姜黃素介導的光動力技術對鮮切馬鈴薯的殺菌效果

于金珅,張 芳

(中國海洋大學食品科學與工程學院,山東青島 266003)

隨著馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略的不斷推進,我國馬鈴薯深加工產業(yè)呈現穩(wěn)步發(fā)展之勢。其中,鮮切馬鈴薯加工產業(yè)主要以薯塊、薯條、薯片以及馬鈴薯絲的形式對馬鈴薯進行微加工,不僅可以提升馬鈴薯的附加值,同時產品具有可食率高、食用方便等優(yōu)點[1]。但是,馬鈴薯經切割后,汁液外滲,營養(yǎng)物質流出,為微生物生長繁殖創(chuàng)造了條件。而目前應用于鮮切馬鈴薯的冷殺菌手段大多以添加化學殺菌劑為主,或通過抑菌方式,如低溫冷藏或氣調保鮮等,達到延長鮮切馬鈴薯貨架期的目的[2]。這些技術或難以滿足消費者日益增長的對天然添加劑的需求,或殺菌效果不佳。因此,開發(fā)一種能替代化學殺菌劑對食品中微生物進行有效滅活的冷殺菌方式是鮮切馬鈴薯加工行業(yè)的迫切需求。

光動力技術(Photodynamic technology,PDT),又稱光動力冷殺菌技術[3]、光動力滅菌技術[4],是一種基于光動力反應的新型非熱殺菌方法。光動力反應是光敏劑在特定波長光源激發(fā)下,產生活性氧引起生物分子氧化和細胞損傷的過程[4-5]。20世紀90年代以前,光動力技術主要用于腫瘤的診斷和治療[6]。隨著研究的深入,光動力技術進一步發(fā)展,繼而被應用到皮膚病及牙科疾病等的殺菌治療上[7-8]。近年來,PDT的應用已經不僅僅局限在醫(yī)學領域,作為一種新興的殺菌方法,PDT原料來源廣泛、成本低,唯一需要的能量是光源,滅活微生物過程中不會產生有毒有害物質,并且引發(fā)微生物耐藥性的可能性很小,在食品冷殺菌領域具有潛在的應用價值[8-9]。但目前,尚未見該技術在馬鈴薯深加工產業(yè)中應用的報道。

光敏劑是影響光動力技術殺菌效果的關鍵因素。理想的光敏劑首先應該安全穩(wěn)定、成本低,并且易被適當波長的光激活[10]。其次,作為食品添加劑,它必須滿足以下條件:對人體無害;不破壞食品原有營養(yǎng)成分;不改變食品外觀;符合國家食品添加劑的添加標準[11]。作為一種天然食用色素和食品添加劑,姜黃素在安全性等方面優(yōu)于食品領域中應用的其他光敏劑[2],具有來源廣、成本低、無毒、無污染等優(yōu)點[12]。Penha等[13]研究證實,姜黃素和藍色發(fā)光二極管(LED)結合對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有良好的體外殺菌作用。

本實驗采用以姜黃素為光敏劑的光動力技術處理鮮切馬鈴薯,探討光照功率、光照時間、孵育時間、光敏劑濃度等因素對殺菌效果的影響,以期為光動力技術在鮮切馬鈴薯加工領域進一步應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

馬鈴薯 青島水果市場購入,選取大小均一、無病蟲害和機械損傷、成熟度相仿的新鮮馬鈴薯;大腸桿菌O157∶H7 ATCC 700728、金黃色葡萄球菌ATCC 6538 中國海洋大學食品科學與工程學院提供;食品級姜黃素(純度95%) 陜西慈緣生物科技有限公司;LB瓊脂培養(yǎng)基 國藥集團化學試劑有限公司;無水乙醇(分析純) 天津奧普升化工有限公司;吐溫80(分析純) 國藥集團化學試劑有限公司。

JA2003型電子分析天平 北京賽多利斯儀器有限公司;YXQ-LS-立式壓力蒸汽殺菌器 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠;HCB-900V型垂直層流潔凈工作臺 青島海爾股份有限公司;生化培養(yǎng)箱 韶關市泰宏醫(yī)療器械有限公司;IS-RDS3型疊加式恒溫振蕩器 美國精騏儀器有限公司;SD-1169型果蔬切片機 Lekker儀器有限公司;420 nm LED光源儀 實驗室自制。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種培養(yǎng)及接種 從-4 ℃冰箱取出大腸桿菌和金黃色葡萄球菌細菌菌株,分別接種于LB液體培養(yǎng)基中37 ℃、180 r/min搖床恒溫培養(yǎng)2 h,8000×g離心15 min,棄上清,于30 mL無菌蒸餾水中重懸沉淀,制成菌液備用[14]。

1.2.2 光敏劑配制 稱取0.386 g姜黃素加入1 mL乙醇充分混勻后,移取100 μL加入100 mL水與2 mL吐溫80配置成1 mmol/L姜黃素母液,置于-4 ℃避光保存。實驗時以姜黃素母液稀釋配置不同濃度的姜黃素,現配現用。

1.2.3 鮮切馬鈴薯樣品光動力處理 將新鮮馬鈴薯使用無菌水清洗干凈后,在超凈臺中去皮,切成厚1 mm、直徑3 cm的圓形薄片,置于無菌六孔板中[15],按表1中用量依次加入菌液和姜黃素溶液(20、30、40、50和60 μmol/L)于六孔板,輕微搖晃六孔板使樣品、菌液與姜黃素溶液共同混勻后避光孵育0、15、30、45和60 min。姜黃素最大吸收波長為420 nm左右,因此實驗采用420 nm LED藍光作為光源[14],LED光源儀由實驗室制作完成,包括可調節(jié)的產品托盤、LED燈泡組件和溫度探頭,可調節(jié)光照功率與光照時間。孵育完成后,將六孔板置于光源儀內,調節(jié)面板參數中的光照功率(10、20、30、40和50 W)與光照時間(5、10、15、20、25 min)對樣品進行光動力處理。

表1 鮮切馬鈴薯的光動力殺菌Table 1 Photodynamic sterilization of fresh-cut potatoes

1.2.3.1 光照功率對光動力處理殺菌效果的影響 以姜黃素母液配置30 μmol/L的姜黃素溶液。按上述操作,將姜黃素溶液加入六孔板后,避光孵育15 min,設定不同的光照功率(10、20、30、40和50 W)進行實驗,光照時間設定為15 min。

1.2.3.2 光照時間對光動力處理殺菌效果的影響 以姜黃素母液配置30 μmol/L的姜黃素溶液。按上述操作,將姜黃素溶液加入六孔板后,避光孵育15 min,按照1.2.3.1的最優(yōu)光照功率,調節(jié)光照時間(5、10、15、20、25 min)進行光動力處理。

1.2.3.3 孵育時間對光動力處理殺菌效果的影響 以姜黃素母液配置30 μmol/L的姜黃素溶液。按上述操作,將姜黃素溶液加入六孔板后,避光孵育0、15、30、45和60 min,按照1.2.3.1的最優(yōu)光照功率與1.2.3.2得到的最優(yōu)光照時間進行光動力處理。

1.2.3.4 姜黃素濃度對光動力處理殺菌效果的影響 以姜黃素母液配置20、30、40、50和60 μmol/L的姜黃素溶液。按上述操作,將姜黃素溶液加入六孔板后,以1.2.3.3得到的最優(yōu)孵育時間進行避光孵育、1.2.3.1得到的最優(yōu)光照功率與1.2.3.2的光照時間進行光動力處理。

1.2.4 菌落總數測定 使用平板計數法檢測浸泡液中大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的數量[16]。取0.1 mL稀釋至合適梯度范圍的菌懸液涂板于LB瓊脂培養(yǎng)基上,37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后計數,菌落計數以菌落形成單位(CFU/mL)來表示。

1.3 數據處理

采用Microsoft Office Excel軟件進行數據統(tǒng)計,運用STDEVA函數計算標準偏差,每組做3次平行實驗,結果為3次試驗平均值。

2 結果與分析

2.1 光照功率對光動力處理殺菌效果的影響

如圖1所示,光照功率對大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的殺菌效果影響顯著。光照功率為40 W時對大腸桿菌達到最大殺菌效果,該條件下,與對照組、光照組和姜黃素組相比,實驗組菌落總數分別降低2.84、1.31與2.92 lg CFU/mL,50 W時殺菌效果減弱,與對照組相比,實驗組菌落總數降低1.65 lg CFU/mL。因此確定光動力處理大腸桿菌最優(yōu)的光照功率為40 W。

圖1 不同光照功率對大腸桿菌、 金黃色葡萄球菌的光動力殺菌效果Fig.1 Photodynamic sterilization effect of E. coli and S. aureus under different illumination power

光照功率達到20 W時對金黃色葡萄球菌已得到最大殺菌效果,與對照組、光照組和姜黃素組相比,實驗組菌落總數降低4.69、4.35與4.63 lg CFU/mL,增加光照功率至30、40和50 W時殺菌效果略微下降,與對照組相比菌落總數分別降低4.50、4.17和4.23 lg CFU/mL。因此光動力處理滅活金黃色葡萄球菌的最優(yōu)光照功率為20 W。

在光動力處理滅活大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的過程中,達到最優(yōu)光照功率后,繼續(xù)加大光照功率反而使殺菌效果降低。其原因之一可能是較高的光照功率使光源儀內溫度升高、細菌質膜流動性增加,細菌活力略微提升,從而使光動力處理殺菌效果降低[15]。另一種可能是光照功率的增加產生額外的熱量,加快了細菌繁殖速度,在一定程度上抵消了殺菌進程[17]。Ghate 等[18]研究了光照溫度對LED燈殺菌效果的影響,發(fā)現光照溫度為10、15 ℃時的殺菌效果比20 ℃更好,是由于在較低溫度照射期間細菌膜中不飽和脂肪酸的比例增加,可能對光動力處理產生的活性氧物質的氧化作用更加敏感,進一步證實光照溫度對光動力處理效果的影響。Ghate等[19]還發(fā)現460 nm LED的藍光照射在較低的溫度7、16 ℃時減少鮮切菠蘿表面上沙門氏菌的數量,而在25 ℃時觀察到生長抑制,他們認為這是溫度升高使細菌代謝速率加快所致。

2.2 光照時間對光動力處理殺菌效果的影響

如圖2所示,光照時間對大腸桿菌與金黃色葡萄球菌的殺菌效果影響顯著。在光照時間5～20 min范圍內,隨著光照時間增加光動力處理對大腸桿菌殺菌效果逐漸增加,在20 min時達到最佳效果,與對照組、光照組和姜黃素組相比,實驗組菌落總數降低2.84、1.31和2.92 lg CFU/mL,加長光照時間至25 min時殺菌效果下降,與對照組相比,實驗組菌落總數降低僅有2.16 lg CFU/mL。因此確定大腸桿菌的最優(yōu)光照時間為20 min。

圖2 不同光照時間對大腸桿菌、 金黃色葡萄球菌的光動力殺菌效果Fig.2 Photodynamic sterilization effect of E. coli and S. aureus under different illumination time

光照時間為10 min時,與對照組、光照組和姜黃素組相比,實驗組金黃色葡萄球菌菌落總數降低4.69、4.35及4.63 lg CFU/mL,光照時間為25 min時達到最大殺菌效果,相比對照組,實驗組菌落總數降低4.78 lg CFU/mL。二者的殺菌效果相差不大,且光照時間過長可能造成機體組織的非特異性損傷,因此確定光動力處理滅活金黃色葡萄球菌的最優(yōu)光照時間為10 min。

探究光照時間對光動力處理殺菌效果的影響時發(fā)現光照時間與光動力處理殺菌效果呈現一定的正相關性,但達到最優(yōu)條件后增加光照時間殺菌效果并不會增強。嚴金華等[17]的研究結果與本論文一致,他們研究發(fā)現不同光照時間下(30、60、90、120 s)光動力處理對大腸桿菌的殺菌效果呈先增加后降低的趨勢,殺菌率分別為66.2%、79.3%、76.8%、62.1%。與光照功率同理,光照時間的延長也會導致光照劑量的增加,提高體系溫度。

2.3 孵育時間對光動力處理殺菌效果的影響

如圖3所示,孵育時間對光動力處理殺菌效果有一定影響,但孵育達到一定時間后,殺菌效果沒有明顯提高。與對照組相比,菌液與姜黃素混合均勻后,不進行孵育直接光照,大腸桿菌菌落總數降低1.47 lg CFU/mL,而混合孵育15 min則降低2.84 lg CFU/mL,30 min時降低2.10 lg CFU/mL,45 min時降低3.46 lg CFU/mL,增加孵育時間至60 min時殺菌效果下降,菌落總數降低2.18 lg CFU/mL。孵育時間對大腸桿菌殺菌效果的影響沒有一定規(guī)律,孵育15和45 min都顯示出較高的殺菌效果,但孵育時間過長可能對馬鈴薯造成損傷,因此確定最優(yōu)的光動力滅活大腸桿菌的孵育時間為15 min。

圖3 不同孵育時間對大腸桿菌、 金黃色葡萄球菌的光動力殺菌效果Fig.3 Photodynamic sterilization effect of E. coli and S. aureus under different incubation time

孵育時間對金黃色葡萄球的光動力處理殺菌效果的影響同樣沒有明顯規(guī)律。與對照組相比,不孵育組金黃色葡萄球菌菌落總數降低4.55 lg CFU/mL,孵育15和30 mim時菌落總數均降低4.69 lg CFU/mL,繼續(xù)增長孵育時間至45和60 min殺菌效果反而下降,菌落總數分別降低3.77和3.43 lg CFU/mL,因此滅活金黃色葡萄球菌的最優(yōu)孵育時間為15 min。

在探究孵育時間對光動力處理殺菌效果的影響時發(fā)現,增加孵育時間至60 min時大腸桿菌的殺菌效果反而降低,同樣增加孵育時間至45和60 min時光動力處理對金黃色葡萄球菌的殺菌效果也降低。這與Winter等[20]的發(fā)現相一致,他們發(fā)現以5 μmol/L聚乙烯吡咯烷酮姜黃素為光敏劑對金黃色葡萄球菌進行的光動力處理,孵育5 min比25 min有更好的殺菌效果,這種效應可能是因為在較長的孵育時間引發(fā)光敏劑發(fā)生衰變或形成無效的聚集體,導致總體光敏劑濃度降至發(fā)揮光敏殺菌作用的臨界值以下。Stanislaw等[21]同樣發(fā)現孵育時間過長會降低光動力處理的殺菌效果,即使用光動力技術對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌進行殺菌時,孵育時間90 min時達到最大殺菌效果(菌落總數降低6 lg CFU/mL),增加孵育時間至180 min時殺菌效果反而降低,這可能與細菌對光敏劑的代謝有關。

2.4 姜黃素濃度對光動力處理殺菌效果的影響

如圖4所示,姜黃素濃度對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的光動力處理殺菌效果沒有明顯影響。在姜黃素濃度為30 μmol/L時,與對照組相比,大腸桿菌菌落總數降低3.60 lg CFU/mL;姜黃素濃度為40 μmol/L時,則對應降低2.84 lg CFU/mL,殺菌效果弱于30 μmol/L;在姜黃素濃度為50 μmol/L時達到最大殺菌效果,菌落總數降低3.76 lg CFU/mL,增加姜黃素濃度至60 μmol/L時殺菌效果略微下降,菌落總數降低3.12 lg CFU/mL。姜黃素濃度為30、50 μmol/L的殺菌量相差0.16 lg CFU/mL。且光敏劑濃度過高可能造成機體組織的非特異性損傷,因此確定光動力處理滅活大腸桿菌的最優(yōu)濃度為30 μmol/L。

圖4 不同姜黃素濃度對大腸桿菌、 金黃色葡萄球菌的光動力殺菌效果Fig.4 Photodynamic sterilization effect of E. coli and S. aureus under different curcumin concentration

在姜黃素濃度為30 μmol/L時達到金黃色葡萄球菌最大殺菌效果,與對照組相比,實驗組菌落總數降低5.23 lg CFU/mL,增加姜黃素濃度至40、50和60 μmol/L時殺菌效果略下降,菌落總數分別降低5.19、5.20和4.69 lg CFU/mL。因此確定光動力處理滅活大腸桿菌的最優(yōu)姜黃素濃度為30 μmol/L。

實驗發(fā)現姜黃素濃度對光動力處理殺菌效果沒有明顯影響,但較高的姜黃素濃度可能會使殺菌效果降低。大腸桿菌的光動力殺菌效果在40和60 μmol/L時降低,金黃色葡萄球菌的殺菌效果在40、50及60 μmol/L均發(fā)現略微降低。Donnelly等[22]研究發(fā)現過高濃度的光敏劑會產生自我屏蔽作用,可能會阻止有效的光傳輸到光敏劑分子內或接近細菌,可嚴重影響光動力殺菌效率。唐姝姝等[23]研究以亞甲基藍為光敏劑進行對腸出血性大腸桿菌O157光動力處理時發(fā)現,亞甲基藍濃度增加至一定程度后O157菌落數保持動態(tài)平衡,因亞甲基藍無法進入菌落細胞,更高的光敏劑濃度使得殺菌效果下降。

此外,光動力處理大腸桿菌和金黃色葡萄球菌過程中發(fā)現僅單獨LED藍光照射對大腸桿菌也有明顯殺菌效果,對金黃色葡萄球菌幾乎沒有殺菌效果。分析可知,波長為400～480 nm的LED藍光對細菌具有殺菌效果并且與姜黃素光動力處理殺菌原理相似,細菌內存在內源性光敏劑卟啉,卟啉吸收光產生自由基對細菌具有殺菌效果。楊鵬高等[24]發(fā)現460 nm藍光可高效殺滅浮游狀態(tài)大腸埃希菌,殺菌效果隨照射能量的增加而增加,60 J/cm2照射時殺菌率接近50%,至240 J/cm2照射能量時其殺菌效果已達97.11%。同時,姜黃素組殺菌結果證實雖然姜黃素被認為具有一定的殺菌效果,但在本實驗濃度下,不進行光照的姜黃素溶液基本不具備殺菌效果,而姜黃素經光照后具有良好的殺菌效果與光動力殺菌機理有關,光動力技術主要依靠光敏劑受光激發(fā)產生的活性氧殺菌[4-5]。同理,單獨進行光照時,在本實驗光劑量下,殺菌效果有限。通過與姜黃素組與光照組的對比可以排除姜黃素或光照條件對光動力殺菌效果的影響,進一步證實光敏化姜黃素是發(fā)揮良好殺菌效果的原因。

3 結論

姜黃素介導的光動力技術以成本低廉、對人體無毒害的食品添加著色劑姜黃素為光敏劑,在420 nm LED光的激發(fā)下產生大量活性氧,從而起到殺菌、保鮮的功效[25]。本文以鮮切馬鈴薯為研究對象,針對鮮切產品在加工、貯藏過程極易受到病原微生物污染這一問題,采用以姜黃素為光敏劑的光動力技術對其表面大腸桿菌與金黃色葡萄球菌進行殺菌處理,并優(yōu)化光動力處理殺菌條件。實驗數據顯示,姜黃素介導的光動力技術對鮮切馬鈴薯表面大腸桿菌與金黃色葡萄球菌均有良好的殺菌效果,光照功率與光照時間為影響殺菌效果的主要因素,而姜黃素濃度與孵育時間對殺菌效果影響較小。光動力技術對大腸桿菌的最優(yōu)殺菌條件為:光照功率40 W、光照時間20 min、孵育時間15 min、姜黃素濃度30 μmol/L;光動力技術對金黃色葡萄球菌的最優(yōu)殺菌條件為:光照功率20 W、光照時間10 min、孵育時間15 min、姜黃素濃度30 μmol/L。因此姜黃素介導的光動力技術作為一種新興的冷殺菌技術,有望進一步探索其在食品領域殺菌中的應用。