益生菌對微生態(tài)系統(tǒng)的改善作用及其應用研究進展

張彥位,路江浩,鄢夢潔,趙 星,張士成,楊玉紅,楊 玲,何 方,趙林森,*

(1.河北一然生物科技有限公司,河北石家莊 050000; 2.四川大學華西公共衛(wèi)生學院,四川成都 610041)

圖1 益生菌、腸道菌群和宿主,三者之間的互作關(guān)系[10]Fig.1 Interaction between intestinal flora,host,and probiotics

隨著生活水平的提高和健康意識的增強,人們疾病醫(yī)學的理念逐漸轉(zhuǎn)向“防-治-養(yǎng)”的健康醫(yī)學[1]。在此背景下,益生菌產(chǎn)業(yè)迅猛發(fā)展。歐睿數(shù)據(jù)調(diào)查顯示,我國2017年益生菌的市場規(guī)模約455億元,預計2022年將增長至896億元;目前,消費者對益生菌的認知率已約達72%。所以,益生菌產(chǎn)業(yè)在我國擁有非常廣闊的市場前景。

益生菌(Probiotics)是指攝取足夠量時對宿主具有益處的活性微生物[2]。聯(lián)合國農(nóng)業(yè)組織/世界衛(wèi)生組織規(guī)定益生菌需滿足以下六個特性:耐酸、耐膽鹽;能夠粘附于人體上皮細胞;能夠在腸道定殖;代謝生成抗菌物質(zhì);具有優(yōu)良的生長特性;對人體產(chǎn)生健康益處[3]。按照菌株的種屬進行分類,益生菌包括傳統(tǒng)益生乳酸菌、非乳酸菌益生菌和二代益生菌(Next Generation Probiotics,NGP)三大類。傳統(tǒng)益生乳酸菌中除乳桿菌和雙歧桿菌外,還包括乳球菌、片球菌、腸球菌和鏈球菌等;非乳酸菌益生菌確立于人們長久的飲食習慣以及對其功能和安全性的長期論證的基礎(chǔ)上,括布拉迪酵母、凝結(jié)芽孢桿菌、丁酸梭菌、納豆芽孢桿菌和大腸桿菌Nissle1917等;NGP指在人體發(fā)揮特殊功效卻難以培養(yǎng)的一類微生物,包括Akkermansiamuciniphila、脆弱擬桿菌、解木聚糖擬桿菌、柔嫩梭菌和多型擬桿菌等[4]。研究者通過體外和動物實驗明確益生菌的作用機制,并經(jīng)人群試驗驗證益生菌的功能[5]。目前,益生菌的功能研究主要集中在對腸道菌群和腸道健康的調(diào)節(jié)上,在口腔和陰道菌群方面正逐步被關(guān)注和證實。

1 益生菌改善微生態(tài)系統(tǒng)

2007年底,美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)啟動了—“人類微生物組計劃”,旨在通過描繪人體不同器官中微生物元基因組圖譜,來解構(gòu)宿主-微生物組的互作機制[6]。微生物群在人類出生時就已形成,之后隨著喂養(yǎng)方式和日常飲食的改變而不斷發(fā)展,最終在口腔、腸道、泌尿生殖道和皮膚等器官組織建立起成熟的微生態(tài)系統(tǒng)[7]。微生態(tài)系統(tǒng)與人類共同進化,與組織細胞相互作用,輔助組織器官發(fā)揮正常的功能[8]。高糖/高脂飲食、不良生活習慣以及環(huán)境因素等均會使人體微生態(tài)系統(tǒng)失衡,進而導致一系列的不適癥或疾病,威脅人體健康[9]。許多研究表明益生菌經(jīng)引種、定殖、持續(xù)生長和影響微生態(tài)系統(tǒng)四個步驟,與宿主和原駐菌群進行復雜的互作反應,維護微生態(tài)系統(tǒng)的平衡,保護機體的正常功能[10],具體作用機制見圖1。

1.1 益生菌改善口腔微生態(tài)系統(tǒng)

口腔是一個由700多種細菌定殖的特殊微生態(tài)系統(tǒng)[11]。當內(nèi)在或外在因素變化造成口腔中的微生態(tài)系統(tǒng)失衡時,會引發(fā)多種常見的口腔疾病,如齲齒、牙周病和口臭等[12]。常見的口腔病源微生物有變異鏈球菌、牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌等[12]。益生菌改善口腔健康的機制:與致病菌競爭粘附空間、養(yǎng)分,產(chǎn)生抗菌化合物,增強宿主免疫反應等[13]。

唾液鏈球菌K12作為全球范圍內(nèi)公認的口腔益生菌,目前已擁有30多篇臨床研究,在咽喉炎、扁桃體炎、口臭、中耳炎、牙周疾病、念球菌感染、牙齦炎和念球菌感染等多種口腔疾病的治療與預防方面發(fā)揮著重要作用[14]。研究證實,鼠李糖乳桿菌LR863可有效抑制變異鏈球菌、戈登鏈球菌、牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌和伴放線放線桿菌的活性,同時具有較強自凝集能力,是優(yōu)良的口腔益生備選菌株。唾液乳桿菌能夠有效抑制變異鏈球菌和白色念珠菌致齲齒生物膜的形成,降低生物膜的生物量以及細菌和真菌數(shù)量[15];唾液乳桿菌WB21可以改善患者口臭的各項指標[16]。羅伊氏乳桿菌干預可使患者的齦溝液量、菌斑指數(shù)、牙周探診深度和牙齦指數(shù)等各項指標發(fā)生明顯好轉(zhuǎn),使炎癥因子(白細胞介素)的濃度下降[17]。

1.2 益生菌改善腸道微生態(tài)系統(tǒng)并間接影響代謝類、免疫相關(guān)和精神性疾病

腸道菌群是目前研究最多的人體微生態(tài)系統(tǒng),它們依靠厭氧或兼性厭氧發(fā)酵將食物中的碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)換成有機酸等終產(chǎn)物,保證腸道代謝活動的順利進行[18]。由于pH、底物濃度、氧化還原電勢和傳輸時間的不同,腸道內(nèi)不同解剖區(qū)域的菌群組成會有所不同[7]。應用宏基因組學的方法可以揭示腸道菌群與人體新陳代謝之間復雜的相互關(guān)系[19]。當不良飲食習慣、衰老、有害微生物感染、藥物、手術(shù)以及營養(yǎng)不良等因素對腸道菌群造成破壞時,人體會出現(xiàn)一系列急或慢性疾病[9],包括腸道相關(guān)疾病(便秘、腹瀉、腸易激綜合癥)、代謝類疾病(糖尿病、心腦血管疾病、肥胖)、免疫相關(guān)疾病(慢性腸炎、腸道腫瘤、哮喘、過敏)和精神性疾病(自閉癥、抑郁癥、阿爾茲海默癥)等[20]。

1.2.1 益生菌改善便秘、腹瀉和腸易激綜合癥 腸道疾病主要包括慢性便秘、腹瀉和腸易激綜合征(irritable bowel syndrome,IBS))等,嚴重影響生理和心理健康[20]。慢性便秘多是由生活規(guī)律、飲食習慣發(fā)生改變或服用某種藥物引發(fā)的。益生菌緩解便秘的機制包括:生成短鏈脂肪酸(SCFA),刺激腸嗜鉻細胞分泌五羥色胺,作用于平滑肌相應的受體,增加腸道蠕動;生成SCFA還能夠增加腸道調(diào)節(jié)性T細胞比例,緩解腸道炎癥;生成氣體(CH4或H2)直接刺激中樞神經(jīng),增加腸道蠕動,緩解便秘[21-23]。動物雙歧桿菌乳雙歧亞種BB-12在緩解便秘方面效果顯著[24-25];口服兩歧雙歧桿菌TMC3115增加便秘人群的排便次數(shù)的同時,還可減少腸鳴的頻率、改善糞便的不良氣味[26]。接受抗生素治療的患者多伴有腹瀉的情況,益生菌干預使得患者的腹瀉發(fā)生頻率、持續(xù)時間和水樣便的比例均顯著降低,癥狀明顯減輕[27];但最近研究發(fā)現(xiàn),針對使用抗生素后的健康人群的益生菌干預不利于菌群復原[28],考慮其菌株的選擇存在不嚴謹性,對該結(jié)果應辯證看待。微生態(tài)制劑-久久暢-由益生元(菊粉、水蘇糖)和多菌株(植物乳桿菌LP45、嗜酸乳桿菌La28、干酪乳桿菌YMC1069和兩岐雙歧桿菌TMC3115)組成,可改善便秘和腹瀉人群腸道菌群的多樣性,增加SCFA代謝相關(guān)菌株的豐度,使菌群結(jié)構(gòu)趨向于健康人群[29]。益生菌干預可有效緩解腹痛和腹脹,顯著降低IBS患者不適癥狀的評分[30-31]。羅伊氏乳桿菌DSM 17938不僅可以顯著降低兒童急性腹瀉的復發(fā)率,使兒童平均身高增加[32]，還可有效緩解母乳喂養(yǎng)嬰兒的腸絞痛,明顯縮短嬰兒哭鬧的時間[33]。益生菌在調(diào)節(jié)腸道菌群和緩解腸道疾病方面發(fā)揮著積極有效的作用,且具有強有力的證據(jù)支撐。

1.2.2 益生菌改善糖尿病、肥胖和心腦血管疾病 代謝類疾病是指因代謝障礙或代謝旺盛等原因引發(fā)的疾病,主要包括:糖尿病、心血管疾病和肥胖等[34]。糖尿病(diabetes mellitus)是一組由遺傳和環(huán)境因素相互作用引起的,以高血糖為主要標志的臨床綜合征[35]。菌群分析發(fā)現(xiàn)Akk菌的豐度與糖尿病呈負相關(guān),表明Akk菌具有潛在的保護作用。Akk菌可能通過促進1型糖尿病患者產(chǎn)生黏液,使腸道層增厚[36];或促進Foxp3+Treg、IL-10、TGF-β的分泌來減少胰島炎癥,進而發(fā)揮保護作用[37]。Akk菌與雙歧桿菌代謝生成SCFA,與胰島素抵抗和2型糖尿病呈負相關(guān);而菌群衍生的氨基酸代謝物-丙酸咪唑-不利于細胞對胰島素的應答,進而促進胰島素抵抗[38]。確立特定細菌及其代謝產(chǎn)物與營養(yǎng)物質(zhì)和代謝疾病的關(guān)聯(lián),有助于新療法的開發(fā)。女性妊娠階段對胰島素需求量增加,當胰島素分泌受限時會引發(fā)妊娠期糖尿病,嚴重威脅孕婦和胎兒的健康[39]。鼠李糖乳桿菌HN001可有效降低女性(孕24～26周)妊娠期糖尿病的患病率,尤其是針對高齡或有妊娠糖尿病病史的孕婦[40]。

心腦血管疾病是指由于高脂血癥、血液黏稠、動脈粥樣硬化、高血壓等所導致的心臟、大腦及全身組織發(fā)生的缺血性或出血性疾病,已是全球范圍內(nèi)威脅人類健康的主要疾病。血清中膽固醇含量過高是引發(fā)心血管疾病的主要原因[41]。腸道菌群影響甘油三酯和高密度脂蛋白膽固醇代謝,調(diào)節(jié)膽固醇逆轉(zhuǎn)運途徑[42]。腸道菌群代謝產(chǎn)物參與調(diào)控宿主心血管健康與疾病,其中SCFA和膽汁酸有助于宿主心血管健康,而氧化三甲胺則會導致形成動脈粥樣硬化和血栓[43]。直接調(diào)控菌群理論上可重塑健康菌群促進心血管健康,但目前人群試驗效果不明顯,仍無推薦的臨床處方。益生菌通過共沉淀作用,促進宿主膽固醇代謝和菌體吸附/吸收膽固醇[44]。研究表明兩歧雙歧桿菌TMC3115可促進糖尿病患者血清膽固醇代謝,改善血脂代謝異常[45];分離自內(nèi)蒙古傳統(tǒng)奶酪制品的植物乳桿菌LP45的膽固醇降解率高達80.2%[46]。植物乳桿菌LP45和鼠李糖乳桿菌LR519可有效緩解酒精性慢性肝損傷小鼠的炎癥反應,改善肝損傷[47];Akk菌通過增加腸道黏液厚度和緊密連接蛋白的表達,預防性減少肝損傷、脂肪肝和酒精誘導的腸泄露[48];滅活Akk菌可顯著降低血漿總膽固醇,減少白細胞計數(shù)和血液脂多糖,改善肝臟疾病及組織和肌肉損傷的血液標志物水平,效果顯著優(yōu)于活菌[49]。

肥胖與糖尿病、心腦血管疾病、癌癥、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、肌肉骨骼疾病和呼吸道疾病等均存在因果關(guān)系。醫(yī)學雜志《柳葉刀》的調(diào)查顯示,截止2017年我國肥胖人口數(shù)量位居世界首位,平均肥胖率已達12%[50]。肥胖與腸道菌群的時空動態(tài)密切相關(guān),肥胖誘導菌群像“肥胖型”轉(zhuǎn)化的同時菌群的節(jié)律性變化會經(jīng)血清聚胺影響宿主的生物鐘和代謝節(jié)律[51]。腸道菌群一方面直接與腸道局部組織互作,通過促進能量吸收、重編結(jié)腸基因表達、改變腸內(nèi)細胞釋放的活性分子、削弱腸道屏障、誘發(fā)低度炎癥等影響肥胖;另一方面間接與遠端器官作用影響肥胖,其中脂多糖(LPS)和SCFA可作用于脂肪組織,LPS、膽汁酸、SCFA、乙醇和膽堿等作用于肝臟,菌群產(chǎn)生的活性物質(zhì)經(jīng)腸-腦軸可作用于大腦[52]。研究證實,嚴重肥胖個體(BMI>30)的Akk菌的豐度顯著降低[49];滅活Akk菌可能通過降低小鼠對碳水化合物的吸收和增加機體能量消耗兩方面來發(fā)揮減重的功效[53];飲用富含干酪乳桿菌Shirota的養(yǎng)樂多可增加肥胖兒童糞便中乙酸的濃度和雙歧桿菌的豐度,改善脂質(zhì)代謝,使體重明顯趨于正常標準[54];兩歧雙歧桿菌TMC3115具有抑制3T3-L1前脂肪細胞成脂分化的功能,可預防肥胖[55]。益生菌、合生元、糞菌移植和飲食靶向影響菌群及其代謝物,是治療肥胖的新思路。

1.2.3 益生菌改善腸炎、呼吸道炎癥和過敏 免疫反應是人體自我保護的重要機制。腸道菌群可以通過TLR信號通路調(diào)控粘膜炎癥及免疫耐受,或者通過代謝產(chǎn)物(SCFA等)調(diào)節(jié)Treg與Th17細胞的平衡,以維持免疫穩(wěn)態(tài)[56]。采用益生菌對菌群進行干預,可通過免疫排斥、免疫排除和免疫調(diào)節(jié)等方式增強機體的免疫功能[57]。Akk菌是Treg識別的抗原表位的主要來源,可促進結(jié)腸中的胸腺來源的Treg的增殖,進而緩解結(jié)腸炎小鼠的相關(guān)癥狀,延長生存期[58];口服滅活Akk菌或其外膜蛋白Amuc-1100一方面可減少巨噬細胞和細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的結(jié)腸浸潤,緩解小鼠的結(jié)腸炎;另一方面能夠增加結(jié)腸和腸系膜淋巴結(jié)中CTL的數(shù)量,上調(diào)TNF-α的表達,抑制PD-1的表達,改善結(jié)腸炎相關(guān)的結(jié)腸癌[59]。分離自健康嬰兒糞便的脆弱擬桿菌能夠抑制坂岐克羅諾桿菌對大鼠腸道上皮細胞的黏附,抑制NLRP3炎性體通路的活性,增強抗炎細胞因子的表達,具有預防壞死性小腸結(jié)腸炎的功效[60];南方醫(yī)科大學分離的脆弱擬桿菌SK08在調(diào)節(jié)腸道菌群治療抗生素導致的腹瀉、副溶血弧菌引起的腸道感染和坂崎腸桿菌誘導的腸炎方面效果顯著,其有望成為一種活體生物藥[61]。而產(chǎn)腸毒素的脆弱擬桿菌屬于人體致病共生菌,其分泌的毒素能夠刺激結(jié)腸上皮細胞產(chǎn)生IL-17粘膜免疫應答,促使結(jié)腸上皮細胞增殖癌變,并聚集促腫瘤的髓細胞浸潤末端結(jié)腸,加劇腫瘤的形成[62]。因此,研究過程中應充分重視菌株的特異性和安全性。

上呼吸道感染是包括鼻腔、咽或喉部急性炎癥的總稱,嚴重影響人的日常健康[63]。益生菌可顯著促進免疫蛋白的表達和免疫因子的釋放,降低炎癥的發(fā)生率,縮短發(fā)病的時間[64]。研究表明,植物乳桿菌LP45可促進Caco-2細胞表達IL-6和IL-8,可使小鼠巨噬細胞(J744.1)IL-6的表達量達110 ng/mL,提高免疫力[46];Akk菌可減少患有呼吸道疾病小鼠的嗜酸性粒細胞的數(shù)量,降低IL-4和IL-5水平,緩解呼吸道炎癥[65]?！斑^敏”是一種敏感的免疫系統(tǒng)狀態(tài),而非一種特殊的疾病實體[57]。服用益生菌可顯著緩解吸入物(花粉)過敏和食物(牛奶蛋白、花生)過敏,改善炎癥,提高患者的生活質(zhì)量[66]。研究表明,益生菌代謝生成的D-色氨酸具有免疫活性,能夠增加小鼠肺和腸道的Treg,降低肺部的Th2反應,緩解呼吸道炎癥[67];嗜酸乳桿菌La28可顯著降低OVA致敏小鼠Th2細胞因子(IL-6)的含量,可能具有抗過敏的功能[68];兩歧雙歧桿菌TMC3115可顯著緩解抗生素對新生小鼠腸道菌群多樣性的破壞,調(diào)節(jié)SCFA代謝,促進免疫系統(tǒng)的發(fā)育,進而降低新生小鼠對IgE介導的過敏反應的敏感性[69]。

1.2.4 益生菌改善自閉、抑郁和阿爾茲海默癥 腸-腦軸是一個通過菌群代謝物和迷走神經(jīng)進行的關(guān)于食物、認知行為和精神壓力的雙向交流網(wǎng)絡(luò)。腸道菌群主要通過膳食成分、神經(jīng)遞質(zhì)、尚未明確鑒定的代謝產(chǎn)物和對神經(jīng)遞質(zhì)藥物的影響幾方面調(diào)節(jié)神經(jīng)元活動。膳食成分會影響腸道菌群代謝生成SCFA和膽汁酸等,進而影響宿主神經(jīng)元的活動。越來越多的研究證實腸道微生物代謝生成的神經(jīng)遞質(zhì)(乙酰膽堿、去甲腎上腺素、5-羥色胺、γ-氨基丁酸和多巴胺等)會影響宿主行為,但仍缺乏微生物組-腸道-神經(jīng)元信號傳導的證據(jù);腸道微生物特定的代謝產(chǎn)物(9-10亞甲基棕櫚酸、12-甲基肉豆蔻酸等)能夠激活神經(jīng)元表達神經(jīng)遞質(zhì);腸道菌群能夠生成多種代謝藥物的酶,影響宿主對藥物的生物利用度[70]。許多神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂引發(fā)的精神學并發(fā)癥(睡眠障礙、自閉、抑郁、精神焦慮和阿爾茨海默癥等)常伴有腸道菌群結(jié)構(gòu)和多樣性的損害,并表現(xiàn)出腹痛、腹瀉等癥狀[71]。研究者發(fā)現(xiàn),短雙歧桿菌、長雙歧桿菌、瑞士乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、嗜酸乳桿菌和脆弱擬桿菌等可有效改善自閉癥患者或小鼠模型的社交障礙[72-73]。益生菌干預可使患者或小鼠模型在抑郁和焦慮量表的評分明顯降低[74-76]。海馬神經(jīng)元與人的記憶能力密切相關(guān),兩歧雙歧桿菌TMC3115和鼠李糖乳桿菌LGG能夠增強海馬神經(jīng)元的活性,促進神經(jīng)元突觸功能的發(fā)育[77]。生命早期高脂飲食(HFD)引發(fā)的肥胖會損傷下丘腦依賴的學習和記憶能力,減少腸道菌群中Akk菌的豐度;補充Akk菌可顯著降低HFD小鼠模型的下丘腦小膠細胞增生和炎癥性細胞因子的表達,緩解學習和記憶缺陷[78]。但是由于方法學的限制,統(tǒng)一的評價標準和相對長期實驗研究證據(jù)的缺乏,益生菌在改善精神學疾病方面的功效和作用機制仍需深入探索。

1.3 益生菌改善生殖道微生態(tài)系統(tǒng)

陰道菌群作為人體微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分,在維護生殖健康方面發(fā)揮著重要作用。陰道菌群的組成相對簡單,以乳桿菌為主(每克陰道液中菌群的數(shù)量為108CFU)[79],其中卷曲乳桿菌最為常見。目前已知的益生菌維持陰道菌群穩(wěn)態(tài)的作用機理包括:(1)代謝產(chǎn)生乳酸,維持陰道酸性環(huán)境(pH4.0左右)[80];(2)代謝產(chǎn)生H2O2,抑制病源微生物(大腸桿菌和沙門氏菌等)的增殖[81];(3)與致病菌競爭粘附位點,保護子宮頸內(nèi)膜的完整性[82]。

陰道炎是最常見的女性陰道健康疾病,是許多常見性傳播疾病的風險因子,主要致病菌有白色念珠菌、陰道加德納菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和白色假絲酵母菌等[83]。卷曲乳桿菌及其培養(yǎng)液上清均能夠顯著抑制白色念珠菌ATCC 10231的生長、菌絲的形成及毒性相關(guān)基因的表達[84]。體外細胞實驗證實,卷曲乳桿菌能夠特異性抑制陰道加德納菌毒素的表達,緩解其對HeLa細胞的毒害[85];卷曲乳桿菌可促進血管內(nèi)皮生長因子的表達,加速受損陰道上皮細胞的再生與愈合,保證陰道上皮細胞系MS74屏障的完整性[86];施用益生菌藥品LACTIN-V(卷曲乳桿菌CTV-05,美國Osel公司),可顯著降低甲硝唑或克林霉素治療陰道炎12周后的復發(fā)率。植物乳酸桿菌LP45和鼠李糖乳酸桿菌LR519可代謝生成H2O2,能有效抑制陰道炎致病菌的增殖。

陰道乳桿菌可增強女性生殖道抗感染能力。研究表明,卷曲乳桿菌BC5可通過改變HeLa細胞膜脂質(zhì)成分并抑制膜上α5整合素亞基的表達,來顯著且特異性地降低沙眼衣原體的感染能力[87];卷曲乳桿菌BC3和加氏乳桿菌BC12產(chǎn)生的胞外囊泡可以減少介導病毒-細胞相互作用的包膜蛋白的暴露,抑制HIV-1病毒附著和注入,保護CD4+T細胞、宮頸-陰道組織和扁桃體組織免受HIV-1感染,為預防HIV-1的性傳播提供了新的思路[88];同時,卷曲乳桿菌為主導時可顯著提高抗HIV藥物(替諾福韋)的療效,使得HIV發(fā)病率降低了61%[89]。

健康的陰道菌群可顯著降低女性妊娠階段自然早產(chǎn)的發(fā)生率[90]。在對未足月胎膜早破的孕婦(孕24～34周)的治療過程中,用加氏乳桿菌和鼠李糖乳桿菌輔助干預,可以將其性成熟期持續(xù)的時間由2.5周延長至5.6周,早產(chǎn)兒體重由2004.8 g增加至2439.1 g[91]。此外,健康的陰道菌群能夠提高試管嬰兒的成功率。子宮內(nèi)膜菌群失衡(非乳酸桿菌占據(jù)主導)會導致受精卵活產(chǎn)率和胚胎成功著床的機率顯著降低[80,92]。雖然陰道菌群對女性健康具有積極的促進作用,但在陰道益生菌菌株選擇和劑量確定方面的研究比較缺乏一致性,與菌群的交互作用仍然需要進一步研究[83]。

綜上,雖然很多基礎(chǔ)、臨床前和臨床研究都表明特定的益生菌菌株或組合對特定的適應癥有效,但由于臨床研究規(guī)模小、受試人群的局限性、或者試驗設(shè)計的不合理性,支持益生菌功效的臨床數(shù)據(jù)仍比較缺乏。由于菌群及其與宿主互作的復雜性、分析和評價方法的不準確性以及體內(nèi)研究的困難性使得益生菌在分子和細胞水平的作用機制仍不清晰。此外,由于服用益生菌存在不適癥(產(chǎn)氣、腹脹、便秘和頭痛等)以及免疫系統(tǒng)低下、靜脈插管或急性胰腺炎病人不宜服用益生菌的情況,益生菌臨床研究中的安全性/危害性報告還普遍缺乏。因此,更加完善和具有說服力的臨床研究、深入菌株和生物學機制層面、重視益生菌干預的安全性評估和個性化益生菌干預方法等是未來益生菌科研和轉(zhuǎn)化研發(fā)的重點方向。

圖2 常駐細菌群落對女性生殖道微環(huán)境的調(diào)節(jié)作用[83]Fig.2 Regulation of resident bacterial communities on the female reproductive tract microenvironment

2 益生菌的應用研究

隨著營養(yǎng)科學和預防醫(yī)學理念的不斷提升,消費者對益生菌的認可度逐年增加,益生菌相關(guān)產(chǎn)品備受關(guān)注。市場需求的大幅增加亦推動著益生菌產(chǎn)品的多元化。目前,益生菌產(chǎn)品主要包括膳食補充劑、食品、藥品以及化妝品等。益生菌產(chǎn)品的功效與菌株的種類、活性有很大關(guān)系,然而,由于益生菌具有顯著的菌株和宿主特異性[93],且宿主的飲食、生活習慣和原駐微生物菌群等都會影響益生菌的活性與功能[94],所以,精準化必將是益生菌產(chǎn)品的發(fā)展趨勢。

益生菌的精準研究是解決益生菌應用過程中異質(zhì)性問題的關(guān)鍵。目標菌株篩選過程中基于表型和靶目標的自下而上的篩選策略可以獲得更為精準的益生菌株[95];收集大量的宿主(遺傳學、人體測量學和免疫分析)和微生物組數(shù)據(jù),并鑒定出可預測定殖抗性和/或健康結(jié)果的生物標志物,能夠預測菌株在不同個體中的療效;在糞便樣本菌群分析的基礎(chǔ)上，需要設(shè)計一些非侵入性的方法，以便更加準確的反應益生菌的定殖情況;最后,還需要開發(fā)相應的算法，對可能干擾益生菌功效的諸多因素進行綜合分析,依據(jù)個體化的參數(shù)提出具有最佳益生效果的益生菌模式。

2.1 益生菌膳食補充劑

目前,市場上常見的益生菌膳食補充劑有凍干粉、膠囊和片劑等幾種形式。膳食補充劑的保質(zhì)期較長,貨架期內(nèi)產(chǎn)品的活菌數(shù)應不小于標簽上所標注的活菌數(shù)[96]。水分活度是影響貨架期內(nèi)益生菌膳食補充劑活菌數(shù)的主要因素。因此,產(chǎn)品在生產(chǎn)過程需嚴格控制溫度和濕度,保證總水活度小于0.2[96]。同時,應避免益生元等成分對產(chǎn)品水分活度的影響,或某些抗菌物質(zhì)對菌株的損害[97]。在益生菌咀嚼片的生產(chǎn)過程中需要通過試驗找到壓片所需的最小壓縮量,避免對菌株造成不必要的損傷[96]。含有多菌株的益生菌產(chǎn)品設(shè)計時需要根據(jù)每一單菌株的穩(wěn)定性來確定其添加量,確保貨架期內(nèi)每一單菌株的活菌數(shù)滿足要求。目前仍需進一步尋找普遍且適用的檢測方法對多菌株產(chǎn)品中單一菌株的質(zhì)量進行控制[98]。

2.2 益生菌食品與飲料

近年來,消費者對“藥片”存在的抵觸心理使得日常攝入益生菌食品和飲料成為一種更自然的保健方式。發(fā)酵乳制品(酸奶、奶酪)作為傳統(tǒng)的益生菌食品,與腸道健康存在密切聯(lián)系。目前,全球范圍內(nèi)廣泛應用于益生菌酸奶的菌株包括動物雙歧桿菌乳雙歧亞種BB-12(Chr. Hansen)、鼠李糖乳桿菌LGG(Valio)、干酪乳桿菌Shirota(Yakult)、干酪乳桿菌CNCMI-1518(Actimel-DANONE)、動物雙歧桿菌乳雙歧亞種CNCMI-2494(Activia-DANONE)等。2019年7月,我國第一大乳企-伊利-宣布將擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的動物雙岐桿菌乳雙歧亞種BL-99添加到旗下益消酸奶系列產(chǎn)品中,主打調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、促進消化的功效。乳制品作為優(yōu)良的營養(yǎng)基質(zhì),發(fā)酵過程中可以保持益生菌的增殖,進而縮減益生菌的菌株成本[96]。益生菌乳品開發(fā)過程中不僅需考慮發(fā)酵溫度、儲存溫度、包裝類型、熱處理、均質(zhì)等工藝步驟[99],以及非乳成分(水果和谷物)對益生菌的影響,還應避免益生菌增殖對產(chǎn)品整體感官特性造成的不良影響。與此同時,近年來消費者對含益生菌的非乳食品的關(guān)注度一直在穩(wěn)步上升。果汁、巧克力、餅干、早餐麥片、零食、薯片、花生醬和脆燕麥棒等都可以作為益生菌非乳食品的基質(zhì),但往往都不利于益生菌的存活[96],因此需要通過試驗找到最佳的配方和包裝形式,保護益生菌的同時不破壞產(chǎn)品的適口性[100]。

表1 國際上處于臨床階段的活體生物藥Table 1 Live biotherapeutic products in clinical stage internationally

2.3 活體生物藥

隨著培養(yǎng)方法、基因組和元基因組測序技術(shù)以及基因組編輯工具的不斷發(fā)展,更多的具有潛在益生效果的益生菌(擬桿菌屬、Akk細菌和工程菌等)被發(fā)現(xiàn),盡管部分仍處于機制研究的早期階段。為避免與其他益生菌產(chǎn)品混淆,科學家傾向于將用于藥品開發(fā)的益生菌稱為“活體生物藥-live biotherapeutic(LBPs)”,也稱為“二代益生菌(NGP)”[4]。2016年FDA頒布了活體生物藥的指南,規(guī)定LBPs是指活的生物(細菌等),適用于預防,治療或治愈人類某種疾病,且不屬于疫苗。LBPs有兩種開發(fā)策略,一是分析特異性菌株在健康宿主中是否存在,并驗證足夠劑量的該菌株能否恢復宿主的健康表型;二是將菌株作為載體,遞送具有緩解疾病或促進健康功效的分子[61]。區(qū)別于其他益生菌產(chǎn)品,LBPs進入市場需遵循嚴格的臨床作用模式,包含安全性評價、藥代動力學、藥效學和1～3期臨床試驗。

目前,國際上進入臨床試驗階段的LBPs有20多種,見表1,其應用方向主要包括消化道、泌尿和皮膚三大系統(tǒng)相關(guān)疾病的治療,但仍處于輔助用藥和聯(lián)合用藥的地位。我國活體生物藥的研究相對滯后,已完成或正處于臨床試驗的活體生物藥只有3種,分別是陰道乳桿菌活菌膠囊(已完成)、SK08活菌散(脆弱擬桿菌,進行中)和陰道用乳桿菌二聯(lián)活菌膠囊(進行中)。目前正處于試驗階段的部分益生菌藥品大多包含雙歧桿菌、乳酸菌、腸球菌和芽孢桿菌等菌株,但由于其在源頭上并未嚴格按照藥物進行開發(fā),所以不屬于目前公認的活體生物藥的范疇。

工程菌作為一種新興的活菌療法,在疾病的診斷和治療領(lǐng)域備受關(guān)注。工程菌療法設(shè)計需要綜合考慮目標菌株選擇、基因回路設(shè)計、患者需求等因素,需要平衡工程菌在目標微環(huán)境中的功能適應性以及生產(chǎn)和臨床開發(fā)的可行性。沙門氏菌、李斯特菌和梭菌屬細菌具有內(nèi)在的腫瘤靶向能力,定向改造后可裝載效應系統(tǒng)向腫瘤輸送細胞毒素或免疫調(diào)節(jié)因子等,能夠?qū)鼓[瘤;目前進入臨床試驗的包括傷寒沙門氏菌、諾氏梭菌和長雙歧桿菌等工程菌株[101]。苯丙酮尿癥患者無法代謝飲食中的苯丙氨酸,影響大腦發(fā)育;工程菌株SYNB1618可在腸道缺氧條件下穩(wěn)定表達苯丙氨酸代謝酶,將苯丙氨酸代謝為反式肉桂酸,進一步被宿主代謝為馬尿酸排出體外,有效緩解模型小鼠的苯丙酮尿癥,臨床試驗也在進行中[102]。此外,基于群體感應原理并結(jié)合合成生態(tài)學的觀點,研究者希望實現(xiàn)工程菌的多功能化,以完成對內(nèi)環(huán)境的監(jiān)測[103]。鑒于腸道菌群的復雜性和宿主特異性,且“健康”菌群的定義尚不明確,工程菌的研究面臨著極大地機遇與挑戰(zhàn)。

2.4 益生菌的微囊化技術(shù)

益生菌產(chǎn)品應用過程中需要一些技術(shù)手段對益生菌進行保護,進而避免各種各樣的應激因素對菌株的存活能力和益生功能造成損害[100]。微囊化是以天然或合成高分子材料為壁材,將益生菌包裹成圓/粒狀微囊的技術(shù),可以有效避免菌株與外界環(huán)境的直接接觸,保證產(chǎn)品的穩(wěn)定性[104]。目前,微囊化的壁材主要包括多糖(海藻酸鹽、植物/微生物膠、殼聚糖、淀粉、卡拉膠和鄰苯二甲酸纖維素酯等)、蛋白質(zhì)(明膠和乳蛋白等)和脂肪等[105-106];微囊化的技術(shù)方法包括噴霧干燥、擠壓、冷凍干燥和離子凝膠等[107-108],見表2。

表2 益生菌微囊化壁材和技術(shù)的研究進展Table 2 Advances in microencapsulated wall materials and technology of probiotics

3 展望

微生態(tài)系統(tǒng)會隨著時間推移和人體健康狀況的改變而改變,一些新型分子生物學工具為描述細菌、真菌和病毒群落以及宿主粘膜免疫反應的復雜性和相互作用機制提供了機會[6]。益生菌在調(diào)節(jié)人體微生態(tài)系統(tǒng),改善健康方面發(fā)揮著重要作用[117],但仍需進一步探索其具體的作用機制。益生菌產(chǎn)品轉(zhuǎn)化過程中需進一步開發(fā)與設(shè)計產(chǎn)品的配方和加工工藝,確保貨架期內(nèi)目標菌株的存活能力,保證產(chǎn)品穩(wěn)定性[96,100],同時,還應注重產(chǎn)品形式的便利性、趣味性和適口性。而對于活體生物藥,一般來說,臨床干預的結(jié)果與產(chǎn)品特定的配方、劑量、臨床終點和目標人群有關(guān)。當某一臨床結(jié)果與特定的作用機制相關(guān)時,可以假設(shè)一個具有相同作用機制的菌株或許有類似的功效。然而,需要重視的是不應對該特定實體的結(jié)論進行過度的概括,必須意識到菌株的特異性[10]。益生菌轉(zhuǎn)化應用的核心主要包括兩方面:有效性和安全性。以腸道菌群、腸屏障功能和免疫狀態(tài)評估為基礎(chǔ),益生菌的應用將更為精準。活體生物藥將成為新藥研發(fā)的熱點,應抓住機遇,發(fā)展新的評價方法,形成新的科學共識,保證我國在這個新興領(lǐng)域的研究同步于甚至超越國際水平。