發(fā)揮療效是神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療的研究熱點(diǎn)。

在靶向腦藥物的開發(fā)領(lǐng)域中，納米材料由于其生物學(xué)特性而具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。Pdots作為一種新型的納米探針，擁有作為藥物載體的開發(fā)潛力。首先，Pdots具有低毒性，較高的生物相容性，保證了其藥物安全性。其次，Pdots具有疏水性，可利用載體的屏蔽作用包裹并保護(hù)藥物。除此之外，Pdots表面帶電荷，使得其易于與藥物結(jié)合。同時(shí)，Pdots還擁有較高比表面積(即單位質(zhì)量物料所具有的總面積)，提示其作為藥物載體能獲得較高的藥物載量[11-18]。然而將其作為藥物載體的研究目前并不多。本研究選用Pdots作為藥物載體裝載靶向分子RVG以及治療性藥物Cur，通過本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了Pdots具有較穩(wěn)定的載藥結(jié)構(gòu)、較低的細(xì)胞毒性以及較好的BBB穿透性。

開發(fā)有效的穿透BBB靶向腦的藥物遞送系統(tǒng)，除了要有藥物載體之外，還要有腦靶向遞送策略。藥物遞送入腦主要有以下3種方式：1)吸附介導(dǎo)的跨血腦屏障轉(zhuǎn)運(yùn);2)細(xì)胞穿膜肽介導(dǎo)的跨BBB轉(zhuǎn)運(yùn)；以上兩種方法都并不是特異靶向到腦部。3)受體或轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)胞吞實(shí)現(xiàn)跨BBB轉(zhuǎn)運(yùn)。RVG29是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種存在于狂犬病毒糖蛋白上一段29個(gè)氨基酸序列的多肽，該段多肽能被神經(jīng)元表面表達(dá)的尼古丁乙酰膽堿受體特異性地識(shí)別最終使得狂犬病毒穿過BBB[19-20]。本研究構(gòu)建的Pdots-RVG-Cur載藥系統(tǒng)中，RVG29作為靶向遞送分子，發(fā)揮了協(xié)助藥物穿透BBB，并增強(qiáng)神經(jīng)元對(duì)藥物的攝取的作用。

本研究通過構(gòu)建上層為BBB模型，下層為MN9D細(xì)胞的體系，探究向上層加藥物后，下層細(xì)胞內(nèi)是否能觀察到此藥物，以此模擬藥物在人體內(nèi)透過血腦屏障進(jìn)入神經(jīng)元的過程。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Pdots-RVG-Cur和游離的Cur均能透過體外BBB模型，但用Pdots-RVG包裹Cur后，相比于游離Cur，穿透BBB并被細(xì)胞攝取Cur的量更多。這說明Pdots-RVG作為載藥體，提高了Cur的生物利用度，揭示Pdots的包裹提高了疏水性Cur的溶解度和分散性，從而提高Cur在溶液中的穩(wěn)定性。并且，RVG作為腦靶向分子，能夠增加藥物系統(tǒng)穿透BBB效率。

綜上所述，選用RVG29作為腦靶向分子，將其與作為載體的Pdots相連接，建立Pdots-RVG藥物遞送系統(tǒng)，并裝載神經(jīng)保護(hù)性藥物Cur，利用RVG29與BBB上受體結(jié)合介導(dǎo)的穿胞作用以及Pdots的藥物包封作用，實(shí)現(xiàn)將Cur載藥系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)至腦部的效果，為后續(xù)開發(fā)Cur類神經(jīng)治療性藥物提供新的思路。