膠體金免疫層析產(chǎn)品快速檢測農(nóng)藥殘留的評價與分析

葉秋雄,梁俊發(fā),張彬彬,林嘉健,彭 程,*,曾成柱,何麗媛

(1.廣州市食品檢驗所,廣東廣州 511405; 2.廣東省測試分析研究所,廣東廣州 510070)

農(nóng)藥在果蔬種植過程中大量使用,在獲得高收益的同時也因農(nóng)藥殘留超標造成食品安全問題,對人類健康產(chǎn)生了巨大威脅。隨著人們生活水平的逐漸提高,社會各界越來越重視食品安全問題,尤其是果蔬農(nóng)藥殘留問題?，F(xiàn)有的農(nóng)藥殘留傳統(tǒng)檢測方法主要有色譜法[1-3]、質(zhì)譜法[4-7]等,這些儀器分析方法靈敏、準確,但也對昂貴儀器有著高度的依賴、移動性差;另外,由于此類方法前處理復雜,檢測時間長,需配備專業(yè)的檢測人員,檢測成本高等,難以實現(xiàn)現(xiàn)場對樣品進行快速檢測的需要。

快檢技術(shù)在食用農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管中發(fā)揮著越來越重要的作用[8-10]。農(nóng)藥殘留快檢方法具有快速、簡便、靈敏、成本低廉、適用性廣等特點,在日常檢查、重大活動保障、案件查辦中發(fā)揮著重要作用[11-14]。但市售的農(nóng)藥殘留快速檢測產(chǎn)品存在諸多問題,如廠家準入門檻低,研發(fā)水平、產(chǎn)品質(zhì)量、結(jié)果準確度等參差不齊[15-18]。在投入使用前,有必要對其特異性、準確性等參數(shù)進行評價,以確保檢測結(jié)果的準確性。

目前,快速檢測產(chǎn)品的質(zhì)量評價方法中,均參考《SN/T 2775-2011 商品化食品檢測試劑盒評價方法》[19],但此類評價方法的盲樣設(shè)置不科學,總量較少,評價指標單一,不能全面科學地對快檢試劑盒的質(zhì)量進行評價[20-25]。因此,本文在《SN/T 2775-2011 商品化食品檢測試劑盒評價方法》的基礎(chǔ)上,建立一種盲樣檢測的農(nóng)藥殘留快速檢測產(chǎn)品評價方法,篩選出質(zhì)量穩(wěn)定可靠的快速檢測產(chǎn)品,為基層監(jiān)管部門在果蔬產(chǎn)品監(jiān)管方面提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

毒死蜱(CAS:2921-88-2)、水胺硫磷(CAS:24353-61-5)、多菌靈(CAS:10605-21-7)、克百威(CAS:1563-66-2)、百菌清(CAS:1897-45-6)、氟蟲腈(CAS:120068-37-3)、啶蟲脒(CAS:135410-20-7)1000 mg/kg 中國農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所;乙腈、丙酮、氯化鈉、甲苯、甲醇，分析純 廣州化學試劑公司;毒死蜱、水胺硫磷、多菌靈、克百威、百菌清、氟蟲腈、啶蟲脒等項目的快檢產(chǎn)品生產(chǎn)產(chǎn)家、實際批號、產(chǎn)品檢出限及其參比方法詳見表1;韭菜、菠菜、娃娃菜、生菜、蘋果 5種不同基質(zhì)的真實樣品由廣州市沃爾瑪番禺山姆會員店提供。

氣相色譜儀、氣相色譜-質(zhì)譜儀 美國Agilent公司；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 配有電噴霧離子源(ESI)，美國AB SCIEX公司；TGL20M高速冷凍離心機 上海赫田科學儀器有限公司；DK-98-II電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；KH-500B超聲波清洗器 成都一科儀器設(shè)備有限公司；Milli-Q去離子水發(fā)生器 美國Millipore公司；渦旋震蕩儀 美國Scientific Industries公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準工作液的配制 取適量的毒死蜱、水胺硫磷、多菌靈、克百威、百菌清、氟蟲腈、啶蟲脒標準溶液,用甲醇稀釋至濃度為2.0、1.0、10、0.4、100、0.4、4.0 mg/kg,-18 ℃冰箱中保存。

1.2.2 空白樣品的制備 由于不同果蔬樣品中的次生物質(zhì)不同,對膠體金免疫層析法檢測產(chǎn)品可能造成潛在的影響也不同,為了更全面評價快速檢測卡片的適用范圍,本實驗選取韭菜、菠菜、娃娃菜、生菜、蘋果等5種果蔬作為基質(zhì)樣。對果蔬樣品進行清洗,晾干表面水分后,采用表1中的參比方法進行檢測,確保購買的果蔬為陰性樣品。

按照生產(chǎn)廠家(A、B、C、D)的快檢產(chǎn)品說明書要求制備上述5種基質(zhì)樣品,樣品剪碎(1 cm2)混合均勻后,稱取2.0 g于50 mL離心管中,編號后置于冷庫(0～4 ℃)中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 加標樣品的制備 取上述稱量好的空白基質(zhì)樣品,按照各快檢產(chǎn)品的檢出限(見表1),以1倍的檢出限濃度水平向空白基質(zhì)樣品中添加標準溶液,加標量分別為毒死蜱0.1 mg/kg、水胺硫磷0.05 mg/kg、多菌靈0.5 mg/kg、克百威 0.02 mg/kg、百菌清5.0 mg/kg、氟蟲氰0.02 mg/kg、啶蟲脒0.2 mg/kg,編號后置于冷庫(0～4 ℃)中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 加標樣品的均勻性分析 為保證本次評價實驗的科學性和規(guī)范性,需要對加標樣品進行均勻性分析。本試驗將“1.2.3節(jié)”制備的加標樣品,分別采用各項目對應(yīng)的參比方法進行檢測,采用t-檢驗法對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,使用的軟件為SPSS Statistics 22(美國IBM公司),通過t-檢驗驗證加標樣品的均勻性。

1.3 快檢產(chǎn)品的技術(shù)指標分析

1.3.1 與參比方法的一致性分析 為考察毒死蜱、水胺硫磷、多菌靈、克百威、百菌清、氟蟲腈、啶蟲脒等產(chǎn)品的快檢方法與參比方法的一致性,對5種不同基質(zhì)的實際樣品,分別采用參比方法及快檢方法進行測定,記錄各基質(zhì)樣品中7種農(nóng)殘檢測數(shù)據(jù),并采用卡方檢驗法進行分析。卡方檢驗具體可見顯著性差異(χ2)所示,一般:

式中:χ2-卡方;1-自由度(df);N12-陽性樣品檢驗為陰性結(jié)果的數(shù)目;N21-陰性樣品檢驗為陽性結(jié)果的數(shù)目。

χ2<3.84表示快速檢測方法與參比方法的陽性確認比率在95%的置信區(qū)間內(nèi)沒有顯著性差異。

χ2>3.84表示兩種方法的陽性確認比率在95%的置信區(qū)間內(nèi)有顯著性差異。

相對準確率計算公式為:

式中:RA-相對準確率,%;N11-兩種方法均檢出陽性結(jié)果數(shù);N22-兩種方法均檢出陰性結(jié)果數(shù);N1.-陽性樣品數(shù);N2.-陰性樣品數(shù)。

1.3.2 特異性分析 為了評價快檢產(chǎn)品的特異性,本試驗采用與農(nóng)藥殘留快檢產(chǎn)品目標檢出物可能存在交叉反應(yīng)的標準物質(zhì)作為考察對象,濃度設(shè)置為10倍快檢產(chǎn)品檢出限,嚴格按照快檢產(chǎn)品說明書進行檢測,并對檢測結(jié)果進行統(tǒng)計分析。

1.3.3 穩(wěn)定性分析 對同一品種規(guī)格的產(chǎn)品,每次評價采用3個不同批次的快檢產(chǎn)品進行檢測,評價每個快檢產(chǎn)品的穩(wěn)定性,如生產(chǎn)廠家A的三個不同批次分別用A1、A2、A3表示。3批次同時滿足假陽性率應(yīng)≤15%、假陰性率應(yīng)≤5%的要求,說明產(chǎn)品的穩(wěn)定性好,有1批次及以上不滿足上述要求,說明產(chǎn)品的穩(wěn)定性差,未能通過評價。

表1 7種農(nóng)藥殘留快檢產(chǎn)品檢出限及參比方法Table 1 Detection limits and reference methods of 7 kinds of pesticide residue rapid detection kits

1.3.4 假陰性率和假陽性率分析 為了評價不同快檢產(chǎn)品的假陽性率、假陰性率,本試驗用于評價的盲樣由空白樣品和加標樣品組成,每批次快檢產(chǎn)品檢測50份盲樣,其中至少包括20份不同基質(zhì)的空白樣品和20份不同基質(zhì)的加標樣品,每個快檢產(chǎn)品檢測3個不同批次共150份盲樣,記錄其檢測情況,計算假陽性率和假陰性率。

假陽性率為陰性樣品的陽性結(jié)果比例,計算公式如下:

圖1 7種農(nóng)藥殘留的參比方法檢測譜圖Fig.1 Chromatograms of 7 pesticide residues by reference method

式中:pf+-假陽性率;N21-檢出假陽性結(jié)果數(shù);N2.-陰性樣品總數(shù)。

假陰性率為陽性樣品的陰性結(jié)果比例,計算公式如下:

式中:pf--假陰性率;N12-檢出假陰性結(jié)果數(shù);N1.-陽性樣品總數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS Statistics 22(美國IBM公司)及Microsoft Excel(美國Microsoft公司)對檢測結(jié)果進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 加標樣品的均勻性分析

按照CNAS-GL003:2018對樣品的均勻性進行驗證,采用SPSS分析軟件對檢測結(jié)果進行t檢驗統(tǒng)計分析,查看t分布臨界值表,對每組數(shù)據(jù)的t值進行比較。均勻性檢測結(jié)果見表2,經(jīng)查表,當P=0.05時,t95%,9為2.26,因此,每組數(shù)據(jù)的t值均小于t95%,9,說明同一濃度水平的所有樣品間無顯著性差異,即制備的樣品均勻性較好,可作為下一步試驗使用。

表2 加標樣品的均勻性檢測結(jié)果Table 2 Test results of homogeneity of spiked samples

表3 參比方法與快檢方法對5種不同基質(zhì)實際樣品的檢測結(jié)果Table 3 Test results of 5 different substrates by reference method and screening method

2.2 與參比方法的一致性分析

用參比方法與快檢方法同時對5種不同基質(zhì)的實際樣品進行7種農(nóng)藥殘留檢測,7種農(nóng)藥殘留項目的參比方法檢測圖譜見圖1,檢測結(jié)果見表3。由表3可知,在參比方法中,韭菜的毒死蜱、菠菜的水胺硫磷和氟蟲腈、娃娃菜的多菌靈、生菜的百菌清和水胺硫磷均有檢出;在快檢方法中,以上果蔬有檢出的項目均為陽性,兩者結(jié)果一致。且,χ2=0<3.84,即參比方法與快檢方法無顯著差異,故具有一致性,且相對準確率均為100%。

2.3 產(chǎn)品性能分析

表4 交叉反應(yīng)試驗結(jié)果Table 4 Cross reaction experiment results

2.3.1 特異性分析 本實驗中,每種農(nóng)殘項目各添加10倍檢出限的潛在交叉反應(yīng)物,分別采用4家生產(chǎn)廠家的快檢試劑嚴格按照各自說明書進行檢測,結(jié)果見表4。由表4可知,4家生產(chǎn)廠家的毒死蜱、水胺硫磷、多菌靈、克百威、百菌清、氟蟲腈、啶蟲脒等試劑均未與潛在交叉反應(yīng)物發(fā)生反應(yīng),檢測結(jié)果均為陰性,特異性較好。

2.3.2 穩(wěn)定性、假陰性率和假陽性分析 毒死蜱、水胺硫磷、氟蟲腈、多菌靈、克百威、百菌清、啶蟲脒膠體金競爭抑制免疫層析法快速檢測產(chǎn)品的盲樣檢測檢測結(jié)果見表5,部分盲樣檢測卡見圖2。由表5可知,14個快速檢測產(chǎn)品中有11個產(chǎn)品通過評價3個產(chǎn)品未通過評價,通過率為78.6%。其中生產(chǎn)廠家A的毒死蜱、水胺硫磷、氟蟲腈、多菌靈、百菌清、啶蟲脒項目均通過評價,假陽性率和假陰性率符合規(guī)定要求,不同批次產(chǎn)品的檢測結(jié)果較為一致,產(chǎn)品穩(wěn)定性較好;生產(chǎn)廠家B的毒死蜱項目有1批次產(chǎn)品假陽性率為21%,超過規(guī)定值15%的要求,判定為未通過評價,不同批次產(chǎn)品的檢測結(jié)果相差較大,產(chǎn)品穩(wěn)定性較差,另外,啶蟲脒項目3批次產(chǎn)品的假陽性率分別為4%、8%、4%,但均未超過規(guī)定值15%的要求,判定為通過評價;生產(chǎn)廠家C的水胺硫磷項目有1批次產(chǎn)品假陰性率為14%,超過規(guī)定值5%的要求,另外,氟蟲腈項目3批次產(chǎn)品假陰性率分別為41%、33%、46%,超過規(guī)定值5%的要求,不同批次產(chǎn)品的檢測結(jié)果相差較大,產(chǎn)品穩(wěn)定性較差,判定為未通過評價;生產(chǎn)廠家D的克百威項目有1批次產(chǎn)品假陰性率為4%,但未超過規(guī)定值5%的要求,判定為通過評價,另外,百菌清項目3個批次的產(chǎn)品穩(wěn)定性較好,未出現(xiàn)假陰性或假陽性,判定為通過評價。

表5 毒死蜱、水胺硫磷、氟蟲腈、多菌靈、 克百威、百菌清、啶蟲脒快檢試劑的盲樣檢測結(jié)果Table 5 Results of blind samples tested by chlorpyrifos, amiphos,fipronil,carbendazim,carbocarb, chlorothalonil,and acetamipridassay kits

續(xù)表5

圖2 毒死蜱、水胺硫磷、氟蟲腈、多菌靈、 克百威、百菌清、啶蟲脒部分盲樣檢測卡片F(xiàn)ig.2 Partial blind detection card of chlorpyrifos,amiphos, fipronil,carbendazim,carbocarb,chlorothalonil,and acetamiprid

3 結(jié)論

本次評價的14個快檢產(chǎn)品特異性較好,個別產(chǎn)品的穩(wěn)定性較差,有2個快檢產(chǎn)品由于假陰性率不符合規(guī)定要求,未通過產(chǎn)品評價,說明這2個產(chǎn)品的檢出限達不到國家標準的要求;1個快檢產(chǎn)品的假陽性率不符合規(guī)定要求,未通過產(chǎn)品評價,說明個別企業(yè)為了迎合市場需求,實際檢出限遠小于其標示的檢出限,在實際監(jiān)管中使用該產(chǎn)品進行檢測,將可能檢出大量的假陽性樣品,增加監(jiān)管部門使用儀器驗證檢測結(jié)果的負擔,影響監(jiān)管效率,達不到快速檢測的實際意義。

綜上所述,本文采用空白基質(zhì)加標方式制備盲樣,并驗證盲樣的均勻性;每個快檢產(chǎn)品隨意抽取3個不同批次,每批次產(chǎn)品均檢測50份盲樣,其中陰性樣品、陽性樣品至少20份的技術(shù)評價方案,能夠科學客觀地對不同試劑盒產(chǎn)品進行質(zhì)量評價,進而篩選出假陽性率低、靈敏度高、準確性和穩(wěn)定性好的快速檢測產(chǎn)品;另外,通過建立快檢產(chǎn)品評價機制,有望促使快檢產(chǎn)品生產(chǎn)廠家不斷改進技術(shù),提高產(chǎn)品性能,促進快檢產(chǎn)品質(zhì)量提升,走創(chuàng)新發(fā)展道路。