響應(yīng)面法優(yōu)化鰹魚肽的復(fù)合酶酶解工藝及氨基酸評(píng)價(jià)

李慧凝,張明振,孟少珂,劉 霞,江曉路,王 鵬,張京良

(1.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島 266003; 2.中國海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院,山東青島 266003; 3.乳山市華隆生物科技股份有限公司,山東威海 264513; 4.中華人民共和國黃島海關(guān),山東青島 266555; 5.青島海洋生物醫(yī)藥研究院,山東青島 266007)

鰹魚(Katsuwonuspelamis)又名炸彈魚,類屬硬骨魚綱(Osteichthyes),鱸形總目(Pereiformes),鯖科(Scombridae),鰹屬(Katsuwonus)[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì),目前全球鰹魚總捕撈量在200萬噸以上,大約占金槍魚總捕撈量的60%,是遠(yuǎn)洋漁業(yè)重要魚類資源之一[2]。鰹魚運(yùn)動(dòng)量大,體內(nèi)積累大量乳酸使肉質(zhì)酸澀[3],目前大多以鮮食或加工罐頭為主,產(chǎn)品附加值低。

近年來,越來越多的研究發(fā)現(xiàn)海洋蛋白肽具有增強(qiáng)免疫力[4]、抗氧化[5]、抗腫瘤[6]、降血糖[7]和降血壓[8]等多種生物活性,且小分子肽更易于被人體吸收利用[9],研究表明,海洋蛋白肽的制備方法主要以酶解法為主,酶解條件溫和,氨基酸不易被破壞,水解液中氨基酸含量高[10]。因此,利用海洋資源開發(fā)蛋白肽成為研究熱點(diǎn)之一。鰹魚蛋白含量豐富,是優(yōu)質(zhì)的海洋蛋白資源,目前利用鰹魚褐色肉、魚頭、下腳料等制備鰹魚酶解產(chǎn)物已有研究,楊龍方等[11]研究了利用堿性蛋白酶酶解鰹魚褐色肉的工藝條件;章葉江等[1]研究了利用木瓜蛋白酶和風(fēng)味酶雙酶酶解鰹魚頭的工藝條件,獲得必需氨基酸含量為35%的水解液;何定芬等[12]優(yōu)化堿性蛋白酶提取鰹魚內(nèi)臟魚油的工藝條件,獲得高提取率的魚油,但酶解鰹魚肉制備鰹魚肽的研究較少。因此,本研究以鰹魚為原料,采用動(dòng)物蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶復(fù)合酶解鰹魚肉,通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化酶解工藝,分析研究鰹魚肽營養(yǎng)成分,為實(shí)現(xiàn)鰹魚高值化利用、開發(fā)鰹魚蛋白肽奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鰹魚 青島麥島市場;堿性蛋白酶、中性蛋白酶、動(dòng)物蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶 2×104U/g,廣西南寧龐博生物工程有限公司;細(xì)胞色素C Mw 12384、抑肽酶Mw 6511.44、桿菌酶Mw 1422.69、還原型谷胱甘肽Mw 307.32、尿嘧啶Mw 112.09 北京索萊寶科技有限公司;其他試劑均為分析純。

DS-1 高速組織搗碎機(jī) 上海標(biāo)本模型廠;SKD-100凱氏定氮儀 上海沛歐分析儀器有限公司;HWS24型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;pH2700酸度計(jì) 美國EUTECH公司;L-8900型氨基酸自動(dòng)分析儀 日本日立集團(tuán);1260液相色譜儀 Agilent公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程 新鮮鰹魚→去頭、去內(nèi)臟,取其肌肉組織→組織搗碎機(jī)搗碎→調(diào)節(jié)料液比→調(diào)節(jié)pH→加酶→50 ℃保溫酶解→沸水浴滅酶10 min→冷卻至室溫→離心(6000 r/min,10 min)→取上清液即酶解液→活性炭脫色脫腥→納濾脫鹽→冷凍干燥→鰹魚肽樣品

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 蛋白酶篩選 從堿性蛋白酶、中性蛋白酶、動(dòng)物蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶中篩選兩種水解效果較好的蛋白酶,研究動(dòng)物蛋白酶(D)與風(fēng)味蛋白酶(F)比例(1∶1、2∶1、4∶1、8∶1)對(duì)水解度的影響。

1.2.2.2 加酶量對(duì)水解度的影響 選取D/F為4∶1的蛋白酶,在料液比1∶4 (V/V)、酶解溫度50 ℃、酶解pH7.5、酶解時(shí)間2 h的條件下,考察加酶量(1000、2000、3000、4000、5000 U/g)對(duì)水解度的影響。

1.2.2.3 料液比對(duì)水解度的影響 選取D/F為4∶1的蛋白酶,在加酶量4000 U/g、酶解溫度50 ℃、酶解pH7.5、酶解時(shí)間2 h的條件下,考察料液比(1∶0.5、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6 V/V)對(duì)水解度的影響。

1.2.2.4 酶解溫度對(duì)水解度的影響 選取D/F為4∶1的蛋白酶,在加酶量4000 U/g、料液比1∶4 (V/V)、酶解pH7.5、酶解時(shí)間2 h的條件下,考察酶解溫度(40、45、50、55、60、65 ℃)對(duì)水解度的影響。

1.2.2.5 酶解pH對(duì)水解度的影響 選取D/F為4∶1的蛋白酶,在加酶量4000 U/g、料液比1∶4 (V/V)、酶解溫度50 ℃、酶解時(shí)間2 h的條件下,考察酶解pH(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0)對(duì)水解度的影響。

1.2.2.6 酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響 選取D/F為4∶1的蛋白酶,在加酶量4 000 U/g、料液比1∶4 (V/V)、酶解溫度50 ℃、酶解pH7.0的條件下,考察酶解時(shí)間(0.5、1、2、3、4、5、6、7、8 h)對(duì)水解度的影響。

1.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以水解度為響應(yīng)值,以加酶量(A)、酶解溫度(B)、酶解pH(C)和酶解時(shí)間(D)為因素,根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)4因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn),確定最優(yōu)酶解條件。各因素水平如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.2.4 水解度測定 分別采用中性甲醛滴定法[13]和凱氏定氮法[13]測定水解液中氨基酸態(tài)氮含量和原料中總氮含量,并按照(1)式計(jì)算水解度:

式(1)

1.2.5 鰹魚肽分子量測定 參考邱娟等[14]的高效體積排阻色譜法并略作修改測定分子量。采用TSKgel G2000 SWXL(300 mm×7.8 mm)色譜柱,以體積比40∶60∶0.05的乙腈:水:三氯乙酸為流動(dòng)相,設(shè)置流速0.5 mL/min,柱溫30 ℃,檢測波長220 nm,將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品上機(jī)分析,用GPC軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,測定鰹魚肽分子量與分子量分布。

1.2.6 鰹魚肽氨基酸組成分析 將樣品用6 mol/L鹽酸在110 ℃下水解24 h,使用全自動(dòng)氨基酸分析儀測定除色氨酸以外的氨基酸[15],色氨酸采用分光光度法測定[16]。

圖1 不同因素對(duì)水解度的影響Fig.1 Effects of different factors on DH

1.2.7 鰹魚肽氨基酸品質(zhì)評(píng)價(jià) 根據(jù)FAO/WHO建議的蛋白質(zhì)理想模式[17]和全雞蛋蛋白質(zhì)模式[18],分別按照(2)(3)(4)計(jì)算氨基酸得分(AAS)、化學(xué)評(píng)分(CS)和必需氨基酸指數(shù)(EAAI)。

AAS=待測測樣品氨基酸含量(mg/g N)/[FAO/WHO評(píng)分模式中同種中同種氨基酸(mg/g N)]

式(2)

CS=待測蛋白質(zhì)氨基酸含量(mg/g N)/雞蛋蛋白質(zhì)中同種氨基酸含量(mg/g N)

式(3)

式(4)

式中:n為必需氨基酸數(shù)目,a、b、c…h(huán)為鰹魚肽必需氨基酸含量(%);A、B、C…H為全雞蛋必需氨基酸含量(%)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,試驗(yàn)重復(fù)3次,結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示;采用Design-expert 8.0進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以水解度為指標(biāo),不同蛋白酶分別在最適條件下水解鰹魚肉的結(jié)果如圖1A所示,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明動(dòng)物蛋白酶的水解度最高為12.35%,風(fēng)味蛋白酶水解度次之為11.81%,與其他蛋白酶相比具有顯著性差異(P<0.05)。由于蛋白酶專一性較強(qiáng),故單一酶對(duì)原料酶解效果可能較弱。風(fēng)味蛋白酶不僅含有風(fēng)味物質(zhì)可掩蓋苦味,而且兼具內(nèi)外切酶,可切除多肽端基的疏水性氨基酸,降低苦味[19]。因此,從水解效果和風(fēng)味方面考慮,選擇動(dòng)物蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶為水解用酶。進(jìn)一步研究動(dòng)物蛋白酶(D)與風(fēng)味蛋白酶(F)酶活比例對(duì)鰹魚肉水解效果的影響,結(jié)果如圖1B所示,當(dāng)D/F為4∶1時(shí),水解度最大,故選酶活比4∶1的復(fù)合酶進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

不同加酶量對(duì)鰹魚肉酶解水解度的影響見圖1C,由圖1C可知,在1000～5000 U/g的范圍內(nèi),水解度隨加酶量的增加先顯著增大(P<0.05),當(dāng)加酶量達(dá)到4000 U/g時(shí),水解度增勢趨于平緩不再發(fā)生顯著變化(P>0.05)。這可能是由于隨著加酶量增大,酶與底物的接觸點(diǎn)增多,酶解效率提高;但當(dāng)加酶量過高時(shí),酶與底物充分接觸,底物水解完全。曹文紅等[20]利用風(fēng)味蛋白酶在加酶量1000～5000 U/g的范圍內(nèi)酶解牡蠣,結(jié)果顯示4000 U/g為最適加酶量,與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

不同料液比對(duì)鰹魚肉酶解水解度的影響見圖1D,由圖1D可知,水解度隨料液比的增大先顯著增加(P<0.05),后略有下降。在料液比為1∶4 (V/V)時(shí),水解度最大。這可能是由于料液比較低時(shí),物料的粘稠度影響底物與酶的接觸,酶解效率較低,隨著料液比增大,酶與底物的接觸點(diǎn)增多,水解度增大,但當(dāng)料液比增加到一定程度時(shí),底物濃度過低導(dǎo)致酶解效率低,引起水解度下降[21]。

不同酶解溫度對(duì)鰹魚肉酶解水解度的影響見圖1E,由圖可知,在40～60 ℃范圍內(nèi),50 ℃時(shí)水解度達(dá)到最大值,超過50 ℃時(shí),水解度顯著下降(P<0.05)。這可能是由于隨著溫度增加,酶促反應(yīng)速率逐漸增大,水解度增大,但當(dāng)溫度過高時(shí),酶的次級(jí)鍵斷裂,蛋白變性,水解度下降[22]。張典等[23]研究了利用胰蛋白酶酶解牡蠣的最適酶解溫度,發(fā)現(xiàn)50 ℃最佳,與本研究結(jié)果一致。

不同酶解pH對(duì)鰹魚肉酶解水解度的影響見圖1F,由圖1F可知,在pH6.0～10.0的范圍內(nèi),水解度隨pH升高先略微增加后顯著降低(P<0.05),在pH7.0時(shí),水解度達(dá)到最大值。這可能是由于在pH過高或過低時(shí),一方面改變酶與底物的帶電狀態(tài),影響兩者結(jié)合[24];另一方面影響酶的穩(wěn)定性使酶遭受不可逆破壞。故選最佳酶解pH為7.0。

不同酶解時(shí)間對(duì)鰹魚肉酶解水解度的影響見圖1G,由圖1G可知,水解度隨著酶解時(shí)間的延長先顯著上升(P<0.05),當(dāng)酶解時(shí)間達(dá)到4 h,水解度增勢趨于平緩(P>0.05)。這可能是由于隨著時(shí)間的延長,底物逐漸被酶解,濃度降低,酶解過程基本趨于平穩(wěn),故選最佳酶解時(shí)間為4 h。

2.2 響應(yīng)面分析

2.2.1 模型回歸與方差分析 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,以加酶量(A)、酶解溫度(B)、酶解pH(C)和酶解時(shí)間(D)作為影響水解度的主要因素,采用4因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)確定復(fù)合酶酶解鰹魚肉的最佳工藝條件,試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Arrangment and results of response surface experiment

2.2.2 回歸模型的建立及顯著性分析 對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,建立水解度(Y)對(duì)加酶量(A)、酶解溫度(B)、酶解pH(C)和酶解時(shí)間(D)的多元二次回歸模型:

Y=20.37+1.12A-0.65B-0.68C+1.51D-0.30AB-0.55AC+0.93AD-0.26BC-0.43BD-0.36CD-0.44A2-2.06B2-1.73C2-0.11D2

表3 響應(yīng)面回歸模型方差分析結(jié)果Table 3 ANOVA for response surface quadratic polynomial models

2.2.3 響應(yīng)面分析 根據(jù)多元二次回歸模型作響應(yīng)面的曲線圖。代表性曲面見圖2,由圖2可知,酶解溫度和酶解pH的等高線為橢圓且與坐標(biāo)軸有一定角度,說明交互作用極其顯著;加酶量和酶解時(shí)間的等高線接近橢圓,說明交互作用顯著。

圖2 交互作用的響應(yīng)面曲線圖Fig.2 Response surface plots for the interactions

2.2.4 最佳酶解條件的確定 在料液比為1∶4 (V/V)的情況下,經(jīng)軟件分析得到最佳酶解條件為加酶量5000 U/g,酶解溫度49.17 ℃,酶解pH6.6,酶解時(shí)間5 h,最大理論水解度為23.74%,在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)測得水解度為23.15%±0.22%,與預(yù)測值相近,偏差較小,具有良好的擬合性。

2.3 鰹魚肽分子量測定與分析

鰹魚肽分子量測定結(jié)果見圖3,由圖3可知,鰹魚肽重均分子量為505 Da,鰹魚肽樣品中分子量在1000 Da以下小肽占比為91.06%,分子量在5000 Da以下小肽占比高達(dá)99.47%,表明經(jīng)雙酶復(fù)合酶解后鰹魚肉蛋白質(zhì)幾乎被完全降解為小分子物質(zhì)。邱娟[14]等酶解牡蠣制備ACE抑制肽的研究發(fā)現(xiàn),牡蠣經(jīng)復(fù)合蛋白酶和堿性蛋白酶酶解后,分子量小于3000 Da的小肽占99.72%,與本研究結(jié)果相似。

圖3 鰹魚肽分子量與分子量分布Fig.3 Molecular weight and molecular weight distribution of Katsuwonus pelamis peptide

2.4 鰹魚肽氨基酸組成分析與營養(yǎng)評(píng)價(jià)

鰹魚肽氨基酸組成如表4所示,包含人體常見的18種氨基酸,氨基酸種類齊全,必需氨基酸含量豐富,必需氨基酸與非必需氨基酸的比為69.84%>60%[25],表明鰹魚肽符合FAO/WHO推薦的優(yōu)質(zhì)蛋白標(biāo)準(zhǔn)。鰹魚肽除含有豐富的營養(yǎng)價(jià)值外,鮮味氨基酸含量也極為豐富,6種鮮味氨基酸(Asp、Glu、Gly、Ala、Tyr、Phe)種類齊全,其中谷氨酸作為鮮味最強(qiáng)的氨基酸含量最高為13.52%。鮮味氨基酸作為呈味基料的基礎(chǔ),使料液呈現(xiàn)出鮮美滋味[26]。由此可見,鰹魚肽是一種營養(yǎng)價(jià)值豐富、風(fēng)味鮮美的優(yōu)質(zhì)海洋蛋白肽資源。

表4 鰹魚肽氨基酸含量分析Table 4 Amino acids contents of Katsuwonus pelamis peptide

表5 鰹魚肽必需氨基酸營養(yǎng)評(píng)價(jià)Table 5 Essential amino acids scores of Katsuwonus pelamis peptide

2.5 鰹魚肽必需氨基酸營養(yǎng)評(píng)價(jià)

鰹魚肽必需氨基酸的氨基酸得分(AAS)、化學(xué)評(píng)分(CS)和必需氨基酸指數(shù)(EAAI)計(jì)算結(jié)果如表5所示:AAS第一限制性氨基酸為Met+Cys,AAS為0.98,評(píng)分最高的是Phe+Tyr,AAS為1.74。CS第一限制性氨基酸為Met+Cys,CS為0.57,評(píng)分最高的是Lys,CS為1.18。結(jié)果表明鰹魚肽的必需氨基酸組成與FAO/WHO建議的必需氨基酸模式及全雞蛋蛋白質(zhì)模式的比例基本一致,符合人體健康的需求。EAAI是評(píng)價(jià)必需氨基酸營養(yǎng)價(jià)值的常用指標(biāo)之一,鰹魚肽的EAAI為0.877，大于FAO/WHO規(guī)定的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)EAAI值0.85,表明鰹魚肽必需氨基酸豐富,營養(yǎng)價(jià)值高,可作為開發(fā)海洋活性蛋白肽的優(yōu)質(zhì)原料。

3 結(jié)論

鰹魚作為一種捕撈量大的金槍魚品種,具有很大的市場潛力,為實(shí)現(xiàn)鰹魚高值化利用,提高鰹魚經(jīng)濟(jì)價(jià)值,本實(shí)驗(yàn)通過優(yōu)化鰹魚肉復(fù)合酶酶解工藝,在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,通過Box-Behnken響應(yīng)面對(duì)鰹魚肽的加酶量、酶解溫度、酶解pH和酶解時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化,確定了最佳酶解工藝條件為:加酶量5000 U/g,酶解溫度49.17 ℃,酶解pH6.6,酶解時(shí)間5 h,最大理論水解度為23.74%,對(duì)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證,實(shí)際水解度為23.15%±0.22%,與響應(yīng)面預(yù)測值吻合度較好;對(duì)鰹魚肽氨基酸組成研究,結(jié)果顯示鰹魚肽含有人體常見的18種氨基酸,必需氨基酸與鮮味氨基酸含量豐富,必需氨基酸含量與FAO/WHO提出的理想蛋白質(zhì)模式和全雞蛋蛋白質(zhì)模式的必需氨基酸含量基本接近,表明鰹魚肽是一種營養(yǎng)價(jià)值豐富且風(fēng)味鮮美的優(yōu)質(zhì)蛋白資源,不僅可作為開發(fā)富含海洋蛋白肽等功能產(chǎn)品的優(yōu)質(zhì)原料,也可作為呈味基料開發(fā)海鮮調(diào)味料等產(chǎn)品,具有很高的應(yīng)用價(jià)值。