1,10-癸二醇對殺鮭氣單胞菌群體感應的抑制作用

牛慧超,李婷婷,劉景云,孫曉佳,勵建榮,*,謝 晶,牟偉麗,沈 琳,勞敏軍,郭曉華,鄧尚貴

(1.渤海大學食品科學與工程學院,生鮮農產(chǎn)品貯藏加工 及安全控制技術國家地方聯(lián)合工程研究中心,遼寧錦州 121013; 2.大連民族大學生命科學學院,遼寧大連 116600; 3.上海海洋大學食品學院,上海 201306; 4.蓬萊京魯漁業(yè)有限公司,山東煙臺 265600; 5.大連東霖食品股份有限公司,遼寧大連 116100; 6.浙江興業(yè)集團有限公司,浙江舟山 316120; 7.山東美佳集團有限公司,山東日照 276800 8.浙江海洋大學,浙江舟山 316022)

水產(chǎn)品是我們生活中不可或缺的食物,水產(chǎn)品中富含蛋白質和營養(yǎng)成分,例如DHA、EPA和?；撬醄1-2],深受消費者的青睞。水產(chǎn)品不但富含營養(yǎng),而且具有美味的口感[3],但由于肌肉組織柔軟,含水量高,并且不飽和脂肪酸易于氧化,因此在儲存和運輸過程中很容易腐敗[4]。水產(chǎn)品的腐敗變質的原因是多方面的,其腐敗機制與生物、化學、物理等復雜的變化有關[5]。研究發(fā)現(xiàn)微生物是導致水產(chǎn)品腐敗的最常見原因,近年來由微生物所致的食品腐敗中檢測到不同類型的信號分子(N-acyl-homoserinelactones,AHLs),且魚類腐敗菌主要以AHLs介導調控毒力因子和致腐因子表達,進而影響水產(chǎn)品腐敗變質[6],群體感應(Quorum sensing,QS)系統(tǒng)參與調控微生物的腐敗[7]。殺鮭氣單胞菌便是一種水產(chǎn)品腐敗菌。

QS系統(tǒng)是細菌之間信息交換的一種機制。它產(chǎn)生并感應稱為自動誘導劑的信號分子,以監(jiān)測其種群密度并調節(jié)細菌的許多生理功能,例如:生物發(fā)光、細菌運動、毒素分泌、生物被膜[8]形成和其他次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生[9-11],細菌進行這些生理活動便會對食物造成腐敗。群體感應抑制劑(Quorum sensing inhibitors,QSIs)是指可以破壞或者干擾細菌間QS系統(tǒng)的物質,理想的QS抑制劑已被定義為化學穩(wěn)定和高效的低分子質量分子,其對QS調節(jié)具有高度的特異性,并且無毒副作用[12],破環(huán)水產(chǎn)品中腐敗菌的QS系統(tǒng),可以有效減少水產(chǎn)品腐敗變質帶來的經(jīng)濟損失。1,10-癸二醇是一種化學物質,它的分子式是C10H22O2,可以由人工合成,主要用來制備香精香料,中藥柴胡中也含有這種物質。本研究團隊在對群體感應抑制劑進行虛擬篩選時,發(fā)現(xiàn)1,10-癸二醇可作為群體感應抑制劑[13],故本文探究其對殺鮭氣單胞菌群體感應系統(tǒng)的抑制效果,并對新型群體感應抑制劑的研發(fā)提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大黃魚源殺鮭氣單胞菌 由本實驗室分離并鑒定(于2019年5月從腐敗大黃魚中進行分離);紫色桿菌CV026(ChromobacteriumviolaceumCV026) 為C.violaceumATCC 31532的mini-Tn5突變體,該菌株自己不會產(chǎn)生AHLs,對短鏈的AHLs(C4～C8)具有敏感性,當加入外源AHLs培養(yǎng)時,會產(chǎn)生特征性紫色菌素[14-15];1,10-癸二醇 上海阿拉丁生化科技股份有限公司(人工合成);LB肉湯 青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司;甲醇 天津市津東天正精細化學試劑廠;卡那霉素、信號分子標準品 美國Sigma公司;結晶紫 天津致遠化學試劑有限公司。

SW-CJ-2FD超凈工作臺 蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司;MLS-3030CH立式壓力蒸汽滅菌鍋 廣州三洋電機有限公司;Biofuge Strotas冷凍高速離心機 美國Thermo Fisher公司;iMark酶標儀 美國Bio-Rad公司;SS-4800場發(fā)射掃描電子顯微鏡 江蘇太倉市實驗設備廠;LRH-150生化培養(yǎng)箱 上海一恒科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)條件 本實驗中,所用報告菌株CV026和殺鮭氣單胞菌株培養(yǎng)均在160 r/min、28 ℃下培養(yǎng),平板培養(yǎng)均在28 ℃的生化培養(yǎng)箱中;菌株活化:將報告菌株CV026和殺鮭氣單胞菌分別接種于新鮮的LB肉湯中過夜活化,接種時菌液與肉湯的體積比例為1∶100。

1.2.2 1,10-癸二醇的抑菌活性和QSIs抑制活性的測定 將報告菌株CV026和殺鮭氣單胞菌活化兩次后,分別接種于新鮮的LB肉湯中,接種時菌液與肉湯的體積比例為1∶100,接種CV026的肉湯中需要加入卡那霉素,卡那霉素在肉湯中的濃度為20 μL/mL。培養(yǎng)完成后將菌液與LB營養(yǎng)瓊脂混合,倒平板,用牛津杯打孔。待平板凝固后,向孔中加濃度為0.4 mg/mL的1,10-癸二醇溶液(1,10-癸二醇用體積分數(shù)50%的甲醇溶液溶解)。以體積分數(shù)50%的甲醇溶液作為陰性對照。然后將平板放置在的28 ℃生化培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)并觀察1,10-癸二醇對CV026和殺鮭氣單胞菌生長情況的影響。

將報告菌株CV026接種于添加有卡那霉素的LB肉湯中培養(yǎng)完成后,將菌液與LB營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基混合,然后加入C6-HSL(N-Hexanoyl-L-hoMoserine lactone)并混勻,用牛津杯打孔法,將濃度為0.4 mg/mL的1,10癸二醇溶液加入到孔中。以體積分數(shù)50%的甲醇溶液作為陰性對照。然后將平板置于生化培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng),觀察1,10-癸二醇對紫色菌素的抑制情況。

1.2.3 1,10-癸二醇對紫色桿菌生長及紫色菌素產(chǎn)量的影響 根據(jù)文獻[16]中的方法,將活化后的報告菌株CV026接種于添加了不同質量濃度(0.1、0.2、0.3、0.4 mg/mL)的1,10-癸二醇溶液的新鮮LB肉湯中,并且肉湯中添加C6-HSL。同時,加入一組質量濃度不同但沒有信號分子的1,10-癸二醇溶液的實驗組,以觀察1,10-癸二醇是否對菌株的生長有影響。以加入50%體積的甲醇溶液實驗組設為陰性對照。

培養(yǎng)完成后,從添加了信號分子的實驗組中分別吸取300 μL的菌液加入滅過菌的1.5 mL離心管中,各加入150 μL 10%的十二烷基硫酸鈉,用振蕩器振蕩10 s,再加入600 μL的正丁醇后,用振蕩器振蕩5 s,接著用離心機以10000 r/min離心5 min,最后吸取200 μL的紫色上清液加入到96孔板中,使用酶標儀于波長為595 nm處測定OD值。同時將加入了不同質量濃度的1,10-癸二醇溶液但是不添加信號分子的實驗組的菌液各吸取200 μL加入到96孔板中,同樣在波長為595 nm處測定其OD值。

1.2.4 1,10-癸二醇對殺鮭氣單胞菌胞外蛋白酶活力的影響 根據(jù)參考文獻[17],配制脫脂牛奶平板,倒平板,用牛津杯打孔,凝固后,向孔中分別加入200 μL制作好的殺鮭氣單胞菌的菌懸液,菌懸液中分別含有不同質量濃度(0.1、0.2、0.3、0.4 mg/mL)的1,10-癸二醇溶液,并設置不添加1,10-癸二醇的陰性對照組以及添加C6-HSL信號分子的陽性對照組,然后將平板放置于生化培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

1.2.5 1,10-癸二醇對殺鮭氣單胞菌群集現(xiàn)象和泳動現(xiàn)象的影響 根據(jù)參考文獻[18],配置群集與泳動所需要的培養(yǎng)基,將1,10-癸二醇溶液用0.22 μm的濾膜過濾后,分別與所配制的群集和泳動的培養(yǎng)基混合均勻,并使1,10-癸二醇的終濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4 mg/mL。并設置不添加1,10-癸二醇的陰性對照組以及添加C6-HSL信號分子的陽性對照組。然后倒平板,用牛津杯打孔,待平板冷卻凝固后,分別向平板表面中央添加2 μL過夜活化兩次的殺鮭氣單胞菌液,等平板表面所加的菌液風干后,進行培養(yǎng)。

1.2.6 1,10-癸二醇對殺鮭氣單胞菌生物被膜生成的影響

1.2.6.1 酶標法測定1,10-癸二醇對殺鮭氣單胞菌生物被膜生成量的影響 根據(jù)參考文獻[19],將殺鮭氣單胞菌活化后,與新鮮的LB肉湯培養(yǎng)液按照1∶100 (V/V)混合均勻后,吸取1 mL加入到滅過菌的1.5 mL離心管中,然后分別加入1,10-癸二醇溶液,并使其終濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4 mg/mL,另設置加入體積分數(shù)為50%的甲醇溶液作為陰性對照組以及加入C6-HSL信號分子作為陽性對照組。培養(yǎng)完成后,分別吸取200 μL用于測定菌液密度。將剩余菌液倒掉,分別用無菌水清洗3次后,在無菌風下自然干燥35 min,接著再分別加入1 mL 1 g/L的結晶紫染液,室溫下染色15 min后,倒去結晶紫染液,再用無菌水清洗5次,最后分別加入1 mL的體積分數(shù)為33%的冰醋酸溶液。充分溶解后,各吸取200 μL于96孔板中,用酶標儀在波長為595 nm處測定OD值。殺鮭氣單胞菌生物被膜的相對生成率按公式(1)計算。

生物被膜相對生成率(%)=(OD595 nm實驗組/OD595 nm陰性對照組)×100

式(1)

式中:OD595 nm實驗組為加入1,10-癸二醇或C6-HSL的實驗組測得的值;OD595 nm陰性對照組為加入體積分數(shù)為50%的甲醇溶液所測得的值。

1.2.6.2 掃描電子顯微鏡觀測 1,10-癸二醇對殺鮭氣單胞菌生物被膜形態(tài)的影響 預處理鋅片(純度≥99.0%,厚度0.20 mm):將去除氧化層的鋅片切割成6×6 mm大小后,先浸入無水乙醇中超聲,然后浸入去離子水中超聲,取出后烘干,滅菌備用。

將10 mL含有殺鮭氣單胞菌菌液LB肉湯倒入無菌培養(yǎng)皿中,殺鮭氣單胞菌菌液的體積占比為1%,再分別加入1,10-癸二醇溶液,終濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4 mg/mL,另設置不添加1,10-癸二醇溶液作為陰性對照組以及加入C6-HSL信號分子作為陽性對照組?；旌暇鶆蚝髮㈩A處理好的鋅片放入其中,放置于生化培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

在取出鋅片前,準備好無菌水,以及配制好體積分數(shù)為2.5%的戊二醛溶液,并將戊二醛溶液置于4 ℃的冰箱預冷,取出鋅片后,用預先準備好的無菌水將鋅片沖洗3～5次,然后將鋅片放入準備好的戊二醛溶液中浸泡,浸泡結束后,放入梯度體積分數(shù)乙醇中進行脫水,再用醋酸異戊脂置換兩次,最后將鋅片室溫下自然干燥,噴金處理后進行觀測。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個實驗做三個平行,實驗數(shù)據(jù)均用Excel 2010建立數(shù)據(jù)庫,采用SPSS 20.0統(tǒng)計分析軟件進行實驗數(shù)據(jù)處理,采用Origin 9.0軟件作圖,實驗數(shù)據(jù)處理結果均以“平均值±標準偏差”表示。顯著性差異分析P<0.05。

2 結果與分析

2.1 1,10-癸二醇的抑菌活性和QS抑制活性測定

圖1所示為0.4 mg/mL的1,10-癸二醇濃度對CV026菌株產(chǎn)紫色菌素的抑制效果圖。由圖可以看出,加入體積分數(shù)為50%的甲醇溶液的孔周圍是被紫色包圍的,說明溶劑不具有QS抑制作用;而加入1,10-癸二醇溶液的孔周圍出現(xiàn)白色且渾濁的圈,這證明1,10-癸二醇溶液可以抑制紫色菌株CV026產(chǎn)生紫色菌素。

圖1 1,10-癸二醇對紫色桿菌 CV026產(chǎn)紫色菌素能力的抑制活性Fig.1 Inhibitory activity of 1,10-decanediol on violacein production of CV026注:1:體積分數(shù)為50%的甲醇溶液; 2:0.4 mg/mL的1,10-癸二醇溶液。

2.2 1,10-癸二醇對紫色桿菌的生長及紫色菌素產(chǎn)量影響的影響

從圖2中可以看出,與對照組相比,1,10-癸二醇溶液處理組中的紫色菌素產(chǎn)量顯著(P<0.05)下降,而且隨著濃度逐漸增大,紫色菌素的產(chǎn)量也隨之減少。此外,加入1,10-癸二醇溶液后,CV026菌株的菌液密度沒有顯著性差異,表明生長并未受到影響。由此可知,1,10-癸二醇的QS抑制活性不是由于細菌生長受到抑制,而是通過干擾QS系統(tǒng)實現(xiàn)的。

圖2 1,10-癸二醇溶液對紫色菌株 CV026紫色菌素產(chǎn)量和菌液密度的影響Fig.2 Effect of 1,10-decanediol solution on violacein production and bacterial density of CV026注:不同大寫或小寫字母表示差異顯著(P<0.05),圖4、圖6同。

2.3 1,10-癸二醇對殺鮭氣單胞菌胞外蛋白酶活力的影響結果

微生物造成水產(chǎn)品的腐化,是通過蛋白酶水解水產(chǎn)品中的蛋白質,同時會利用分解產(chǎn)物繁殖[20-21]。結合圖3和圖4可以看出,各組數(shù)據(jù)之間差異性顯著(P<0.05),當有外源C6-HSL信號分子的作用時,殺鮭氣單胞菌分泌的胞外蛋白酶產(chǎn)生的水解圈直徑(平均直徑)最大為26.195 mm,表明蛋白酶活性受QS系統(tǒng)調控,并且C6-HSL信號分子能夠促進殺鮭氣單胞菌胞外蛋白酶的產(chǎn)生。而當加入1,10-癸二醇溶液后,胞外蛋白酶產(chǎn)生的水解圈直徑隨著1,10-癸二醇溶液濃度的增大而逐漸減小。這表明1,10-癸二醇可以通過干擾QS系統(tǒng)抑制其殺鮭氣單胞菌蛋白酶的活性。梅永超等[22]通過研究發(fā)現(xiàn)綠薄荷精油可以通過調控QS機制來達到抑制溫和氣單胞菌胞外蛋白酶的產(chǎn)生。

圖3 1,10-癸二醇對殺鮭氣單胞菌 胞外蛋白酶活力的影響Fig.3 Effect of 1,10-decanediol on extracellular protease activity of Aeromonas salmon注:A:C6-HSL;B:0 mg/mL;C:0.1 mg/mL; D:0.2 mg/mL;E:0.3 mg/mL;F:0.4 mg/mL。

圖4 1,10-癸二醇對殺鮭氣單胞菌 胞外蛋白酶活力的影響Fig.4 Effect of 1,10-decanediol on extracellular protease activity of Aeromonas salmon

2.4 1,10-癸二醇對殺鮭氣單胞菌群集現(xiàn)象和泳動現(xiàn)象的影響

群集和泳動是細菌由鞭毛介導在接觸表面遷移的兩種方式,這兩種運動方式的區(qū)別在于培養(yǎng)基的瓊脂含量不同[23-25]。研究表明,細菌的群集和泳動能力對生物被膜的形成過程有極其重要的影響[26]。Zhang[27]等發(fā)現(xiàn)了精油成分對微生物的群集和泳動有抑制效果。

從圖5中可以看出,外源C6-HSL信號分子處理組中殺鮭氣單胞菌的遷移范圍明顯增大。而加入了1,10-癸二醇溶液后,運動能力是與1,10-癸二醇溶液的濃度呈負相關的,隨著1,10-癸二醇溶液濃度不斷的增大,其運動能力也越來越弱。當1,10-癸二醇的濃度為0.4 mg/mL時,殺鮭氣單胞菌的運動能力變得極其微弱。

2.5 1,10-癸二醇對殺鮭氣單胞菌生物被膜生成的影響

2.5.1 1,10-癸二醇對殺鮭氣單胞菌生物被膜生成量的影響 生物被膜的形成是細菌為了適應自然環(huán)境且利于細菌生存的一種生命現(xiàn)象,由微生物及其分泌物積聚而形成,其自身包繞于積聚物中形成的大量細菌聚集膜樣物。作為細菌保護自身的生長方式,其對環(huán)境變化的耐受力遠高于浮游菌,一旦在食品加工設備表面形成,很容易對食品造成嚴重污染[28]。

圖5 1,10-癸二醇對殺鮭氣單胞菌群集、泳動的影響Fig.5 Effect of 1,10-decanediol on swarming and swimming motility of Aeromonas salmon注:A:1,10-癸二醇對殺鮭氣單胞菌群集的影響;B:1,10-癸二醇對殺鮭氣單胞菌泳動的影響。 1:C6-HSL;2:0 mg/mL;3:0.1 mg/mL;4:0.2 mg/mL;5:0.3 mg/mL;6:0.4 mg/mL。

從圖6中可以看到,無論加入外源C6-HSL信號分子,還是加入不同濃度的1,10-癸二醇溶液,殺鮭氣單胞菌的菌液濃度都無顯著性差異,表明都不會影響殺鮭氣單胞菌的生長,而對生物被膜的相對生成率則有顯著差異,表明對生物被膜的生成有顯著影響。加入外源C6-HSL信號分子的陽性對照組對陰性對照組來說,殺鮭氣單胞菌的生物被膜生成率提高了20.5%。而加入了1,10-癸二醇溶液后,隨著濃度的增大,殺鮭氣單胞菌的生物被膜生成率相應地降低。當1,10-癸二醇溶液的濃度為0.4 mg/mL時,生物被膜的生成率降低了76.92%。這表明,1,10-癸二醇可以通過調控殺鮭氣單胞菌的QS機制來調控其生物被膜的生成。并且發(fā)現(xiàn)研究結果與群集、泳動的研究結果互相印證。

圖6 1,10-癸二醇對殺鮭氣 單胞菌生物被膜生成率的影響Fig.6 Effect of 1,10-decanediol on biofilm formation rate of Aeromonas salmon

2.5.2 1,10-癸二醇對殺鮭氣單胞菌生物被膜形態(tài)的影響 圖7是通過掃描電子顯微鏡觀察殺鮭氣單胞菌形成的生物被膜結構的圖片。其中A為添加了外源C6-HSL信號分子的陽性對照組所生成的生物被膜形態(tài),B為陰性對照組生物被膜所生成的形態(tài),從圖中可以看出陰性對照組所生成的生物被膜均勻致密,將載體表面全部覆蓋;而陽性對照組中生物被膜形態(tài)不僅結構致密,而且還形成堆疊狀態(tài),形成的生物被膜更厚。其中C～F分別是1,10-癸二醇溶液濃度為0.1、0.2、0.3、0.4 mg/mL時所形成的生物被膜的形態(tài),可以看出當加入1,10-癸二醇溶液后,殺鮭氣單胞菌隨形成生物被膜出現(xiàn)裂縫,而且隨著添加的1,10-癸二醇濃度的增大裂縫也變得越來越多,其中D圖的裂縫多余C圖,而E圖中膜已成完全龜裂狀,F圖中膜則破碎嚴重且面積縮小。結果表明,1,10-癸二醇可以干擾并減弱殺鮭氣單胞菌形成生物被膜的能力。

圖7 1,10-癸二醇對殺鮭氣單胞 菌生物被膜影響的掃描電鏡圖Fig.7 Scanning electron microscopic images of the effect of 1,10-decanediol on biofilm of Aeromonas salmon注:A:C6-HSL;B:0 mg/mL;C:0.1 mg/mL; D:0.2 mg/mL;E:0.3 mg/mL; F:0.4 mg/mL;放大倍數(shù):10000倍。

3 結論

本研究選取了1,10-癸二醇這種物質來作為群體感應抑制劑。通過作用于添加了外源信號分子的紫色菌株CV026來證明1,10-癸二醇在亞抑菌濃度下有抑制細菌群體感應現(xiàn)象的作用。研究結果表明1,10-癸二醇可以很大程度地抑制紫色菌株CV026產(chǎn)生紫色菌素的量,并對殺鮭氣單胞菌的胞外蛋白酶活性、群集和泳動的能力以及形成生物被膜的能力均有較強的抑制作用,而且隨著1,10-癸二醇溶液的濃度增大,其抑制效果也越來越明顯。1,10-癸二醇對可以有效的抑制殺鮭氣單胞菌的QS機制,可以做為新的保鮮劑,用來延長水產(chǎn)品的保存期限,減少由于腐敗造成的經(jīng)濟損失。