溶劑法與超聲輔助法提取黑果枸杞多酚的工藝比較

武 蕓,曾文齊,王麗朋,楊娜娜,胡浩斌

(隴東學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院,甘肅慶陽 745000)

黑果枸杞(LyciumruthenicumMurr.)為茄科(Solanceae)枸杞屬(LyciumL.)植物,是重要的藥食同源植物[1-2],被收載于《晶珠本草》、《四部醫(yī)典》等藏藥著作中,是近年來新發(fā)掘的多年生耐鹽、抗旱野生植物資源[3-5]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)及營養(yǎng)學(xué)表明,黑果枸杞具有抗氧化[6-8]、抗動(dòng)脈粥樣硬化[9]、抗炎[10]、抗疲勞[11-12]、增強(qiáng)腸道屏障功能[13]、防治心腦血管疾病[14]、防痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎[15]等功效,被譽(yù)為“軟黃金”、“花青素之王”,是現(xiàn)階段枸杞育種和藥效研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。經(jīng)查閱大量文獻(xiàn),有關(guān)黑果枸杞的研究多見營養(yǎng)成分[16]和花色苷[17]、花青素[18-20]、多糖[21-22]等成分的提取分離研究。黑果枸杞多酚提取工藝研究未見報(bào)道。近年來,由于植物多酚在抗炎、抗氧化、抗腫瘤、保護(hù)神經(jīng)等方面顯示出良好作用而具有廣泛的應(yīng)用前景[23-24],成為生命科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。

植物多酚的提取方法主要有溶劑法、金屬離子沉淀法、層析法、超臨界二氧化碳萃取法、濾膜發(fā)、超聲輔助法、微波萃取法等。其中,超聲輔助法利用超聲波的機(jī)械效應(yīng)、空化效應(yīng)及熱效應(yīng),加強(qiáng)了細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的釋放與擴(kuò)散,從而加速了有效成分的浸出。超聲輔助法與溶劑法均有操作簡便、提取溫度低、提取物結(jié)構(gòu)不易破壞等優(yōu)點(diǎn)。因此,本文采用溶劑法和超聲輔助法對(duì)黑果枸杞多酚進(jìn)行了提取,利用Box-Behnken(BB)響應(yīng)面法優(yōu)化了工藝參數(shù),并對(duì)兩種提取方法進(jìn)行了比較,為黑果枸杞多酚的深入研究,應(yīng)用開發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels in response surface design

黑果枸杞 產(chǎn)自甘肅省民勤縣;沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品(質(zhì)量分?jǐn)?shù)90.8%) 中國食品藥品鑒定研究院;福林酚試劑 實(shí)驗(yàn)室自制;無水碳酸鈉 上海朗瑞精細(xì)化學(xué)品有限公司。

BSA224S型電子天平 北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;FZ102微型植物試樣粉碎機(jī)北京中興偉業(yè)儀器有限公司;SB-5200DTD型超聲波清洗機(jī) 寧波新芝生物科技有限公司;800離心機(jī) 常州國華電器有限公司;7230G可見分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;DHG型電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;HHS電熱恒溫水浴鍋 上海醫(yī)療器械五廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黑果枸杞多酚提取方法 黑果枸杞經(jīng)過陰干、粉碎,過100目標(biāo)準(zhǔn)篩,放入干燥器中,-5 ℃保存、備用。準(zhǔn)確稱取黑果枸杞粉末0.5 g,置于100 mL錐形瓶中,加入一定量的溶劑。分別依據(jù)不同工藝條件采用溶劑法和超聲輔助法進(jìn)行多酚提取,其中溶劑法選取乙醇體積分?jǐn)?shù)(30%、40%、50%、60%、70%、80%)、液料比(10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1 mL/g)、提取溫度(20、30、40、50、60、70 ℃)、提取時(shí)間(20、40、60、80、100、120、140、160 min)四個(gè)因素,固定因素水平為乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、液料比50∶1 mL/g、提取溫度50 ℃、提取時(shí)間40 min。超聲輔助法選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取溫度(與溶劑法選取水平相同)、提取時(shí)間(10、20、30、40、50、60、70 min)、超聲功率(120、150、180、210、240、270、300 W)五個(gè)因素,固定因素水平為乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、液料比50∶1 mL/g、提取溫度40 ℃、提取時(shí)間30 min、超聲功率240 W。將提取液離心,取上清液及洗滌液于50 mL容量瓶中、定容、搖勻,測(cè)定其多酚含量并計(jì)算提取率。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線配制 質(zhì)量濃度范圍為9.325～65.276 μg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,采用Ainsworth等[25]的方法繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=0.01265C+0.02558(R=0.99877),總多酚提取率(TPC)以沒食子酸當(dāng)量計(jì),單位mg/g。

1.2.3 黑果枸杞多酚得率的測(cè)定 參照Ainsworth等[25]的方法并修改如下:將“1.2.1”中定容好的提取液稀釋一定倍數(shù),即得測(cè)試液。取1 mL測(cè)試液于10 mL具塞試管中,加入1.5 mL福林酚試劑稀釋液(V蒸餾水/V福林酚試劑=3∶1),靜置5 min,加入1.5 mL7.5% Na2CO3溶液,用蒸餾水稀釋至刻度線、搖勻,黑暗中反應(yīng)1 h,測(cè)定吸光度測(cè)定。根據(jù)“1.2.2”中的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算測(cè)試液中多酚濃度,并根據(jù)式(1)計(jì)算多酚得率。

式(1)

其中:Y為多酚得率,mg/g;C為測(cè)試液多酚質(zhì)量濃度,μg/mL;m為原料質(zhì)量,g;DF:稀釋倍數(shù),50/3;50為提取液體積,mL;1000:單位換算系數(shù)。

1.2.4 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化 以單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果為依據(jù),采用Minitab 17.1.0軟件進(jìn)行Plackett-Burnman試驗(yàn)設(shè)計(jì),對(duì)兩種提取方法的影響因素進(jìn)行顯著性篩選,發(fā)現(xiàn)在溶劑法中,顯著性影響因素為乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度和提取時(shí)間,而在超聲輔助法中,顯著性影響因素為液料比、提取溫度、提取時(shí)間。以顯著性影響因素為研究對(duì)象,非顯著性影響因素保持單因素實(shí)驗(yàn)中的最優(yōu)水平,分別進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn),試驗(yàn)因素及水平見表1。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。采用Origin 8.0軟件作圖,利用Design-Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)及優(yōu)化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種提取方法的單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)多酚得率的影響 由圖1可知,兩種提取方法提取率均隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大先增大后減小,并且均在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)。根據(jù)相似相容原理,60%乙醇的極性和黑果枸杞多酚類化合物的極性相當(dāng),故此時(shí)得率達(dá)到最高。所以,溶劑法選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)60%進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì),超聲輔助法響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)中,乙醇體積分?jǐn)?shù)保持60%。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)多酚得率的影響Fig.1 Effects of ethanol volume fraction on the yield of polyphenols

2.1.2 液料比對(duì)多酚得率的影響 由圖2可知,溶劑法和超聲輔助法中,隨著液料比的增大,得率均逐漸增大,液料比達(dá)到50∶1 mL/g后,多酚得率變化不明顯?？赡苁请S著液料比增加,使得提取劑和黑果枸杞原料能夠充分接觸,并且在提取時(shí)間范圍內(nèi)能夠保持較大的傳質(zhì)推動(dòng)力,故得率增加,液料比達(dá)到50∶1 mL/g之后,雜質(zhì)溶出率增大,多酚基本已經(jīng)達(dá)到了最大溶出率,所以得率變化不大。所以,超聲輔助法選擇液料比50∶1 mL/g進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì),溶劑法響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)中,液料比保持50∶1 mL/g。

圖2 液料比對(duì)多酚得率的影響Fig.2 Effects of liquid to solid ratio on the yield of polyphenols

2.1.3 提取溫度對(duì)多酚得率的影響 由圖3可知,兩種提取方法,隨著提取溫度的增大,得率均先增大后減小,原因可能是,溫度較低時(shí),多酚類成分在提取劑中的溶解度較小,溫度高于某值時(shí),又會(huì)導(dǎo)致多酚類化合物的降解,因此存在一個(gè)適宜的溫度值使得得率最高。其次,可以看出,超聲輔助法在提取溫度為40 ℃時(shí)得率達(dá)到最大,而溶劑法在50 ℃達(dá)到最大,可能是超聲輔助提取的空化效應(yīng)和熱效應(yīng)使得超聲輔助法比溶劑法所需的適宜提取溫度低。所以,超聲輔助法與溶劑法分別選擇提取溫度為40與50 ℃進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)。

圖3 提取溫度對(duì)多酚得率的影響Fig.3 Effects of temperature on the yield of polyphenols

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)多酚得率的影響 由圖4可知,溶劑法和超聲輔助法中,隨著提取時(shí)間的延長,得率均先增大后減小,可能是提取時(shí)間較短時(shí),多酚類成分沒有有效溶出,未達(dá)到溶解平衡;而提取時(shí)間過長,一方面長時(shí)間處于被加熱狀態(tài)下,多酚可能會(huì)降解;另一方面,雜質(zhì)溶出量增大,故導(dǎo)致多酚得率下降。從圖4中還可以看出,超聲輔助法在提取30 min時(shí)得率達(dá)到最大,而溶劑法在40 min時(shí)達(dá)到最大,說明超聲輔助提取效率高。所以,超聲輔助法與溶劑法分別選擇提取時(shí)間為30與40 min進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)。

圖4 提取時(shí)間對(duì)多酚得率的影響Fig.4 Effects of time on the yield of polyphenols

圖5 超聲功率對(duì)多酚提取率的影響Fig.5 Effects of ultrasonic power on the yield of polyphenols

2.1.5 超聲功率對(duì)多酚得率的影響 由圖5可知,在超聲輔助法中,隨著超聲功率的增大,得率均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì),并且在240 W時(shí),得率達(dá)到了最大值,從總趨勢(shì)看,超聲功率對(duì)得率的影響不顯著。超聲輔助法響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)中,超聲功率保持240 W。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 BB experimental design and results

表3 溶劑法方差分析結(jié)果Table 3 BB design ANOVA results of Solvent Extraction

2.2 兩種提取方法的響應(yīng)面試驗(yàn)及結(jié)果

采用Box-Behnken進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì),結(jié)果見表2。

依據(jù)表2中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),采用Design expert 8.0.6軟件進(jìn)行多元回歸擬合并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,溶劑提取法得到的數(shù)學(xué)模型為Y=35.58+1.34A+0.94B-0.80C+0.29AB-1.54AC+1.00BC-1.72A2-1.16B2-3.08C2,其方差分析結(jié)果見表3。超聲輔助法得到的數(shù)學(xué)模型為Y=39.55+0.45A-0.85B+0.17C+0.29AB+0.55AC+0.16BC-3.53A2-0.94B2-1.58C2,其方差分析結(jié)果見表4。

表4 超聲輔助法方差分析結(jié)果Table 4 BB design ANOVA results of Ultrasonic-assisted Extraction

圖6 溶劑法響應(yīng)面3D圖Fig.6 Response surface graph of solvent extraction

圖7 超聲輔助法響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface graph of ultrasonic-assisted extraction

由圖6、圖7可以看出,任意兩個(gè)顯著性影響因素所形成的響應(yīng)曲面均呈現(xiàn)中心凸起四周下降的趨勢(shì),說明溶劑提取和超聲輔助提取實(shí)驗(yàn)中,響應(yīng)面選取水平范圍準(zhǔn)確,并且在選取的實(shí)驗(yàn)水平范圍內(nèi),兩種提取方法均存在黑果枸杞多酚的最高得率,說明通過兩種模型預(yù)測(cè)的最佳提取工藝均科學(xué)合理。

采用Design expert 8.0.6軟件對(duì)兩種提取方法所得二次多項(xiàng)式進(jìn)行解析,并根據(jù)儀器的實(shí)際操作范圍進(jìn)行近似處理,得到黑果枸杞多酚溶劑法最佳工藝條件為:乙醇體積分?jǐn)?shù)70%,提取溫度58 ℃,提取時(shí)間37 min,液料比50∶1 mL/g;超聲輔助提取最佳工藝條件為:液料比50∶1 mL/g,提取時(shí)間31 min,提取溫度36 ℃,乙醇體積分?jǐn)?shù)60%,超聲功率240W。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

在模型預(yù)測(cè)的最佳工藝條件下,每種提取方法分別進(jìn)行3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),實(shí)際提取率取平均值,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5所示。

表5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of verification tests

由表5可知,兩種提取方法的實(shí)際得率與預(yù)測(cè)值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于1%,說明優(yōu)化模型具有良好的預(yù)測(cè)能力,實(shí)驗(yàn)中所得最佳提取工藝準(zhǔn)確、可靠。

2.4 提取方法比較

本文對(duì)溶劑法和超聲輔助法對(duì)黑果枸杞多酚的最佳提取工藝條件及得率進(jìn)行了比較,如表6所示。

表6 溶劑法與超聲輔助法的比較Table 6 Comparison on solvent extraction and ultrasonic-assisted extraction

由表6可知,首先最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)溶劑法是超聲輔助法的1.16倍、液料比相同,說明采用溶劑法,有機(jī)溶劑乙醇的消耗量較超聲提取法大、提取成本提高;其次,溶劑法的提取溫度比超聲輔助法高22 ℃,并且超聲輔助法較溶劑法提取時(shí)間縮短16.22%,說明溶劑法能耗高、持續(xù)時(shí)間長,使得提取操作費(fèi)用大大增加,并且較高的溫度容易導(dǎo)致多酚降解而使得得率下降,可以看出溶劑法得率較低。

超聲輔助法中,超聲波振動(dòng)是能產(chǎn)生并傳遞強(qiáng)大的能量,引起多酚以較大的傳質(zhì)速率進(jìn)入提取劑中,同時(shí)在液相中還會(huì)產(chǎn)生空化作用,即在有相當(dāng)大的破壞力的作用下,液體內(nèi)形成空化泡的現(xiàn)象,從而提高提取效率。

3 結(jié)論

本研究通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法分別優(yōu)化了溶劑法和超聲輔助法提取黑果枸杞多酚的工藝參數(shù),并對(duì)兩種提取方法進(jìn)行了比較。得出溶劑法提取黑果枸杞多酚的最佳參數(shù)為:乙醇體積分?jǐn)?shù)70%,提取溫度58 ℃,提取時(shí)間37 min,液料比50∶1 mL/g,多酚得率為35.9021 mg/g,與理論預(yù)測(cè)值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.95%。;超聲輔助法提取黑果枸杞多酚的最佳參數(shù)為:乙醇體積分?jǐn)?shù)60%,液料比50∶1 mL/g,提取溫度36 ℃,提取時(shí)間31 min,超聲功率240 W,黑果枸杞多酚的得率可達(dá)39.6845 mg/g,與理論預(yù)測(cè)值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.29%。超聲輔助法工藝簡單、經(jīng)濟(jì)、省時(shí)、能耗低、提取率高,更適合黑果枸杞多酚類成分的提取。研究結(jié)果可為黑果枸杞多酚開發(fā)應(yīng)用、深入研究提供了一定的理論依據(jù)。