氣相色譜-質譜聯(lián)用法測定植物油料中角鯊烯的含量及方法比較

呂春玲,陳小媚,王秀嬪,李培武,張 奇,張 文

(中國農(nóng)業(yè)科學院油料作物研究所,湖北武漢 430062)

角鯊烯又名魚鯊烯、鯊烯、三十碳六烯等,化學式為C30H50,是一種高度不飽和脂肪族烴類化合物,角鯊烯最初是從鯊魚的肝油中發(fā)現(xiàn)的,是一種功能性活性脂質不皂化物[1-3]。其生理功能主要包括抗氧化、抗輻射、調節(jié)膽固醇代謝、提高體內超氧化物歧化酶活性[4-5]、防癌抗癌、增強機體免疫能力、皮膚保濕、抗衰老[6-7]和抑制微生物生長等。因此,角鯊烯被廣泛應用于醫(yī)藥產(chǎn)品、化妝品和功能性食品等相關產(chǎn)品的開發(fā)[8]。

食用植物油是人體生長和代謝過程不可缺少的三大基本營養(yǎng)素之一,同時含有豐富的特質營養(yǎng)成分,如甾醇、角鯊烯、生育酚、白藜蘆醇等[9-12]。隨著農(nóng)業(yè)供給側結構性改革與質量興農(nóng)戰(zhàn)略的實施,我國油料生產(chǎn)已從高產(chǎn)量向高質量多用途戰(zhàn)略轉變,植物油料特異品質檢測技術是發(fā)掘和利用特異營養(yǎng)品質實現(xiàn)高質量發(fā)展的關鍵,然而植物油料中微量特質營養(yǎng)成分檢測靈敏度低、技術匱乏嚴重制約油料品質提升與產(chǎn)業(yè)增效[13-15]。目前發(fā)現(xiàn)角鯊烯的替代來源主要以植物為主,油料作物如橄欖、油茶、大豆、花生、芝麻、油菜等種子中含有一定濃度的角鯊烯[16-18]。

目前,角鯊烯的測定方法主要有氣相色譜法、氣相色譜質譜法、高效液相色譜法、超高效合相色譜以及超高效液相色譜法[19-21],樣品的前處理方法可分為傳統(tǒng)提取方法和新型提取方法,傳統(tǒng)提取方法有皂化法、結晶法以及有機溶劑提取法,新型提取方法包括固相微萃取法、超臨界二氧化碳萃取法以及固相萃取法[22-23]。但植物油料中角鯊烯的檢測,并未有相關文獻記錄,因此開發(fā)一種植物油料中角鯊烯的檢測方法顯得尤為重要。由于角鯊烯是一種植脂不皂化物,因此本文采取一種皂化方法先給植物油料的種子樣品脫脂,然后用正己烷萃取角鯊烯,用氣相質譜聯(lián)用法從復雜基質中分離出角鯊烯,因為相對其他儀器檢測方法氣質聯(lián)用法重現(xiàn)性好、靈敏度高、峰型尖銳干擾少、定量準確[24-26]。本實驗結果可應用于植物油料中角鯊烯的日常分析。氣質聯(lián)用法可以降低檢測限,提高油料中微量角鯊烯的檢測準確性,為植物油料的高質量發(fā)展提供技術支撐,為選育高角鯊烯含量的草本油料品種提供方法依據(jù)[27]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物油料 購自本地市場(湖北武漢)；樣品包括花生、大豆、芝麻和油菜籽,用高速研磨機磨成粉末,過60目篩，為防止所取樣品變質而影響數(shù)據(jù)的準確性,樣品均避光冷藏保存。角鯊烯(純度>98%) 色譜純,德國Dr. Ehrenstorfer公司;正己烷、乙醇 色譜純,國藥集團化學試劑有限公司;氫氧化鉀、氯化鈉 分析純,西隴化工股份有限公司。

氣相色譜質譜聯(lián)用儀、色譜柱HP-5 MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm) 美國Agilent Technologies公司;Centrifuge-V 型離心機 美國Thermo Scientific公司;Milli-QA10型純水儀 美國Millipore公司;Tiss-46型均質儀 上海凈信科技;Auw220型分析天平 日本Shimadzu公司;DTC-27J 超聲波水浴鍋 中國湖北鼎泰生化技術設備制造有限公司;BF-2000型氮氣吹干儀 北京八方世紀科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制 角鯊烯標準儲備液(1 mg/mL):準確稱取0.0100 g角鯊烯標準品于10 mL容量瓶中,用正己烷定容至刻度,混勻冷藏備用;角鯊烯標準中間液(100 mg/L):準確吸取1.00 mL角鯊烯標準儲備液于10 mL容量瓶中,用正己烷定容至刻度,混勻冷藏備用;角鯊烯標準工作溶液:分別吸取適量角鯊烯標準中間液,用正己烷稀釋,使標準工作溶液濃度分別為0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 mg/L。

1.2.2 樣品處理 稱取已磨碎過篩試樣0.20 g放入15 mL離心管中,加入2 mL 2 mol/L的氫氧化鉀-乙醇溶液,超聲皂化40 min(在75 ℃條件下)后;取出離心管,冷卻至室溫;加入2 mL水,1 mL正己烷提取,離心管至旋渦均質器中混勻3 min,充分提取;4500 r/min離心3 min,若出現(xiàn)乳化現(xiàn)象,加入1 mL飽和氯化鈉溶液破乳,4500 r/min再次離心3 min,轉移上清液至尖底玻璃試管中。再用1 mL正己烷重復此提取操作二次,并將三次提取上清液合并至尖底玻璃試管中,置于旋渦混合器中混勻,然后用氮吹儀吹干溶劑,再立即加入1 mL正己烷復溶,4500 r/min離心3 min,經(jīng)0.22 μm有機相膜過濾后進樣。如果樣液中角鯊烯濃度超過標準工作曲線線性范圍,需將樣液用正己烷稀釋一定的倍數(shù),使其濃度在線性范圍之內。

1.2.3 色譜條件

1.2.3.1 氣相色譜參考條件 氣相色譜柱:HP-5(30 m×0.32 mm×0.25μm)色譜柱;載氣:高純氮氣(純度99.999%),恒壓:16 psi,分流比1∶12;進樣口溫度:320 ℃;柱溫采用程序升溫方式,100 ℃保持1 min,以40 ℃/min的速率從100 ℃升溫到290 ℃,保持20 min,然后以20 ℃/min的速率升溫到320 ℃,保持10 min;最后以40 ℃/min的速率降溫到100 ℃,保持1 min。FID檢測器:溫度320 ℃,氣流速200 mL/min,尾吹氣流速24 mL/min;進樣量:1.0 μL。

1.2.3.2 氣相色譜質譜聯(lián)用法參考條件 色譜柱:HP-5MS(30 m×0.25 mm×0.25μm);升溫程序:200 ℃保持1 min,然后以25 ℃/min升溫至300 ℃,保持5 min,載氣為高純度氦氣,流速1.0 mL/min,進樣方式:分流,分流比50∶1,進樣體積是1 μL。質譜條件:GC-MS接口溫度300 ℃,進樣口溫度300 ℃,四級桿溫度150 ℃,離子源溫度230 ℃,電離方式EI源,電離電壓70 eV,選擇性離子監(jiān)測(SIM)模式:m/z 69、81、95、137,定量離子為m/z 69,離子相對豐度m/z 69>81>95>137。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Origin軟件處理分析數(shù)據(jù)。

2 結果與分析

2.1 樣品前處理條件的選擇

2.1.1 超聲皂化的溫度對角鯊烯含量的影響 稱取已磨碎過篩試樣0.20 g放入15 mL離心管中,加入2 mL 2 mol/L的氫氧化鉀-乙醇溶液,分別在60、70、80、90、100 ℃條件下超聲皂化30 min后,取出離心管,冷卻至室溫;加入2 mL水,1 mL正己烷提取三次,將離心管放到旋渦均質器中混勻3 min,充分提取,最后經(jīng)氣相色譜質譜聯(lián)用法測定角鯊烯的含量,得出不同皂化溫度對油菜籽中角鯊烯含量測定的影響,結果見圖1。由圖1測定的角鯊烯含量隨著皂化溫度的變化可知,油菜籽中角鯊烯含量隨著皂化溫度的升高而升高,在80 ℃時達到最大濃度后有下降趨勢。當反應溫度過高時,會破壞皂化液中的抗氧化成分,從而使得角鯊烯失去保護,導致其含量降低。因此,綜合經(jīng)濟等因素選擇80 ℃為最佳皂化溫度。

圖1 皂化溫度對角鯊烯含量的影響Fig.1 Effect of saponification temperature on the content of squalene

2.1.2 超聲皂化的時間對角鯊烯含量的影響 稱取已磨碎過篩試樣0.20 g放入15 mL離心管中,加入2 mL 2 mol/L的氫氧化鉀-乙醇溶液,分別在80 ℃條件下超聲皂化20、30、40、50、60 min后,取出離心管,冷卻至室溫;加入2 mL水,1 mL正己烷提取三次,將離心管放到旋渦均質器中混勻3 min,充分提取,最后經(jīng)氣相色譜質譜聯(lián)用法測定角鯊烯含量,得出不同皂化時間對油菜籽中角鯊烯含量測定的影響,結果見圖2。

圖2 皂化時間對角鯊烯含量的影響Fig.2 Effect of saponification time on the content of squalene

由圖2測定的結果可以看出,隨著皂化時間的逐漸延長,角鯊烯的含量先增加后減少,皂化時間為40 min時,角鯊烯的濃度達到最大值,在高溫的堿性濃度下,隨著時間的延長,角鯊烯的結構遭到破壞,從而其含量有所降低。因此,綜合經(jīng)濟等因素選擇40 min為最佳皂化時間。

2.1.3 超聲皂化的堿液濃度對角鯊烯含量的影響 稱取已磨碎過篩試樣0.20 g放入15 mL離心管中,分別加入2 mL 1.6、1.8、2.0、2.2、2.4 mol/L的氫氧化鉀-乙醇溶液,分別在80 ℃條件下超聲皂化30 min后,取出離心管,冷卻至室溫;加入2 mL水,1 mL正己烷提取三次,將離心管放到旋渦均質器中混勻3 min,充分提取,最后經(jīng)氣相色譜質譜聯(lián)用法測定角鯊烯含量,得出不同皂化堿液濃度對油菜籽中角鯊烯含量測定的影響,結果見圖3。由圖3測得的結果可以看出,在堿液濃度低于2.0 mol/L時,由于反應速率較低,體系中角鯊烯的含量比較低,當堿液的濃度達到2.0 mol/L時,反應速率明顯增大很多,反應完全,角鯊烯含量上升明顯,但當堿液濃度繼續(xù)增大時,角鯊烯含量減少。因此,最佳堿液濃度為2.0 mol/L。

圖3 皂化堿液濃度對角鯊烯含量的影響Fig.3 Effect of KOH-C2H5OH solution concentration on the content of squalene

2.1.4 超聲皂化的萃取次數(shù)對角鯊烯含量的影響 稱取已磨碎過篩試樣0.20 g放入15 mL離心管中,分別加入2 mL 2.0 mol/L的氫氧化鉀-乙醇溶液,分別在80 ℃條件下超聲皂化30 min后,取出離心管,冷卻至室溫;加入2 mL水,分別用1 mL正己烷萃取1、2、3、4、5次,將離心管放到旋渦均質器中混勻3 min,充分提取,最后經(jīng)氣相色譜質譜法測定角鯊烯含量,得出不同皂化萃取次數(shù)對油菜籽中角鯊烯含量測定的影響,結果見圖4。由圖4測得結果可知,隨著皂化萃取次數(shù)的增加,油菜籽中角鯊烯含量先增加后減少,因為當正己烷萃取次數(shù)少時提取不完全,角鯊烯含量比較少;但當正己烷萃取次數(shù)較多時,角鯊烯的濃度反而減少,可能是由于有機試劑萃取過程中的損失,致使角鯊烯含量下降。因此,最佳皂化萃取次數(shù)為3次。

圖4 皂化萃取次數(shù)對角鯊烯含量的影響Fig.4 Effect of saponification extraction times on squalene content

2.2 氣相色譜質譜聯(lián)用法方法學驗證結果

2.2.1 角鯊烯的定性與定量離子選擇 用標準文庫NIST匹配了角鯊烯標準樣品的質譜,通過全掃描模式的質譜分析,匹配度為99%,確定了角鯊烯標準物質的主要碎片離子為m/z 69、81、95、137。然后設置選擇的離子監(jiān)測模式。選擇離子監(jiān)測模式對目標進行定量時,通常選擇靈敏度高、抗干擾能力強的碎片離子作為目標離子定量。因此角鯊烯的定量離子是m/z 69,定性離子是m/z 81、95、137。角鯊烯在SIM模式下的總離子流圖和質譜圖見圖5和圖6。

表1 角鯊烯的線性范圍以及檢出限Table 1 Linear ranges and limits of detection for squalene

表2 角鯊烯的準確度實驗結果Table 2 Accuracy test results of squalene

圖5 SIM模式下角鯊烯標準品的總離子流圖Fig.5 Total ion current diagram of squalene in SIM mode

圖6 SIM模式下角鯊烯標準品的質譜圖Fig.6 Mass spectrum of squalene in SIM mode

2.2.2 線性范圍和最低檢出限 取1.2.1中的標準儲備液,分別稀釋成6個濃度梯度,按2.1.1節(jié)優(yōu)化后前處理皂化條件進行測定,并繪制角鯊烯標準品的質量濃度(橫坐標x,mg/L)與峰面積(縱坐標y,AU)標準曲線,進行線性回歸分析,得到線性回歸方程y=14106x-5987,線性相關系數(shù)0.9998。且當信噪比(S/N)為3和10時,該方法的最低檢出限及定量限如表1所示。結果表明,無論是使用GC還是GC-MS/MS法測定角鯊烯的含量,都具有良好的線性相關性,均能滿足對植物油料中的角鯊烯進行檢測的要求。

2.2.3 樣品準確度和精密度實驗結果 在油菜籽、大豆、和芝麻樣品中,分別添加 2.50、5.00 mg/kg的角鯊烯標準品,在花生樣品中添加25.00、50.00 mg/kg的角鯊烯標準品,前處理方法按2.1.1節(jié)優(yōu)化后的前處理皂化條件進行測定,測定后計算回收率,結果見表2。由表2中的結果可見,四種不同植物油料的加標回收率在83.60%～110.44%之間,平均回收率為98.89%,說明該方法的準確度滿足方法學要求,適合植物油料中角鯊烯含量的測定。

對油菜籽、大豆、芝麻和花生樣品分別重復測定7次,結果見表3。由表3可知,油菜籽、大豆、芝麻和花生中角鯊烯測定結果的相對標準偏差(RSD)分別為 3.34%、3.35%、2.38%、1.00%,說明該方法具有良好的精密度,重現(xiàn)性好。

2.2.4 氣相色譜法和氣相色譜質譜法檢測結果的比較 為了更好的證明方法的準確性,隨機抽取4個植物油料種子,分別用不同的檢測方法進行對比試驗,按2.1.1節(jié)優(yōu)化的前處理皂化條件進行操作后,按照1.2.3的色譜條件進行測定,結果見表4。

表3 角鯊烯的精密度實驗結果Table 3 Precision experiment results of squalene

表4 不同檢測方法的比對結果Table 4 Comparison results of different detection methods

由表4可知,GC-MS/MS的檢測結果和GC的檢測結果相對誤差小于10%,兩種方法的檢測結果基本一致,均能滿足檢測的要求,檢測結果可靠。從已有的相關文獻報道得知氣相色譜法和氣相色譜質譜聯(lián)用法同樣適用于植物油脂和小宗油料樣品中角鯊烯的檢測。相對于氣相色譜法,氣相色譜質譜聯(lián)用法不但檢測靈敏度更高,還節(jié)約時間成本大大提高檢測效率,適合植物油料中角鯊烯含量的測定。

3 結論

綜上,本文建立了氣相色譜質譜聯(lián)用法測定植物油料中角鯊烯含量的方法。優(yōu)化了氫氧化鉀乙醇溶液超聲皂化的條件:皂化最佳溫度80 ℃,皂化最佳反應時間40 min,皂化最佳堿液濃度2.0 mol/L,最佳萃取次數(shù)3次。該方法角鯊烯的最低檢測限為 0.10 mg/L,相對標準偏差在1.00%～3.35%(n=7),加標回收率在83.60%～110.44%之間,說明該方法重現(xiàn)性好,靈敏度高,定量準確。并用氣相色譜質譜聯(lián)用法和氣相色譜法測定了四種不同植物油料中角鯊烯的含量,結果表明,兩種方法均能滿足檢測要求,氣相色譜質譜聯(lián)用法檢出限低,分離效率高,定量準確,更適合植物油料中微量角鯊烯含量的測定,并對植物油料的高質量發(fā)展具有一定的指導意義。