湯璐瑤,黃子林,黃林玉,呂一品,唐 雪
(江南大學(xué)食品學(xué)院,食品營養(yǎng)與功能食品工程技術(shù)研究中心,江蘇無錫 214122)
中華絨螯蟹(Chinese mitten crab),又稱大閘蟹、河蟹或螃蟹,肉味鮮美,含有多種維生素、蟹紅素、蟹黃素等,營養(yǎng)價值較高,是我國長江中下游地區(qū)最重要的養(yǎng)殖對象之一[1]。河蟹養(yǎng)殖中,通常會出現(xiàn)性早熟的一齡河蟹以及小規(guī)格的二齡河蟹,如果作為鮮活水產(chǎn)品銷售,價格極低[2];若加工處理為香辣蟹等產(chǎn)品銷售,則對河蟹鮮美風(fēng)味破壞較為嚴(yán)重。針對這種小規(guī)格河蟹,通常采用整體蒸煮的加工方式,人工挑出蟹肉蟹黃,經(jīng)過加熱熬制,可獲得具有河蟹鮮香風(fēng)味的蟹肉蟹油半成品,可直接用于餐飲消費和菜肴增鮮提味[3]。然而由于蟹肉蟹油中蛋白質(zhì)和脂肪含量較高,暴露在空氣中極易被氧化腐敗變質(zhì),導(dǎo)致其保質(zhì)期不長,在運輸過程中又極易氧化變質(zhì),嚴(yán)重限制了產(chǎn)品的生產(chǎn)和銷售規(guī)模。
表1 熟制蟹肉蟹黃感官評分表Table 1 Sensory scoring scale for cooked crab meat and crab roe
氣調(diào)保鮮技術(shù)是一種通過調(diào)節(jié)氣體的組成來延長食品的儲存壽命和保質(zhì)期的技術(shù),廣泛用于生鮮、熟肉制品、水果和水產(chǎn)的保鮮[4]。影響保鮮效果的主要因素為塑料包裝的氣體阻隔性,包裝前食品的衛(wèi)生指標(biāo),貯藏氣體的配氣比例和貯藏溫度四個方面[5]。目前針對水產(chǎn)品的氣調(diào)保鮮的研究大多以魚蝦為研究對象。熟制蟹肉蟹黃營養(yǎng)成分與魚蝦類似,但脂肪與蛋白質(zhì)含量相對更高,故在理論上可以利用氣調(diào)保鮮的方法延長其貨架期,為其運輸和銷售提供便利。因此,本實驗通過比較檢測分析空氣和不同氣體成分包裝方式對熟制蟹肉蟹黃菌落總數(shù)、pH、代謝產(chǎn)物、感官品質(zhì)的影響、揮發(fā)性風(fēng)味物及呈味核苷酸等方面,分析風(fēng)味物質(zhì)變化規(guī)律并預(yù)測貨架期限,最后確定產(chǎn)品最佳氣調(diào)包裝方式。
小規(guī)格的成熟河蟹(體重約150~200 g) 市售;生理鹽水 安徽雙鶴藥業(yè);標(biāo)準(zhǔn)固體培養(yǎng)基、無水乙醇、硫酸(純度:98%) 上海百靈威科技;硝酸、甲基橙、亞甲基藍(lán)、氧化鎂、鹽酸、氫氧化鈉、硼酸 國藥集團(tuán)上海試驗化學(xué)試劑有限公司;丙二醛(Malondialdehyde,MDA)測定試劑盒 南京建成生物研究所。
SW-CJ-1F凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司;GHP-9270隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;FA-C電子天平 上海精科天平儀器廠;5804R冷凍高速離心機(jī) 德國eppendorf公司;SCIONSQ-456-GC氣相色譜質(zhì)譜儀 美國BRUKER公司;K1301自動凱氏定氮儀 上海晟聲自動化分析儀器有限公司;Titrette數(shù)字瓶口滴定器 德國BRAND公司;ST310手持勻漿器 德國IKA公司;PH610 pH計 WIGGENS公司;Epoch 微孔板分光光度計 美國Bio-tek儀器有限公司;HH-3A恒溫水浴鍋 常州國華儀器有限公司;KM100-3M氣體混合及配量系統(tǒng) 德國WITT公司;GI54T高壓蒸汽滅菌鍋 美國ZEALWAY公司。
1.2.1 河蟹的處理 小規(guī)格的成熟河蟹(體重約150~200 g),整只蒸煮30 min,人工挑出蟹肉蟹黃,加熱熬制至翻滾冒泡(約10 min),冷卻后制得熟制蟹肉蟹黃樣品。
將樣品用尼龍/聚乙烯塑料袋包裝,每袋100 g。先抽真空,后分別充入空氣、60% CO2+40% N2和40% CO2+60% N2密封,檢測包裝袋氣密性,放入恒溫培養(yǎng)箱于4 ℃下保藏以便進(jìn)行后續(xù)測定。
1.2.2 菌落總數(shù)及pH測定 菌落總數(shù)參照國家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測定;運用GB 4789.2-2016規(guī)定的平板菌落計數(shù)法,對不同氣體結(jié)構(gòu)保鮮下的同種產(chǎn)品進(jìn)行不同周期采樣測定。pH測定方法:取10 g熟制蟹肉蟹黃勻漿與50 mL去離子水混合均勻后用pH計進(jìn)行測定。
1.2.3 丙二醛(MDA)測定 丙二醛測定:參照南京建成生物工程研究所出品的丙二醛(MDA)測定試劑盒(TBA法)說明書進(jìn)行測定操作。
1.2.4 揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)測定 揮發(fā)性鹽基氮參照國家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測定;運用GB 5009.228-2016規(guī)定的自動凱氏定氮法對不同氣體結(jié)構(gòu)保鮮下的同種產(chǎn)品進(jìn)行不同周期采樣測定。
1.2.5 感官評價 運用Just-About-Right(JAR)評分法對10名志愿者進(jìn)行不同氣調(diào)保鮮方案下的產(chǎn)品的感官評定和質(zhì)量評定,確定消費者對不同氣調(diào)保鮮方案下產(chǎn)品的喜好程度。
根據(jù)熟制蟹肉蟹黃的本身的風(fēng)味及特點對其色澤、氣味和質(zhì)地分別設(shè)置了分級,并隨機(jī)了邀請10位志愿者對不同溫度和氣體環(huán)境下的熟制蟹肉蟹黃進(jìn)行感官評定,評分標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。
1.2.6 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測定 在頂空瓶中放入2.50 g熟制蟹肉蟹黃,插入老化后的75 μm Car/PDMS萃取頭,并在60 ℃下吸附30 min,SCION SQ-456-GC(BRUKER US)上進(jìn)樣,解吸至平衡后,GC-MC進(jìn)樣。
色譜條件:DB-WAX毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)色譜柱,氦氣為載氣,程序升溫,流速0.9 mL/min;進(jìn)樣口溫度為250 ℃;不分流式進(jìn)樣。
質(zhì)譜條件:EI離子源;發(fā)射電流80 μA;檢測電壓1000 V;電子能量70 eV;離子源溫度200 ℃;傳輸線溫度250 ℃。
1.2.7 呈味核苷酸測定 取5.00 g熟制蟹肉蟹黃放置于離心管中,加入30 mL 5%高氯酸溶液,勻漿兩次;將勻漿器用同濃度高氯酸洗滌兩次,將洗滌液合并到離心管中,4 ℃下在1000 r/min離心10 min,取出上清液;用相同濃度的高氯酸洗滌沉淀物,離心后合并上清液;用0.5 mol/L NaOH將合并的上清液調(diào)節(jié)pH至6.5,用超純水將體積調(diào)節(jié)至1000 μL;經(jīng)0.25 μm濾膜過濾后,取10 μL在Agilent-1260 HPLC儀上進(jìn)樣分析。
HPLC主要技術(shù)參數(shù):色譜柱:Diamonsil-C18(5 μm,4.6×250 mm),紫外檢測器(260 nm);流動相:A:0.05% H3PO4,B:95%甲醇;進(jìn)樣量:10 μL;流速:1.0 mL/min;柱溫為30 ℃。
使用Excel和SPSS v19.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,顯著性方差分析法采用單因素方差分析(One-way ANOVA)DUNCAN檢驗,檢測限為0.05。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。用Graphpad prism 8完成圖形繪制工作。
菌落總數(shù)是衡量產(chǎn)品貨架期長度的重要依據(jù)之一,產(chǎn)品貨架期不僅與產(chǎn)品的化學(xué)組分有關(guān)[6-7],也與不同的包裝方式和貯藏溫度相關(guān)。如圖1所示,在4 ℃貯藏條件,空氣對照組菌落總數(shù)隨貯藏時間延長增長最快,顯著高于其他處理組(P<0.05)。60% CO2+40% N2組和40% CO2+60% N2組的菌落總數(shù),在第4、10、20 d分別達(dá)到3.23、4.10、4.81 lg CFU/g和3.11、4.02、4.58 lg CFU/g。研究發(fā)現(xiàn),CO2可通過延長細(xì)菌生長階段中的延滯期和傳代時間來抑制細(xì)菌活性,降低細(xì)菌生長繁殖速度,且二氧化碳濃度在30%~40%具有較好的抑菌效果[8]。熟制蟹肉蟹黃屬于弱堿性食品,一般水產(chǎn)品中的優(yōu)勢菌群如假單胞菌、無色桿菌和食品致病菌等的最適生長pH一般為中性偏酸性[9]。充入較高濃度的二氧化碳不但會使包裝塌陷[10],而且還會降低pH,促進(jìn)腐敗菌生長,使菌落總數(shù)隨貯藏時間延長上升較快,這可能是40% CO2+60% N2組抑菌效果優(yōu)于60% CO2+40% N2組的原因之一。這與呂飛等[11]研究醉蝦的氣調(diào)包裝結(jié)果一致。根據(jù)最新的國家標(biāo)準(zhǔn)和農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn),參考蝦類鮮度評判標(biāo)準(zhǔn)(105CFU/g)[12-14]可粗略得出,在4 ℃下空氣保藏貨架期則為18 d左右,60% CO2+40% N2包裝約為25 d左右,40% CO2+60% N2包裝為28 d左右。何耀輝等[15]研究也發(fā)現(xiàn)40% CO2+60% N2混合氣體充氣包裝保鮮,在2~4 ℃條件下可保存草蝦26 d。
圖1 不同的包裝方式對熟制蟹肉蟹黃中菌落總數(shù)的影響Fig.1 Effects of different packing methods on the total colony of cooked crab meat and crab roe
pH即氫離子濃度指數(shù),是判斷熟制蟹肉蟹黃質(zhì)量的重要指標(biāo)。由圖2可知,在4 ℃條件下,隨著貯藏時間延長各組pH均呈現(xiàn)先減小后增加的趨勢,該結(jié)果與張建友[16]氣調(diào)包裝毛蝦的pH變化規(guī)律類似。樣品初始pH為8.09,偏堿性。在貯藏前期由于微生物含量較低,其生長活動不足以改變外環(huán)境pH,pH降低主要是因為樣品中殘余的內(nèi)源酶分解脂肪生成游離脂肪酸和外源充入CO2溶解[17]。從第10 d開始,熟制蟹肉蟹黃的pH開始逐漸上升,這主要是由熟制蟹肉蟹黃中的微生物的代謝引起的,與Ozogul等[18]報道的水產(chǎn)品pH在貯藏期間逐漸增大的趨勢類似。此外,在整個實驗期間,60% CO2+40% N2組pH始終低于其它兩個處理組,這可能與其較高濃度的CO2有關(guān)。不同比例的CO2和N2混合氣體包裝的蝦制品,CO2比例越高,pH越低[16],這與本研究的結(jié)果一致。
圖2 不同包裝方式對熟制蟹肉蟹黃pH的影響Fig.2 Effectsof differentpacking methods on pH value of cooked crab meat and crab roe
丙二醛(MDA)是自由基氧化多不飽和脂肪酸降解得到的氧化終產(chǎn)物[19]。大量MDA可引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合,且具有一定的細(xì)胞毒性。MDA含量可在一定程度上反映組織細(xì)胞脂質(zhì)過氧化的速率和程度[20-23]。不同氣體成分在4 ℃下貯藏對熟制蟹肉蟹黃中MDA含量的影響如圖3所示,貯藏1~12 d,各組MDA含量變化不大且無明顯差異,這可能是由于低溫抑制了微生物生長和內(nèi)源酶活性,使不飽和脂肪酸氧化降解速度變慢,從而抑制了MDA的生成,達(dá)到了良好的抑制脂質(zhì)氧化的效果[24-25]。第12~20 d,空氣組隨貯藏時間延長MDA含量增加最快,60% CO2+40% N2組MDA含量在各個時間點略高于40% CO2+60% N2組,可能是各組微生物含量的差異引起的脂質(zhì)氧化速度不同,同時CO2濃度增加可能對于酶解反應(yīng)有一定的促進(jìn)作用,使 MDA含量增加[26]。對草魚片的氣調(diào)包裝的研究也發(fā)現(xiàn)40% CO2氣調(diào)包裝組MDA值低于60%氣調(diào)包裝組[26]。
表2 熟制蟹肉蟹黃以TVB-N值為依據(jù)的貨架期預(yù)測Table 2 Shelf life prediction of cooked crab meat and crab roe based on TVB-N value
國家對食用動物油脂也有明確的MDA含量標(biāo)準(zhǔn),即不得大于2.5 mg/kg,這也為以脂質(zhì)氧化程度為標(biāo)準(zhǔn)預(yù)測熟制蟹肉蟹黃貨架期提供了明確的理論依據(jù)[27]。本研究結(jié)果顯示,在整個實驗周期中,熟制蟹肉蟹黃MDA含量均在國家標(biāo)準(zhǔn)允許的范圍內(nèi)。
圖3 不同包裝方式對熟制蟹肉蟹黃MDA含量的影響Fig.3 Effects of different packing methods on MDA content of cooked crab meat and crab roe
揮發(fā)性鹽基氮(Total volatile base nitrogen,TVB-N)是肉制品及水產(chǎn)品鮮度的主要衛(wèi)生評價指標(biāo)[28]。甲殼類水產(chǎn)品的肌肉含有大量的可溶性氮和游離氨基酸,因此其腐敗過程往往伴隨著大量揮發(fā)性鹽基氮的產(chǎn)生,可通過測定揮發(fā)性特征氣味物質(zhì)的多少,判斷產(chǎn)品腐敗程度或新鮮度[29]。根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn),熟制蟹肉蟹黃中揮發(fā)性鹽基氮含量在20 mg/100 g以下時符合二級鮮度,其中揮發(fā)性鹽基氮含量超過30 mg/100 g時熟制蟹肉蟹黃即為變質(zhì)[12]。
不同氣體包裝的熟制蟹肉蟹黃TVB-N值變化如圖4所示。在貯藏溫度4 ℃下,空氣組TVB-N值增長速率最快,60% CO2+40% N2組和 40% CO2+60% N2組增長速率明顯降低,但60% CO2+40% N2組值略高于40% CO2+60% N2組,可能是因為40% CO2+60% N2有效減緩了由微生物繁殖而造成的蛋白質(zhì)分解,這與雷志方等人[30]的結(jié)論一致。此外,氮氣作為完全惰性氣體,可很好地預(yù)防食品油脂的氧化酸敗、VC的氧化分解等不良反應(yīng),提高產(chǎn)品品質(zhì),降低 TVB-N 水平[31]。
圖4 不同包裝方式對熟制蟹肉蟹黃 揮發(fā)性鹽基氮含量的影響Fig.4 Effects of different packing methods on volatile base nitrogen content of cooked crab meat and crab roe
對不同氣體成分的熟制蟹肉蟹黃在不同溫度下貯藏得到的TVB-N值進(jìn)行線性擬合,計算其回歸方程并對其二級鮮度和變質(zhì)時間點做出預(yù)測。結(jié)果如表2所示。
表2中的回歸方程中,貯藏天數(shù)為自變量x,熟制蟹肉蟹黃的TVB-N值為因變量y?;貧w方程系數(shù)(regression coefficient)是指回歸方程中表示自變量x對因變量y影響大小的參數(shù)。回歸系數(shù)越大表示x對y的影響越大[32]。研究表明,4 ℃下,40% CO2+60% N2氣調(diào)包裝將熟制對蝦的貨架期由7 d延長至21 d[26]。在本研究中,不論是以二級鮮度還是以變質(zhì)時間確定貨架期,在4 ℃下,以40% CO2+60% N2為貯藏氣體貨架期均最長,結(jié)合菌落總數(shù)估算貨架期長短的結(jié)果,最后貨架期限約為28 d。
感官評定結(jié)果如表3所示,其中甲組為第0 d熟制蟹肉蟹黃,即未貯藏的新鮮樣品;乙組為參考TVB-N值得出的剛達(dá)到二級鮮度標(biāo)準(zhǔn)時的樣品;丙組則為實驗周期內(nèi)未變質(zhì)的最后一天的熟制蟹肉蟹黃。
表3 熟制蟹肉蟹黃感官評定結(jié)果Table 3 Sensory evaluation of cooked crab meat and crab roe
表4 不同天數(shù)4 ℃下貯藏熟制蟹肉蟹黃揮發(fā)性物質(zhì)組成及相對含量Table 4 Relative content and composition of volatile compounds in cooked crab meat and crab roe stored at 4 ℃ for different days
由表3所示,乙組和丙組熟制蟹肉蟹黃在40% CO2+60% N2組的氣體貯藏下都與同組的其他樣品有較顯著的差異(P<0.05),且得分較高,證明感官質(zhì)量良好。這可能是因為相對于同為氣調(diào)保鮮組的40% CO2+60% N2組,60% CO2+40% N2組的CO2濃度過高,被熟制蟹肉蟹黃吸收導(dǎo)致肉質(zhì)發(fā)酸引起感官不適從而導(dǎo)致得分較低[33]。而空氣對照組得分最低的結(jié)果也證明了適當(dāng)CO2濃度的氣調(diào)保鮮對熟制蟹肉蟹黃感官性質(zhì)的保持起積極作用。由此也可以判斷三組不同氣體對感官性質(zhì)保持起較好作用的是40%CO2+60%N2的混合氣體組。
揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)是影響整體風(fēng)味的重要因素,也是評價水產(chǎn)品質(zhì)量的一個重要指標(biāo),也決定了消費者的接受度[34]。為探究最適熟制蟹肉蟹黃在貯藏條件下風(fēng)味的變化情況,采集4 ℃,40% CO2+60% N2組熟制蟹肉蟹黃在包裝前(0 d)、接近二級鮮度(第14 d)和接近變質(zhì)(第20 d)時間點的樣品,運用氣相色譜法對其揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了檢測。由表4可知,包裝前樣本供檢測到醇類11種、酮類6種、醛類14種、烴類25種、芳香類6種、酯類5種以及其他7種,其中酯類、烴類和醛類含量分別占到了41.70%、34.60%和20.10%,為主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。隨著貯藏時間的延長(第14~20 d),烴類和醛類顯著降低(P<0.05),分別到占18.10%和1.59%,而醇類、酮類有顯著提高(P<0.05),酯類則無顯著性變化。
圖5 揮發(fā)性化合物種類數(shù)Fig.5 Number of volatile compounds
一般研究認(rèn)為熟肉特征性風(fēng)味的主要來源是脂肪的氧化,氧化讓脂肪酸降解產(chǎn)生氫過氧化物,進(jìn)一步降解產(chǎn)生醇、酮、醛、碳?xì)漕愇镔|(zhì)[35]。由圖5可知,熟制蟹肉蟹黃在氣調(diào)貯藏下其主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類依然隨著時間的延長而逐漸減少。未貯藏時檢測得揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類為74種,貯藏第14和20 d時其揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類分別為66種和57種,表明揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類和含量與貯藏時間長短呈負(fù)相關(guān)。未貯藏熟制蟹肉蟹黃中的烴類物質(zhì)含量顯著高于貯藏14 d和20 d的樣品(P<0.05),但研究表明碳?xì)漕惢衔锊⒉挥绊憳悠返娘L(fēng)味特征。不飽和脂肪酸氧化降解的主要產(chǎn)物多為醛類物質(zhì),其具有奶油、脂肪、草香以及清香等氣味[36],醛類化合物隨貯藏時間的延長逐漸減少符合熟制蟹肉蟹黃隨時間延長風(fēng)味受損的趨勢。除醛類化合物外,酯類也是熟制蟹肉蟹黃風(fēng)味的重要組成成分,酯類大多具有花香、果香或蜜香香氣,然而三組間酯類化合物含量沒有顯著性差異(P>0.05)。因此,40% CO2+60% N2氣調(diào)包裝熟制蟹肉蟹黃,揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類隨時間延長逐漸減少,主要表現(xiàn)為醛類化合物和芳香類化合物含量減少,醇類化合物和酮類化合物增加,酯類化合物基本保持不變,這可能是維持蟹肉蟹黃風(fēng)味品質(zhì)的重要原因。
Yamaguchi等的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),呈鮮味核苷酸共有30多種,其中以5′-鳥苷酸和5′-肌苷酸為代表[37]。由表5可知,4 ℃貯藏條件下40% CO2+60% N2組第14 d腺嘌呤核苷酸(AMP)含量(49.46%)顯著低于第0 d樣品的61.89%(P<0.05),而IMP、HxR和HX的含量則顯著高于第0 d樣品(P<0.05),這可能與AMP的分解途徑相關(guān)。AMP代謝逐次生成IMP、HxR和HX。相關(guān)研究表明AMP和IMP是中華絨螯蟹中主要的核苷酸類物質(zhì)[38],然而熟制蟹肉蟹黃中的IMP含量明顯偏低,這可能是與熟制蟹肉蟹黃加工過程中經(jīng)過了一次熬煮有關(guān),IMP的熱穩(wěn)定性較差,在受熱過程容易降解,加熱后HxR和HX的增加也都和IMP的降解有關(guān)。
表5 核苷酸類化合物含量比較Table 5 Comparisonof nucleotide compounds content between optimum group and unsortedsamples at secondary freshness in controlled atmosphere storage
從呈味的角度來看,第14 d的樣品AMP含量顯著降低(P<0.05),會影響熟制蟹肉蟹黃的鮮味,但I(xiàn)MP的含量顯著增加(P<0.05),且IMP與谷氨酸有相乘的呈味效果[39],能一定程度上緩解第14 d樣品的鮮味損失。此外,第14 d樣品Hx和HxR含量顯著增加會導(dǎo)致樣品有一定苦味[40]。因此,經(jīng)過4 ℃下氣調(diào)包裝熟制蟹肉蟹黃,其風(fēng)味取決于谷氨酸含量,谷氨酸含量越高,鮮味流失越少,且經(jīng)過一定貯藏時間后樣品可能會產(chǎn)生一定苦味。
本實驗初步證實了在4 ℃時,三種不同氣調(diào)包裝方式(空氣,60% CO2+40% N2和40%CO2+60% N2)中,40% CO2+60% N2的包裝方式為產(chǎn)品最優(yōu)氣調(diào)包裝方式。該氣調(diào)包裝可顯著降低熟制蟹肉蟹黃貯藏期間菌落總數(shù)、揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)和丙二醛(MDA)含量,可使熟制蟹肉蟹黃在4 ℃延長貨架期至28 d左右。同時,揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類和含量隨時間延長而減少,但酯類含量基本不變;呈味核苷酸AMP顯著降低,而IMP、HX和HxR含量顯著提高,這使得熟制蟹肉蟹黃保持了一定的鮮味并伴隨輕微苦味。