遺傳算法優(yōu)化雙水相法提取葡萄皮渣花色苷工藝及其組分分析

許丹妮,楊海玲,范麗麗,*,潘月林

(1.廣西民族師范學(xué)院,廣西崇左 532200; 2.廣西中醫(yī)藥大學(xué),廣西南寧 530001; 3.崇左市蕙之源健康科技有限責(zé)任公司,廣西崇左 532200)

截至2017年,其在全球范圍內(nèi)的種植葡萄面積達(dá)到了760萬公頃,其中一半以上的葡萄被用于釀造葡萄酒[1]。在葡萄酒的釀造過程中會(huì)產(chǎn)生大量的葡萄皮渣廢物(約占葡萄重量的20%～30%),每年在全球各地的酒廠中產(chǎn)生約900萬噸的葡萄皮渣[2]。而在葡萄皮渣中仍然殘留著大量的生活活性物質(zhì),其中花色苷的含量十分可觀,但在酒廠中,絕大部分葡萄皮渣都以廢物的形式被處理掉,增加了企業(yè)的成本,同時(shí)也是對自然資源的一種浪費(fèi),處理不當(dāng)會(huì)造成環(huán)境污染。因此,如何利用先進(jìn)的提取技術(shù)從葡萄皮渣中提取花色苷是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。

花色苷作為最重要的活性成分之一,具有抗氧化、抗腫瘤和預(yù)防心腦血管疾病等功效[3]。目前溶劑提取法是花色苷提取的主要方式,該方法操作簡單,但效率低、溶劑消耗量大[4]。為克服溶劑提取的缺陷,一些新的提取方式被提出,如微波輔助提取[5]、超聲輔助提取[6]、超高壓輔助提取[7]、酶法輔助提取[8]及超臨界CO2提取[9]等,但這些方式提取條件苛刻,需要昂貴的設(shè)備,無形中增加了企業(yè)成本。近年來,雙水相提取法作為新的提取分離方式,因操作簡單、成本低、溶劑易回收、生物親和力好、效率高及易于放大生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)而備受人們關(guān)注,已被廣泛應(yīng)用于食品、化工和制藥等領(lǐng)域[10]。但該技術(shù)應(yīng)用在花色苷提取方面的研究較少,目前關(guān)于利用雙水相法提取葡萄皮渣花色苷鮮見報(bào)道。

鑒于此,本研究利用雙水相法提取葡萄皮渣花色苷。通過單因素實(shí)驗(yàn)探究乙醇體積分?jǐn)?shù)、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH、料液比和提取時(shí)間對花色苷得率的影響;然后通過遺傳算法優(yōu)化花色苷的提取工藝;利用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用鑒定最優(yōu)工藝參數(shù)組合下獲得的葡萄皮渣花色苷提取物中花色苷組分,以期為花色苷進(jìn)一步開發(fā)和綜合利用提供重要的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葡萄皮渣 2019年11月15日收集于廣西崇左天等縣許氏葡萄園釀酒基地;矢車菊素-3-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99.5%) 美國諾威公司;乙腈、甲酸、無水乙醇、鹽酸、氯化鉀、硫酸銨和醋酸鈉(均為分析純) 廣州市宏州化工有限公司;AB-8大孔樹脂 天津允開樹脂科技有限公司。

Agilent 1100高效液相色譜、Agilent 1290高效液相色譜-G6500四級桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent公司;DD-6R離心機(jī) 濟(jì)南千司生物技術(shù)有限公司;R1050旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 鞏義市科瑞儀器有限公司;UV-6300雙光束紫外可見分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司;HWS電熱恒溫水浴鍋 上海力辰儀器科技有限公司;FA2104電子分析天平 北京澎昆博遠(yuǎn)科貿(mào)發(fā)展有限責(zé)任公司;FC-27AS-E真空冷凍干燥機(jī) 河北國輝實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理 葡萄皮渣經(jīng)挑選、除雜,然后置于真空冷凍干燥機(jī)中凍干,過40目篩,密封避光置于-18 ℃冰箱中備用。

1.2.2 葡萄皮渣花色苷雙水相提取 參考Li等[11]制備乙醇-硫酸銨雙水相體系,稱取一定量的硫酸銨置于錐形瓶中,加入一定體積的去離子水使其充分溶解,然后用質(zhì)量濃度1 mol/L HCl調(diào)至所需pH,再加入一定比例的乙醇,均勻混合后,靜止形成雙水相。在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,稱取5 g葡萄皮渣加入上述形成的雙水相體系中,然后置于35 ℃恒溫振蕩器中,振蕩提取一定時(shí)間后,待兩相分配達(dá)到平衡后,收集上相溶液,并將提取液置于離心機(jī)中以7000 r/min離心15 min,取離心后的上清液,將一部分上清液定容于50 mL容量瓶中,測定花色苷得率;另取上清液以2 BV/h流速通過已活化的AB-8大孔樹脂柱(2.6 cm×60 cm),上樣結(jié)束后,依次用蒸餾水、40%、60%、80%酸化乙醇(0.05%醋酸)洗脫,收集60%乙醇洗脫液,將其在35 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮、真空冷凍干燥,制得葡萄皮渣花色苷提取物(Anthocyanins extracts from grape skin,AEGS)。

1.2.3 花色苷提取方式對比 分別參考Monrad等[12]、Liazid等[5]、Sancho-Galan等[6]和Dinkova等[8]方法對花色苷進(jìn)行溶劑提取、微波提取、超聲提取和酶法提取,對比以上4種提取方式及本文的雙水相提取對花色苷得率的影響,為提取方式的選擇提取依據(jù)。

1.2.4 花色苷得率測定 參考于澤源等[13]的測定方法,測定不同提取條件花色苷得率,由式(1)計(jì)算樣品中花色苷得率。

c={[(A520 nm-A700 nm)pH1.0-(A520 nm-A700 nm)pH4.5]×Mw×DF×1000×V}/(ε×1×m)

式(1)

式中:c為花色苷得率,mg/g;A為吸光度;DF為稀釋倍數(shù);Mw為矢車菊素-3-葡萄糖苷的相對分子質(zhì)量;ε為矢車菊素-3-葡萄糖苷的消光系數(shù);m為黑加侖果粉的質(zhì)量,g。

1.2.5 單因素實(shí)驗(yàn) 在1.2.3研究結(jié)果的基礎(chǔ)上,選擇雙水相法作為提取葡萄皮渣花色苷的方法,操作同1.2.3。以5 g葡萄皮渣為提取對象,研究乙醇體積分?jǐn)?shù)、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH、料液比和提取時(shí)間5個(gè)因素對葡萄皮渣花色苷得率的影響。

乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響。固定硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為24%、pH為3.0、料液比為1∶40 g/mL和提取時(shí)間為60 min,研究乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%、35%、40%、45%和50%時(shí)對花色苷得率的影響。

硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響。固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%、pH為3.0、料液比為1∶40 g/mL和提取時(shí)間為60 min,研究硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%、22%、24%、26%和28%時(shí)對花色苷得率的影響。

pH的影響。固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為24%、料液比為1∶40 g/mL和提取時(shí)間為60 min,研究pH為2.0、2.5、3.0、3.5和4.0時(shí)對花色苷得率的影響。

料液比的影響。固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為24%、pH為3.0和提取時(shí)間為60 min,研究料液比為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50和1∶60 g/mL時(shí)對花色苷得率的影響。

提取時(shí)間的影響。固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為24%、pH為3.0和料液比為1∶40 g/mL,研究提取時(shí)間為20、40、60、80和100 min時(shí)對花色苷得率的影響。

1.2.6 響應(yīng)面法試驗(yàn) 依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取乙醇體積分?jǐn)?shù)(X1)、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)(X2)、pH(X3)和料液比(X4)為實(shí)驗(yàn)因素,以花色苷得率(Y)為響應(yīng)值,進(jìn)行4因素3水平的Box-Behnken組合實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 ExPerimental design factors and levels

采用響應(yīng)面分析法得到的二次回歸模型如式(2)所示:

式(2)

式中:b0為截距回歸系數(shù);bi為線性回歸系數(shù);bii為二次項(xiàng)的回歸系數(shù);bij為交互項(xiàng)的回歸系數(shù);Xi,Xj為自變量。

1.2.7 遺傳算法設(shè)計(jì) 依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH和料液比4個(gè)因素為決策變量,即:

X=X(X1,X2,X3,X4)

式(3)

式(4)

(5)

遺傳算法優(yōu)化的約束條件:選擇各因素水平的上下限,花色苷得率最優(yōu)的約束條件如下式所示:

式(6)

1.2.8 高效液相色譜(HPLC)分析 樣品處理:分別準(zhǔn)確稱取1.0 mg在最優(yōu)工藝下獲得的AEGS,用體積分?jǐn)?shù)0.1% HCl-甲醇溶液將其配制成0.1 mg/mL的樣品溶液,用于HPLC分析。

色譜條件:Aglient-1100 C18柱(150 mm×4.6 mm,2.6 μm);流動(dòng)相A和流動(dòng)相B分別為體積分?jǐn)?shù)20%甲酸和乙腈∶水∶甲酸(體積比)為56.5∶40∶3.5組成的體系;洗脫程序:15% B(0 min)～40% B(10 min)～60% B(15 min)～75% B(25 min)～90% B(30 min)～15% B(40 min);檢測波長為520 nm。依據(jù)峰面積歸一法計(jì)算所得組分的純度,如式(7)所示。

式(7)

式中:wi為待測組分i的峰面積百分?jǐn)?shù);fi為校正因子;Ai為待測組分i的峰面積。

1.2.9 液質(zhì)(HPLC-MS)分析 液質(zhì)條件參考譚佳琪等[7]測定超高壓提取桑葚花色苷組分條件。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析;采用Matlab R2018b軟件優(yōu)化雙水相提取葡萄皮渣花色苷的工藝參數(shù);采用Design ExPert ver 8.0軟件設(shè)計(jì)Box-Behnken組合實(shí)驗(yàn);采用Origin 9.0軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取方式的選擇

不同提取方式對葡萄皮渣花色苷得率的影響結(jié)果如圖1所示。由圖1可知,溶劑提取法所得的花色苷得率顯著低于其它四種提取方式(P<0.05)。酶法提取所得花色苷得率同樣顯著低于微波輔助提取、超聲輔助提取和雙水相提取(P<0.05)。分析可能原因是酶在提取過程中容易受外界條件的影響而造成酶活性降低,從而降低提取效果。微波輔助提取和超聲輔助提取所得花色苷得率均顯著低于雙水相提取(P<0.05),而兩者之間無顯著差別(P>0.05),分析其原因是兩種提取方式均能破壞植物細(xì)胞壁,降低花色苷由內(nèi)向外的傳遞阻力,從而提高花色苷得率。雙水相提取法中無機(jī)鹽和有機(jī)相之間的作用力有助于花色苷溶解,同時(shí)增加花色苷在溶劑中的擴(kuò)散系數(shù),從而提取花色苷得率。因此,后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用雙水相法提取葡萄皮渣花色苷。

圖1 不同提取方式對葡萄皮渣花色苷得率的影響Fig.1 Effect of different extraction methods on the yield of anthocyanins from grape pomace

2.2 單因素對葡萄皮渣花色苷得率的影響

圖2 不同實(shí)驗(yàn)因素對葡萄皮渣花色苷得率的影響Fig.2 Effects of different experimental factors on the yield of anthocyanins from grape pomace注:不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

雙水相法提取葡萄皮渣花色苷的單因素實(shí)驗(yàn),其結(jié)果如圖2所示。由圖2A可知,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)在30%～40%范圍內(nèi),花色苷得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增加呈現(xiàn)顯著增加的趨勢(P<0.05),乙醇體積分?jǐn)?shù)在40%時(shí),花色苷得率取得最大值(2.36±0.07) mg/g。其原因是隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增加使得上相中的有機(jī)相增加,萃取能力增加,有助于花色苷的提取[14]。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)過高時(shí),上相會(huì)溶解醇溶性雜質(zhì)、色素等,降低花色苷溶解度,導(dǎo)致花色苷得率降低[15-16]。因此,乙醇體積分?jǐn)?shù)選擇在35%、40%、45%三個(gè)水平進(jìn)行組合實(shí)驗(yàn)。

由圖2B可知,當(dāng)硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)在20%～24%范圍內(nèi),隨硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加花色苷得率呈現(xiàn)顯著增加的趨勢(P<0.05)。其原因是隨酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加,奪水能力越強(qiáng),造成上相有機(jī)相中水分降低,有機(jī)相極性增強(qiáng),使得花色苷溶解度和擴(kuò)散系數(shù)增加,更易使花色苷由內(nèi)向外擴(kuò)散,提高花色苷得率[17]。但當(dāng)硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過24%時(shí),花色苷得率隨硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加呈現(xiàn)顯著降低的趨勢(P<0.05)。其原因是隨硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加上下兩相逐步達(dá)到飽和狀態(tài),隨后繼續(xù)增加硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)會(huì)使上相中的花色苷轉(zhuǎn)移到下相[18];另外過量的硫酸根離子導(dǎo)致表面張力增加,使得花色苷吸附在兩相界面,導(dǎo)致花色苷得率降低[19]。因此,硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)選擇在22%、24%、26%三個(gè)水平進(jìn)行組合實(shí)驗(yàn)。

由圖2C可知,當(dāng)pH在2.0～3.0范圍內(nèi),花色苷得率隨pH增加呈現(xiàn)顯著增加的趨勢(P<0.05),當(dāng)pH3.0時(shí),花色苷得率取得最大值(2.31±0.03) mg/g。其原因是在pH為3.0時(shí),花色苷以紅色黃鹽陽離子形式存在,其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,提取效果較好[20]。但當(dāng)PH超過3.0時(shí),隨pH的增加花色苷得率顯著降低(P<0.05)。其原因是隨pH增加花色苷結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,從而使花色苷得率降低[21]。因此,pH選擇在2.5、3.0、3.5三個(gè)水平進(jìn)行組合實(shí)驗(yàn)。

由圖2D可知,花色苷得率隨料液比增加呈現(xiàn)先顯著增加后顯著降低的趨勢(P<0.05),當(dāng)料液比在1∶40 g/mL時(shí),花色苷得率取得最大值(2.33±0.03) mg/g。其原因可能是隨料液比增加溶劑滲透并擴(kuò)散到葡萄皮細(xì)胞內(nèi),細(xì)胞內(nèi)外濃度梯度逐漸增加,濃度梯度作為花色苷傳質(zhì)動(dòng)力[22];另外溶劑在葡萄皮細(xì)胞內(nèi)破壞疏水鍵,使得花色苷向溶劑中擴(kuò)散速率增加,有助于花色苷由內(nèi)向外擴(kuò)散,增加花色苷得率[23]。但當(dāng)料液比繼續(xù)增加超過1∶40 g/mL時(shí),花色苷得率顯著降低(P<0.05)。這可能是由于固液界面存在傳質(zhì)極限,細(xì)胞內(nèi)外濃度梯度差趨于零,體系已經(jīng)達(dá)到飽和狀態(tài),過量溶劑不但稀釋花色苷,而且也會(huì)給后續(xù)花色苷分離純化增加難度。綜上料液比選擇在1∶30、1∶40、1∶50 g/mL三個(gè)水平進(jìn)行組合實(shí)驗(yàn)。

由圖2E可知,花色苷得率隨提取時(shí)間延長先呈現(xiàn)顯著增加的趨勢(P<0.05),后呈無顯著變化的趨勢(P>0.05)。其原因是在提取初期,花色苷在較大的濃度梯度下,容易從細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)散的周圍溶劑中,使得花色苷得率顯著增加。隨后進(jìn)一步延長提取時(shí)間,由于上相中花色苷濃度與葡萄皮細(xì)胞中花色苷濃度趨于一致,提取液中花色苷達(dá)到飽和狀態(tài),故進(jìn)一步延長提取時(shí)間對花色苷得率無顯著影響[24]。因此提取時(shí)間確定為60 min,后續(xù)不再進(jìn)行優(yōu)化提取時(shí)間。

2.2 響應(yīng)曲面法試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 模型建立與顯著性檢驗(yàn) 通過遺傳算法優(yōu)化雙水相法提取葡萄皮渣花色苷最佳工藝條件,所得的實(shí)驗(yàn)方案和結(jié)果見表2。以花色苷得率(Y)為響應(yīng)值,對實(shí)驗(yàn)所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析,得到葡萄皮渣花色苷得率對乙醇體積分?jǐn)?shù)(X1)、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)(X2)、PH(X3)和料液比(X4)的回歸模型如式(8)所示。

表2 響應(yīng)曲面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 ExPerimental design and results of response surface methodology

式(8)

對回歸方程系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn),結(jié)果如表3所示。

為驗(yàn)證式(8)的可靠性及各實(shí)驗(yàn)因素對花色苷得率的影響程度,對表2中的數(shù)據(jù)分析,其結(jié)果如表3所示。由表3可知,數(shù)學(xué)模型中F值為46.67,P值小于0.0001,決定系數(shù)R2為0.9790,結(jié)果表明經(jīng)響應(yīng)面建立的數(shù)學(xué)模型極顯著;此外該模型的失擬項(xiàng)P值為0.0864,結(jié)果表明所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與模型擬合較好。采用F值大小評價(jià)實(shí)驗(yàn)因素對響應(yīng)值的影響程度,F值大小與因素對響應(yīng)值的影響程度呈正相關(guān)。由表3知,F(X1)=0.29、F(X2)=274.17、F(X3)=8.24和F(X4)=20.61,即各因素對花色苷得率的影響順序?yàn)榱蛩徜@質(zhì)量分?jǐn)?shù)(X2)>料液比(X4)>pH(X3)>乙醇體積分?jǐn)?shù)(X1),且料液比和硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)對花色苷得率的影響達(dá)到極顯著水平。

響應(yīng)曲面的坡度陡峭程度能反應(yīng)實(shí)驗(yàn)因素對響應(yīng)值影響的強(qiáng)弱,響應(yīng)曲面相對平緩,說明實(shí)驗(yàn)因素對響應(yīng)值影響作用較小;響應(yīng)曲面越陡峭,說明實(shí)驗(yàn)因素對響應(yīng)值影響作用越大。

利用等高線圖形來判斷因素交互作用對響應(yīng)值的影響程度是否顯著。當(dāng)?shù)雀呔€圖形為橢圓時(shí),表示因素交互作用顯著影響響應(yīng)值變化;當(dāng)?shù)雀呔€圖形為圓形時(shí),表示因素交互作用對響應(yīng)值變化無顯著影響[25]。圖3反應(yīng)各實(shí)驗(yàn)因素交互作用對花色苷得率的影響。

由表3方差分析結(jié)果可知,X1X2、X1X4、X2X3和X2X4的交互作用均對花色苷得率無顯著影響(P>0.05),故在此不做分析。X1X3和X2X4的交互作用均能極顯著影響花色苷得率(P<0.001)。由圖3a可知,花色苷得率均隨pH和乙醇體積分?jǐn)?shù)增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢,花色苷在中心點(diǎn)時(shí)能取得最大值。由圖3c可知,隨pH和料液比增加花色苷得率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢,花色苷在中心點(diǎn)時(shí)能取得最大值。由圖3b和圖3d的等高線圖可以看出,X1X3和X2X4交互作用的等高線圖均呈現(xiàn)橢圓。表明上述實(shí)驗(yàn)因素之間的交互作用均顯著影響花色苷得率,該結(jié)果與方差分析的結(jié)果一致。

表3 雙水相提取葡萄皮渣花色苷回歸模型系數(shù)的顯著性Table 3 Significance of regression model coefficient of anthocyanins extracted from grape pomace by aqueous two-phase extraction

圖3 各實(shí)驗(yàn)因素交互作用的響應(yīng)面和等高線圖Fig.3 Response surface and contour plots of interaction of experimental factors

2.2.2 雙水相法提取葡萄皮渣花色苷的工藝參數(shù)優(yōu)化 利用Matlab R2018b軟件中的遺傳算法優(yōu)化工具箱進(jìn)行優(yōu)化雙水相提取葡萄皮渣花色苷的工藝,當(dāng)?shù)?6次時(shí),葡萄皮渣花色苷得率取得最大值,此時(shí)乙醇體積分?jǐn)?shù)(X1)、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)(X2)、pH(X3)和料液比(X4)水平編碼分別為-0.0451、1.0000、0.1716、-0.1517,即試驗(yàn)水平分別為39.77%、26%、3.09和1∶38.48 g/mL,在此條件下,所得花色苷含量理論值為3.19 mg/g。遺傳算法M文件運(yùn)行結(jié)果如圖4所示。

2.2.3 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 采用遺傳算法優(yōu)化獲得雙水相法提取葡萄皮渣花色苷工藝參數(shù)為:乙醇體積分?jǐn)?shù)39.77%、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)26%、pH3.09和料液比1∶38.48 g/mL,花色苷得率理論值3.19 mg/g。

為驗(yàn)證遺傳算法的可靠性,結(jié)合實(shí)際情況,將上述工藝參數(shù)修正為:乙醇體積分?jǐn)?shù)40%、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)26%、pH3和料液比1∶38 g/mL,在此條件下花色苷得率實(shí)驗(yàn)值(3.05±0.07) mg/g,實(shí)驗(yàn)值和理論值的相對誤差為4.39%。進(jìn)一步證明采用遺傳算法優(yōu)化雙水相法提取葡萄皮渣花色苷工藝參數(shù)是可行的。

2.3 HPLC檢測分析

采用HPLC對AEGS中花色苷組分進(jìn)行檢測分析,其結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知,AEGS中含有2個(gè)峰,峰分離效果好,表明AEGS中含2種花色苷組分(組分Ⅰ和組分Ⅱ),組分Ⅰ和組分Ⅱ分別對應(yīng)圖5中的1號峰和2號峰。1號峰和2號峰均無雜峰,表明組分Ⅰ和組分Ⅱ?yàn)閱我换ㄉ战M分。依據(jù)式(7)計(jì)算組分Ⅰ和組分Ⅱ的純度分別為90.16%和92.41%。

表4 葡萄皮渣花色苷種類鑒定結(jié)果Table 4 Identification of anthocyanins in grape pomace

圖4 遺傳算法優(yōu)化結(jié)果Fig.4 Results optimized by the genetic algorithm

圖5 葡萄皮渣花色苷粗提物的HPLC色譜圖Fig.5 HPLC chromatogram of crude extracts of anthocyanins from grape pomace

2.4 HPLC-MS檢測分析

為進(jìn)一步研究花色苷組分,利用HPLC-MS對組分Ⅰ和組分Ⅱ進(jìn)行鑒定。兩者的質(zhì)譜圖如圖6所示。

圖6 花色苷組分質(zhì)譜圖Fig.6 Mass spectrogram of anthocyanins components

由表4可知,組分Ⅰ的出峰時(shí)間為13.72 min,圖6a中組分Ⅰ的一級質(zhì)譜中,其分子離子峰[M+]為465.2,同時(shí)檢測到分子碎片為m/z 303.3,大量研究已經(jīng)證實(shí)m/Z 303為飛燕草素的特征離子。丟失碎片為分子離子去除分子碎片所得的值,經(jīng)計(jì)算組分Ⅰ所丟失碎片為162,分子量162可能是失去葡萄糖和半乳糖。該研究結(jié)果與薛宏坤等[26]研究桑葚花色苷和Nicoue等[27]研究野生藍(lán)莓花色苷中的飛燕草-3-葡萄糖苷的質(zhì)譜信息相一致。因此,組分Ⅰ被鑒定為飛燕草-3-葡萄糖苷。由表4可知,組分Ⅱ出峰時(shí)間為22.00 min,圖6b中組分Ⅱ的一級質(zhì)譜中,其分子離子峰[M+]為449.1,同時(shí)檢測到分子碎片為m/Z 287.1,大量研究已經(jīng)證實(shí)分子碎片m/Z 287是矢車菊素的特征離子,經(jīng)計(jì)算組分Ⅱ所丟失碎片也為162,同組分Ⅰ推測一樣,分子量162可能是失去葡萄糖和半乳糖。Cerezo等[28]和Zhang等[29]分別在鑒定卡馬羅薩草莓和荔枝果皮中花色苷中矢車菊素-3-葡萄糖苷的質(zhì)譜信息相一致。因此,組分Ⅱ?yàn)槭杠嚲账?3-葡萄糖苷。

3 結(jié)論

本文通過遺傳算法優(yōu)化雙水相法提取葡萄皮渣花色苷的工藝,其最優(yōu)工藝參數(shù)為:乙醇體積分?jǐn)?shù)40%、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)26%、pH3、料液比1∶38 g/mL和提取時(shí)間60 min,在此條件下花色苷得率(3.05±0.07) mg/g。經(jīng)鑒定發(fā)現(xiàn)葡萄皮渣花色苷提取物含有2種花色苷組分,分別為飛燕草-3-葡萄糖苷和矢車菊素-3-葡萄糖苷,其純度分別為90.16%和92.41%。綜上雙水相法提取葡萄工業(yè)廢渣中的花色苷是一種高效、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保的方法,同時(shí)為進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用花色苷提供較好的物質(zhì)基礎(chǔ)。