高效液相色譜法測(cè)定食品中維生素K1和維生素K2的含量

孔凡華,郭 倩,白沙沙,徐佳佳,李 東,王 竹,張雪松,崔亞娟,*

(1.北京市營(yíng)養(yǎng)源研究所,北京 100069; 2.中國(guó)疾病預(yù)防控制中心營(yíng)養(yǎng)與健康所,北京 100050)

自然界中維生素K主要以維生素K1和維生素K2兩種形式存在。維生素K1廣泛存在于綠色蔬菜和動(dòng)物內(nèi)臟中,維生素K2主要由微生物代謝產(chǎn)生,少量存在于肉類發(fā)酵性食品中,在納豆中較豐富[1]。根據(jù)側(cè)鏈上異戊二烯基團(tuán)數(shù)量的不同,維生素K2分為不同的亞型,表示為 n烯甲萘醌(MK-n),四烯甲萘醌(MK-4)、七烯甲萘醌(MK-7)、九烯甲萘醌(MK-9)是常見(jiàn)的類型。近些年的臨床研究發(fā)現(xiàn),維生素K具有重要的生物活性和藥用價(jià)值,維生素K1是血液凝固的重要因素,維生素K2具有抗骨質(zhì)疏松和抗動(dòng)脈鈣化的健康效應(yīng)[2-3]。維生素K2的安全性已得到中國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局、美國(guó)FDA、美國(guó)藥品研究所及歐洲議會(huì)和歐盟理事會(huì)的權(quán)威認(rèn)定。2016年,原國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)發(fā)布2016年第8號(hào)公告《關(guān)于海藻酸鈣等食品添加劑新品種的公告》[4],批準(zhǔn)維生素K2(發(fā)酵法,主要成分為MK-7)為食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑新品種,可以用在兒童和孕產(chǎn)婦調(diào)制乳粉中。

國(guó)內(nèi)檢測(cè)維生素K1的標(biāo)準(zhǔn)方法是《GB 5009.158-2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中維生素K1的測(cè)定》[5],第一法為高效液相色譜-熒光檢測(cè)法,第二法為液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法,均適用于各類配方食品、植物油、水果和蔬菜中維生素K1的測(cè)定,尚未建立食品中維生素 K2檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法。文獻(xiàn)報(bào)道維生素 K檢測(cè)的方法主要有高效液相色譜-紫外檢測(cè)法[6-8]、毛細(xì)管電泳法[9]、高效液相色譜-質(zhì)譜法[10-11]等。高效液相色譜-紫外檢測(cè)法[12]前處理方法主要有直接萃取法和薄層純化法,直接萃取法容易受到食品基質(zhì)干擾,導(dǎo)致萃取不完全;薄層純化法前處理復(fù)雜,不適于高通量檢測(cè)。維生素K2在食物中含量較少,紫外檢測(cè)器的選擇性和靈敏度無(wú)法滿足食物中維生素K2檢測(cè)的需求[13]。毛細(xì)管電泳法步驟繁瑣、重現(xiàn)性差,無(wú)法滿足批量檢測(cè)工作的要求。高效液相色譜-質(zhì)譜法雖然靈敏度高,但儀器復(fù)雜、價(jià)格昂貴,不易推廣。

目前,維生素K1的檢測(cè)技術(shù)比較成熟,國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法[5]和AOAC Official Method 999.15法[14]都是利用維生素K1能被鋅粉還原產(chǎn)生具有熒光的產(chǎn)物氫鯤,用熒光檢測(cè)器測(cè)定,方法靈敏度高、特異性強(qiáng)。隨著GB14880-2012[15]已經(jīng)許可來(lái)自納豆的維生素 K2(MK-7)作為食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑使用且其安全性已得到認(rèn)定[16],建立食品中維生素K共性檢測(cè)技術(shù)成為食品行業(yè)發(fā)展需求。如何精準(zhǔn)測(cè)定食品中維生素K的含量既是企業(yè)、科研機(jī)構(gòu)亟需解決的問(wèn)題,也是保障公眾健康的基礎(chǔ)。考慮到維生素K1與維生素K2都是萘醌衍生物,被鋅粉還原后可以產(chǎn)生熒光物質(zhì),可以嘗試用高效液相色譜-熒光檢測(cè)法同時(shí)測(cè)定維生素K1和維生素K2的含量。因?yàn)槭称分芯S生素K含量差異較大,且與脂質(zhì)共存,對(duì)堿比較敏感,所以提取條件是影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的關(guān)鍵因素。脂肪酶可以有效降解食品中的脂質(zhì)成分,利于維生素K的提取,并且可以減少提取過(guò)程中對(duì)維生素K的破壞[17]。Manoury等[18]嘗試采用鹽酸水解方法對(duì)奶酪等試樣進(jìn)行處理,結(jié)果表明酸水解和酶解的提取效果相當(dāng)。正相色譜烷基柱對(duì)脂溶性維生素的保留力太強(qiáng),運(yùn)行時(shí)間過(guò)長(zhǎng),所以,反相色譜法在維生素K的檢測(cè)中應(yīng)用更廣泛[19-20]。本研究參考GB 5009.158-2016[5]、AOAC[14]和文獻(xiàn)方法[21],高脂樣品經(jīng)脂肪酶酶解,異丙醇分散后,用正己烷提取樣品中的維生素K1和K2,高效液相色譜C18柱將維生素K1和K2與其他雜質(zhì)分離,鋅柱柱后還原,使非熒光化合物維生素K1和K2產(chǎn)生熒光,熒光檢測(cè)器檢測(cè),外標(biāo)法定量,建立食物中維生素K1和維生素K2同時(shí)分析檢測(cè)技術(shù),以期為食品中維生素K1和K2的檢測(cè)、應(yīng)用和監(jiān)管提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

配方奶粉、酸奶、納豆凍干粉和雞胗凍干粉 廣東雙駿生物科技有限公司贈(zèng)送;VK1、MK-4、MK-7、MK-9標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液 中國(guó)疾病預(yù)防控制中心營(yíng)養(yǎng)與健康所贈(zèng)送;大豆、納豆、凍干納豆粉、納豆膠囊、青稞苗粉、奶酪、益生菌發(fā)酵液、多維?維生素D維生素K片 市購(gòu);正己烷 分析純,福晨(天津)化學(xué)試劑有限公司;冰醋酸、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀 分析純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;四氫呋喃、甲醇 色譜純,美國(guó)Fisher公司;無(wú)水碳酸鉀、氯化鋅 分析純,天津市光復(fù)精細(xì)化研究所;異丙醇 分析純,北京化工廠;無(wú)水乙酸鈉、氫氧化鉀 分析純,北京市通廣精細(xì)化工公司;脂肪酶 美國(guó)Sigma公司。

BS224S分析天平 德國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;EYELA N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 東京理化株式會(huì)社;ZHWY-110X30往復(fù)式恒溫水浴搖床 上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司;安捷倫1260高效液相色譜儀,配熒光檢測(cè)器和ChemStation for LC systems(版本序列號(hào):Rev.B.04.03-SP2[105])色譜工作站 美國(guó)Agilent公司;Thermo AcclaimTM120 C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm) 美國(guó) Thermo 公司;鋅粉還原柱(50 mm×4.6 mm,填料為鋅粉) 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理 準(zhǔn)確稱取適量配方奶粉、酸奶、納豆凍干粉、雞胗凍干粉于50 mL離心管中,用溫水溶解,加入pH=8.0的磷酸鹽緩沖液混勻,加入0.2 g脂肪酶,渦旋混勻后于37 ℃恒溫水浴搖床中振蕩2 h,使其充分酶解。酶解完成后冷卻至室溫,加入10 mL異丙醇和1 g碳酸鉀混勻,向混勻后的樣液中加入10 mL正己烷,渦旋提取后離心,轉(zhuǎn)移上清液至旋轉(zhuǎn)旋蒸瓶中,重復(fù)提取三次,合并上清液至旋轉(zhuǎn)旋蒸瓶中,旋蒸至干,立即用5 mL甲醇-四氫呋喃(9∶1)溶液定容,過(guò) 0.45 μm濾膜后上機(jī)測(cè)定。

1.2.2 色譜測(cè)定條件 色譜柱:Thermo AcclaimTM120 C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm);鋅粉還原柱(50 mm×4.6 mm,填料為鋅粉);柱溫:25 ℃;流動(dòng)相:甲醇-四氫呋喃(9∶1)溶液(1 L溶液中添加冰醋酸0.3 mL,氯化鋅1.5 g,無(wú)水乙酸鈉0.5 g);流速:1 mL/min;激發(fā)波長(zhǎng)為243 nm,發(fā)射波長(zhǎng)為430 nm;進(jìn)樣量:10 μL。

1.2.3 維生素K含量的計(jì)算

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 分別取VK1、MK-4、MK-7、MK-9標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,配制成20、50、100、200、500、1000 μg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,搖勻,現(xiàn)用現(xiàn)配。將混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作液分別注入高效液相色譜儀中,測(cè)定相應(yīng)的峰面積,以峰面積為縱坐標(biāo),以標(biāo)準(zhǔn)系列工作液濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.2.3.2 結(jié)果計(jì)算 試樣中VK1、MK-4、MK-7、MK-9的含量按下式計(jì)算:

式中:X-試樣中VK1、MK-4、MK-7、MK-9的含量,μg/100 g;c-根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的試樣中VK1、MK-4、MK-7、MK-9的濃度,μg/L;m-試樣的稱樣量,g;V-定容液的體積,mL。

1.2.4 方法學(xué)驗(yàn)證 按照《GB/T 27404-2008 實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》[22]方法學(xué)要求,建立校準(zhǔn)曲線及校準(zhǔn)曲線的工作范圍;逐步稀釋樣品上機(jī)測(cè)定,R(S/N)=3時(shí)的測(cè)定濃度作為檢出限,R(S/N)=10時(shí)的測(cè)定濃度作為定量限;

分別稱取配方奶粉、酸奶、納豆凍干粉和雞胗凍干粉,按照實(shí)驗(yàn)建立的方法,平行測(cè)定6次,計(jì)算VK1、MK-4、MK-7、MK-9的含量,并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差;采用樣品加標(biāo)試驗(yàn)進(jìn)行方法準(zhǔn)確度驗(yàn)證,向配方奶粉和酸奶中添加25、50、100 μg/100 g 三個(gè)水平VK1、MK-4、MK-7、MK-9標(biāo)準(zhǔn)溶液,向納豆凍干粉中添加4000、8000、16000 μg/100 g三個(gè)水平VK1、MK-4、MK-7、MK-9標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照實(shí)驗(yàn)建立的方法,測(cè)定VK1、MK-4、MK-7、MK-9的含量,每個(gè)加標(biāo)水平平行測(cè)定6次,計(jì)算回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.5 實(shí)際樣品的測(cè)定 按照實(shí)驗(yàn)方法,對(duì)大豆、納豆、凍干納豆粉、納豆膠囊、青稞苗粉、奶酪、益生菌發(fā)酵液、多維?維生素D維生素K片8個(gè)樣品進(jìn)行VK1、MK-4、MK-7、MK-9定量測(cè)定,所有樣品平行測(cè)定3次,結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

1.3 數(shù)據(jù)處理

通過(guò)與儀器配套的ChemStation for LC systems(版本序列號(hào):Rev.B.04.03-SP2[105])工作站軟件完成數(shù)據(jù)的采集與處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系、檢出限及定量限

將VK1、MK-4、MK-7、MK-9的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,按照實(shí)驗(yàn)色譜條件依次進(jìn)樣,根據(jù)濃度與峰面積的關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果表明,在20～1000 μg/L范圍內(nèi),VK1、MK-4、MK-7、MK-9的濃度與峰面積有良好線性關(guān)系,結(jié)果見(jiàn)表1,VK1、MK-4、MK-7、MK-9標(biāo)準(zhǔn)溶液高效液相色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 VK1、MK-4、MK-7、MK-9標(biāo)準(zhǔn)色譜圖Fig1 HPLC-FLD chromatograms of VK1,MK-4,MK-7,MK-9

檢出限和定量限分別以3倍和10倍信噪比(S/N)計(jì),結(jié)果表明,當(dāng)取樣量為2 g,定容體積為5 mL時(shí),VK1、MK-4、MK-7、MK-9的檢出限分別為0.02、0.01、0.05、0.1 μg/100 g,定量限分別為0.07、0.04、0.2、0.4 μg/100 g。

2.2 精密度實(shí)驗(yàn)

配方奶粉、酸奶稱樣量為2 g,雞胗凍干粉稱樣量為0.5 g,納豆凍干粉稱樣量為0.5 g,并稀釋20倍(取0.5 g納豆凍干粉加水定容至100 mL,超聲10 min后,搖勻,取5 mL),按照實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定,平行測(cè)定6次,計(jì)算VK1、MK-4、MK-7、MK-9的含量及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差,考察方法的精密度(表2)。結(jié)果表明:配方奶粉中VK1、MK-4、MK-7的含量分別是1.0842、1.1440、55.5368 μg/100 g,RSD分別為3.60%、4.08%、1.96%,未檢測(cè)到MK-9;酸奶中MK-7的含量是55.9944 μg/100 g,RSD為4.28%,未檢測(cè)到其他組分;雞胗凍干粉中MK-4和MK-7的含量分別為80.8396、2.4164 μg/100 g,RSD分別為1.98%和4.01%,未檢測(cè)到VK1和MK-9;納豆凍干粉中VK1和MK-7的含量分別9.1165、1063 μg/100 g,RSD分別為4.87%和4.10%,未檢測(cè)到MK-4和MK-9。4種樣品中各組分含量的RSD均小于5%,表明方法精密度良好,結(jié)果見(jiàn)表2,納豆凍干粉高效液相色譜圖見(jiàn)圖2。

表2 方法精密度結(jié)果(n=6)Table 2 Results of precision(n=6)

圖2 納豆凍干粉高效液相色譜圖Fig.2 HPLC-FLD chromatograms of natto freeze-dried

2.3 加標(biāo)回收率

準(zhǔn)確稱取2 g配方奶粉、1 g酸奶、0.5 g納豆凍干粉(取0.5 g納豆凍干粉加水定容至100 mL,超聲10 min后,搖勻,取2.5 mL),進(jìn)行三水平六平行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)(表3),結(jié)果顯示,配方奶粉、酸奶和納豆凍干粉中VK1、MK-4、MK-7、MK-9不同水平加標(biāo)回收率分別為85.0%～107.8%、85.8%～109.6%、85.1%～102.7%,RSD均小于5%,表明方法準(zhǔn)確度高,結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)Table 3 Result of recovery rate of standard addition(n=6)

續(xù)表

表4 8種食品中維生素 K 的含量(μg/100 g,n=3)Table 4 Contents of VK in 8 kinds of foods(μg/100 g,n=3)

2.4 實(shí)際樣品的測(cè)定

選取8種食品樣品按照實(shí)驗(yàn)建立的方法進(jìn)行測(cè)定(表4),結(jié)果表明,不同食品中維生素K含量差異較大,大豆中VK1含量是5.30±0.366 μg/100 g,未檢測(cè)到其他組分;納豆和凍干納豆粉中含有VK1和MK-7,其中MK-7含量較高,分別為777±27.7和1497±47.1 μg/100 g,未檢測(cè)到MK-4和MK-9;納豆膠囊含有四種成分,其中MK-7含量最高,為7020±113 μg/100 g;青稞苗粉含有VK1和MK-4,VK1含量較高,為294±20.2 μg/100 g;奶酪中只檢測(cè)到MK-4,含量為0.984±0.00744 μg/100 g;益生菌發(fā)酵液中檢測(cè)到VK1、MK-4和MK-7,但含量較低,均小于0.5 μg/100 g;多維?維生素D維生素K片中檢測(cè)到VK1、MK-4和MK-7,且含量均較高,其中MK-7含量為50092±490 μg/100 g,本文所測(cè)樣品中維生素K含量與Peter等[23]、鄧夢(mèng)雅等[24]、Schurgers等[25]的研究結(jié)果相符,結(jié)果見(jiàn)表4。

3 討論與結(jié)論

本研究建立了食品中維生素K1和維生素K2同時(shí)檢測(cè)的高效液相色譜-熒光檢測(cè)法(HPLC-FLD),結(jié)果表明,VK1、MK-4、MK-7、MK-9在20～1000 μg/L范圍與峰面積有良好線性關(guān)系;VK1、MK-4、MK-7、MK-9的檢出限分別為0.02、0.01、0.05、0.1 μg/100 g,定量限分別為0.07、0.04、0.2、0.4 μg/100 g。平行測(cè)定6次,配方奶粉、酸奶、納豆凍干粉和雞胗凍干粉中VK1、MK-4、MK-7、MK-9含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于5%。進(jìn)行三水平六平行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示,配方奶粉、酸奶和納豆凍干粉中VK1、MK-4、MK-7、MK-9不同水平加標(biāo)回收率分別為85.0%～107.8%、85.8%～109.6%、85.1%～102.7%,RSD均小于5%。鄒連蓬[17]建立了VK1、MK-4、MK-7三種形式維生素K在線分析技術(shù),加標(biāo)回收率為84.4%～124.2%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差<6%,鄧夢(mèng)雅[24]建立了食品中MK-4和MK-7同時(shí)檢測(cè)技術(shù),回收率為 80.6%～95.5%,本研究建立的檢測(cè)方法可以同時(shí)分離VK1、MK-4、MK-7、MK-9四種形式的維生素K,且不同食品中各形式維生素K的回收率在85.0%～109.6%之間,表明方法準(zhǔn)確度和精密度更高,適用于食品中維生素K1和維生素K2的高通量檢測(cè)。