復(fù)合酶分步水解法制備漢麻多肽及其抗氧化特性研究

朱秀清,李美瑩,孫冰玉,王子玥,楊宏哲,孟 妍,張 娜,王 冰

(哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院,黑龍江省普通高校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 黑龍江省谷物食品與綜合加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱 150076)

漢麻(CannabissativaL)又名大麻、火麻等,是大麻科大麻屬的一年生草本植物,國(guó)際上將四氫大麻酚(THC)含量低于0.3%的大麻稱為工業(yè)大麻,我國(guó)則稱之為漢麻[1-3],漢麻籽籽仁可食用,是近幾年食品、藥品和保健品領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[4]。漢麻籽仁中蛋白質(zhì)含量為20%～25%,脂類含量為25%～35%,碳水化合物含量為20%～30%,脂溶性維生素含量為10%～15%,并含有豐富的礦物質(zhì),是人體優(yōu)質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)來源[5-7]。漢麻分離蛋白(Hempseed protein isolate,HPI)不含如大豆中的胰蛋白酶抑制劑、低聚糖等抗?fàn)I養(yǎng)因子,不會(huì)影響漢麻籽蛋白的消化吸收,且氨基酸組成均衡[8-9],是一種良好的植物蛋白資源,其開發(fā)利用具有廣闊的應(yīng)用前景。

表1 不同蛋白酶的酶解條件Table 1 Ezymatic conditions of different proteases

近年來,生物活性肽的研究成為食品領(lǐng)域的焦點(diǎn),與蛋白質(zhì)相比,生物活性肽更易被人體消化吸收[10-11],并具有調(diào)節(jié)人體生理功能的功效[12],例如,提高抗氧化性、降血壓、降血脂、抑菌等作用[13-15]。制備生物活性肽的方法有蛋白質(zhì)酶解法、化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法等,其中酶解法具有安全性好、操作簡(jiǎn)單、條件易控制等優(yōu)點(diǎn)而成為最常用的制備生物活性肽的方法。漢麻多肽是漢麻分離蛋白經(jīng)水解制得的小分子肽,對(duì)保健食品系列的開發(fā)和人類健康的促進(jìn)具有積極的推動(dòng)作用。目前,國(guó)內(nèi)對(duì)漢麻多肽的研究主要集中在單酶水解方面。梁凱[16]用堿性蛋白酶對(duì)漢麻籽分離蛋白進(jìn)行酶解,在最佳工藝條件下的得到的水解度為21.87%。Tang等[17]用六種不同的蛋白酶分別對(duì)漢麻蛋白進(jìn)行酶解,獲得的水解產(chǎn)物具有不同的肽得率和表面疏水性,表現(xiàn)出不同的抗氧化活性,并呈正相關(guān)的關(guān)系。但用復(fù)合酶分步水解的方式制備漢麻多肽的研究報(bào)道較少。

本研究以HPI為原料,通過對(duì)不同蛋白酶的篩選,選擇采用堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶復(fù)合酶分步水解的方式對(duì)漢麻分離蛋白進(jìn)行酶解,通過響應(yīng)面優(yōu)化制備漢麻多肽的最佳工藝條件,同時(shí)對(duì)漢麻多肽抗氧化能力進(jìn)行評(píng)價(jià),以期為高F值漢麻肽的制備提供理論基礎(chǔ),為漢麻蛋白肽的功能性開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

漢麻分離蛋白(蛋白質(zhì)含量92.48%,脂肪含量0.38%) 實(shí)驗(yàn)室自制;堿性蛋白酶(138526 U/g)、中性蛋白酶(87162 U/g)、木瓜蛋白酶(16460 U/g)、風(fēng)味蛋白酶(23541 U/g)、胰蛋白酶(78135 U/g) 諾維信生物技術(shù)有限公司;正己烷、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、硫酸銅等 均為國(guó)產(chǎn)分析純;DPPH試劑 德國(guó)Ruibio公司。

PHS-25型pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;HH-S4型恒溫溫水浴鍋 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;FA224電子天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;TG16-WS離心機(jī) 湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司;PCE-E3000恒溫振蕩器 蘇州凱特爾儀器有限公司;Alpha-1506型分光光度計(jì) 上海市譜光儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 漢麻多肽的制備 在室溫下將5 g冷凍干燥的HPI分散在100 mL的去離子水中,攪拌均勻后在90 ℃水浴鍋中預(yù)處理10 min,降溫至酶解反應(yīng)溫度時(shí)保溫5 min左右,用1.0 mol/L NaOH或1 mol/L HCl調(diào)pH至酶的最適pH后加入蛋白酶,在酶解過程中保持混合物的pH恒定,反應(yīng)結(jié)束后,在沸水浴中滅酶10 min來終止反應(yīng),酶解液冷卻后,在8000 r/min下離心10 min,除去不溶性殘余物,將上清液的pH調(diào)節(jié)至7.0后冷凍干燥,備用。

1.2.1.1 蛋白酶的篩選 取質(zhì)量濃度為5%的HPI溶液,分別加入堿性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶及風(fēng)味蛋白酶,加酶量為 10000 U/g,并在其各自的最適溫度、pH等(表1)條件下,對(duì)HPI進(jìn)行水解,并測(cè)定各酶解液的水解度及漢麻蛋白肽含量。

1.2.1.2 酶解方式的確定 選取兩種酶解效果較好的酶制劑進(jìn)行1∶1分步酶解,以水解度與漢麻蛋白肽含量為指標(biāo),研究加酶方式對(duì)酶解效果的影響。按表2的酶解條件分別考察三種加酶方式對(duì)酶解效果的影響。

表2 酶解方式對(duì)酶解效果的影響Table 2 Effect of enzymolysis mode on enzymolysis effect

1.2.1.3 堿性蛋白酶酶解的單因素實(shí)驗(yàn) 在HPI為5%條件下,固定反應(yīng)溫度55 ℃、反應(yīng)時(shí)間2 h、加酶量10000 U/g,考察不同pH(7.5、8.0、8.5、9.0、9.5)對(duì)HPI水解度和肽含量的影響;固定反應(yīng)時(shí)間2 h,反應(yīng)pH8.5,加酶量10000 U/g,考察不同溫度(45、50、55、60、65 ℃)對(duì)HPI酶解效果的影響;固定固定反應(yīng)溫度55 ℃、反應(yīng)時(shí)間2 h、反應(yīng)pH8.5,考察不同加酶量(6000、8000、10000、12000、14000 U/g)對(duì)HPI酶解效果的影響;固定反應(yīng)溫度55 ℃、反應(yīng)pH8.5、加酶量10000 U/g,考察不同時(shí)間(1、1.5、2、2.5、3 h)對(duì)HPI酶解效果的影響。

1.2.1.4 堿性蛋白酶酶解的響應(yīng)面設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,選擇底物濃度為5%,時(shí)間2 h,以pH、溫度、加酶量三個(gè)因素為自變量,采用軟件Design-Expert V8.0.6設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn),因素與水平設(shè)計(jì)如表3所示。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 3 Factors and their levels used in response surface experiment

1.2.1.5 木瓜蛋白酶酶解的單因素實(shí)驗(yàn) 在堿性蛋白酶酶解滅酶后,加入木瓜蛋白酶進(jìn)行酶解。固定反應(yīng)溫度50 ℃、反應(yīng)時(shí)間2 h、加酶量5000 U/g,考察不同pH(5.5、6.0、6.5、7.0、7.5)對(duì)HPI水解度和肽含量的影響;固定反應(yīng)時(shí)間2 h,反應(yīng)pH6.5,加酶量5000 U/g,考察不同溫度(45、50、55、60、65 ℃)對(duì)HPI酶解效果的影響;固定反應(yīng)溫度50 ℃、反應(yīng)時(shí)間2 h、反應(yīng)pH6.5,考察不同加酶量(2000、3000、4000、5000、6000 U/g)對(duì)HPI酶解效果的影響;固定反應(yīng)溫度50 ℃、反應(yīng)pH6.5、加酶量5000 U/g,考察不同時(shí)間(1、1.5、2、2.5、3 h)對(duì)HPI酶解效果的影響。

1.2.1.6 木瓜蛋白酶酶解的響應(yīng)面設(shè)計(jì) 根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,選擇時(shí)間2 h,以pH、溫度、加酶量三個(gè)因素為自變量,采用軟件Design-Expert V8.0.6設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn),因素與水平設(shè)計(jì)如表4所示。

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 4 Factors and their levels used in response surface experiment

1.2.2 水解度的測(cè)定 水解度是指蛋白質(zhì)水解斷裂的肽鍵占蛋白質(zhì)中總肽鍵的比例,能夠表示蛋白質(zhì)的水解程度。本試驗(yàn)采用甲醛滴定法[18]。吸取10 mL酶解液,加入蒸餾水60 mL后攪拌均勻,用0.05 mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至pH8.2時(shí)停止攪拌,記錄體積;加入中性甲醛10 mL,再用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至pH9.2,記下加入甲醛后消耗的氫氧化鈉體積V。同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn),記錄消耗的氫氧化鈉體積V0。并用以下公式計(jì)算水解度。

式中:DH為水解度,%;C為NaOH溶液濃度,mol/L;V為滴定消耗NaOH溶液體積,mL;V0為空白滴定消耗NaOH溶液體積,mL;0.014為氮毫克當(dāng)量;M為樣品中總氮含量,g。

1.2.3 肽含量的測(cè)定 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:精確稱取酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品12 g,用蒸餾水配制成濃度為12 mg/mL母液備用。采用梯度稀釋法將其依次配成10、8、6、4、2 mg/mL溶液。各取1 mL與3 mL雙縮脲試劑混合均勻,放置30 min,在λ=540 nm波長(zhǎng)下測(cè)其OD值。以酪蛋白濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo),OD值為縱坐標(biāo),制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

量取一定體積酶解液,加入一定體積三氯乙酸,混勻,離心,取上清液,再用漏斗過濾,靜置30 min;再將濾液與雙縮脲試劑混合,在540 nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值。按標(biāo)準(zhǔn)曲線算出其含量,再乘以樣品稀釋比例,即為肽含量[19]。

1.2.4 抗氧化能力測(cè)定

1.2.4.1 DPPH自由基清除率的測(cè)定 參考Chen等[20]的方法,略作修改。取冷凍干燥樣品,配制成不同濃度,取2 mL樣品加入0.2 mmol/L的DPPH乙醇混合溶液2 mL,混合搖勻后在避光處?kù)o置30 min,然后在517 nm處測(cè)得吸光值A(chǔ)i。以無水乙醇溶液代替DPPH溶液作為空白組Aj,以等體積蒸餾水代替樣品溶液作為對(duì)照組A0。以VC為陽性對(duì)照。

式中:Ai-樣品組吸光度;Aj-空白組吸光度;A0-對(duì)照組吸光度。

1.2.4.2 鐵還原力的測(cè)定 參考Remanan等[21]研究方法并略作修改。取2.0 mL不同濃度的樣品溶液,與2 mLPBS溶液(0.2 mol/L)和2 mL鐵氰化鉀溶液(1%,w/v)混合,在50 ℃中保溫20 min,取出冷卻后加入2 mL三氯乙酸(10%)充分混勻,然后5000 r/min離心10 min,取2 mL上清液加入2 mL蒸餾水和0.4 mL三氯化鐵溶液(0.1%,w/v)在50 ℃充分反應(yīng)10 min,在700 nm處測(cè)定吸光度。以VC為陽性對(duì)照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,采用Excel 2010和SPSS 17.0軟件分析數(shù)據(jù)及作圖,Box-Behnken設(shè)計(jì)采用Design Expert 8.0.6軟件并進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶的篩選

選用堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和胰蛋白酶5種蛋白酶,在各酶的適宜條件下進(jìn)行酶解。由圖1可知,采用堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶這三種酶水解漢麻分離蛋白的水解度變化不顯著(P>0.05),而木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶水解漢麻分離蛋白得到的肽含量高于風(fēng)味蛋白酶。由于堿性蛋白酶的酶切作用位點(diǎn)較多,屬于內(nèi)切酶,可以先將肽鏈末端的疏水性氨基酸暴露出來,而木瓜蛋白酶是一種外切酶,可以將肽鏈末端的芳香族氨基酸釋放出來[22],所以為了后續(xù)更好地制備和分離高F值寡肽,本研究選擇堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶進(jìn)行分步復(fù)合酶解。

圖1 不同蛋白酶對(duì)HPI酶解效果的影響Fig.1 Effect of different proteases on HPI enzymolysis注:字母相同表示無顯著性差異,P>0.05;字母不同表示 差異顯著,P<0.05；圖2～圖5、圖7～圖10，圖13～圖14同。

2.2 酶解方式對(duì)酶解效果的影響

經(jīng)過篩選可得,采用堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶進(jìn)行復(fù)合酶解。分別采用將堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶同時(shí)加入,先加入堿性蛋白酶后加入木瓜蛋白酶和先加入木瓜蛋白酶后加入堿性蛋白酶三種方式進(jìn)行酶解,研究不同酶解方式對(duì)酶解效果的影響。

由表5可知,當(dāng)采用堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶先后使用時(shí),HPI水解液的水解度和肽含量最大,分別達(dá)到20.36%和6.82 mg/mL,因此采用先堿性蛋白酶后木瓜蛋白酶的水解方式。

表5 酶解方式對(duì)酶解效果的影響Table 5 Effect of enzymolysis mode on enzymolysis effect

2.3 堿性蛋白酶水解條件的優(yōu)化

2.3.1 pH對(duì)酶解效果的影響 由圖2可知,當(dāng)pH小于8.0時(shí),水解度和肽含量都逐漸增大;當(dāng)pH為8.0時(shí),水解度達(dá)到最大值(19.10%),pH為8.5時(shí)肽含量達(dá)到最大值,為5.1 mg/mL,此時(shí)的水解度為18.75%。與pH為8.0時(shí)的水解度相比,變化不顯著(P>0.05)。pH會(huì)影響酶的穩(wěn)定性,pH大小不同,即溶液中OH-濃度不同,會(huì)影響蛋白酶自身的解離和底物的解離,從而影響酶解反應(yīng)[23],所以溶液過酸或過堿會(huì)影響酶與底物的結(jié)合。因此,綜合考慮選擇最佳pH為8.5進(jìn)行酶解實(shí)驗(yàn)。這與梁凱[16]采用堿性蛋白酶單酶酶解火麻仁粕蛋白時(shí)得到的結(jié)果一致,當(dāng)pH在7.0～8.5時(shí),水解度逐漸增大,并確定最佳pH為8.5,當(dāng)pH大于8.5時(shí),水解度開始逐漸降低。因此，pH選擇為8.5。

圖2 pH對(duì)堿性蛋白酶酶解效果的影響Fig.2 Effect of pH value on enzymatic hydrolysis by alkaline protease

2.3.2 加酶量對(duì)酶解效果的影響 由圖3可知,隨著加酶量的逐漸增大,漢麻多肽的水解度和肽含量逐漸上升。當(dāng)加酶量大于10000 U/g時(shí),水解度和肽含量趨于平緩。可能在此階段酶解過程中,大分子蛋白減少,導(dǎo)致大分子蛋白與酶結(jié)合的幾率大大減少,酶分子達(dá)到飽和狀態(tài)[24]。進(jìn)一步增加酶用量,水解度和肽含量增加不顯著。加酶量的多少?zèng)Q定漢麻蛋白水解后生成多肽的量,堿性蛋白酶作為一種內(nèi)切酶,作用位點(diǎn)較多,可能使肽鏈充分水解。綜合考慮,確定最佳加酶量為10000 U/g。

圖3 加酶量對(duì)堿性蛋白酶酶解效果的影響Fig.3 Effect of alkaline protease addition on enzymatic hydrolysis

圖4 時(shí)間對(duì)堿性蛋白酶酶解效果的影響Fig.4 Effect of time on enzymatic hydrolysis by alkaline protease

2.3.3 時(shí)間對(duì)酶解效果的影響 由圖4可知,當(dāng)酶解時(shí)間在1～2 h之間時(shí),水解度和肽含量的變化趨勢(shì)一致,隨著時(shí)間的增加,水解度和肽含量明顯增加,蛋白與酶充分反應(yīng),生成大量漢麻多肽;當(dāng)酶解時(shí)間大于2 h后,反應(yīng)幾乎停滯。原因可能是在反應(yīng)初期,底物濃度較大,蛋白酶與底物作用效果明顯,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),底物濃度逐漸降低[25],漢麻蛋白幾乎全部水解,水解度和肽含量幾乎不再變化。因此,選擇最佳酶解時(shí)間為2 h。

2.3.4 溫度對(duì)酶解效果的影響 溫度也是影響酶解效果的重要因素,由圖5可知,隨著溫度的升高,漢麻蛋白水解度和漢麻肽含量逐漸增大,在55 ℃時(shí)二者達(dá)到最大值,當(dāng)溫度大于55 ℃時(shí),水解度和肽含量緩慢減小,可能是由于反應(yīng)體系溫度過高,使堿性蛋白酶活性降低,水解反應(yīng)逐漸緩慢。酶的催化反應(yīng)都有各自的最適溫度,溫度過高會(huì)影響蛋白酶的穩(wěn)定性,使酶失活;其次酶促反應(yīng)過程中,酶與底物、酶與抑制劑的結(jié)合都會(huì)受溫度的影響[26]。因此選擇最佳溫度為55 ℃。此結(jié)果與周徐慧[27]采用堿性蛋白酶制備抗氧化肽時(shí)得到的結(jié)果一致,同樣在55 ℃時(shí)水解度達(dá)到最大。

圖5 溫度對(duì)堿性蛋白酶酶解效果的影響Fig.5 Effect of temperature on enzymatic hydrolysis by alkaline protease

2.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化堿性蛋白酶水解條件 固定酶解反應(yīng)條件底物濃度為5%,時(shí)間為2 h,選定對(duì)酶解效果影響較大的3種因素(加酶量、溫度、pH)作為響應(yīng)面分析試驗(yàn)的各因素,從而求出其最佳水解工藝條件。以pH(A)、溫度(B)、加酶量(C)作為自變量,以漢麻蛋白水解度(Y1)和酶解結(jié)束時(shí)溶液中的肽含量(Y2)為指標(biāo),設(shè)計(jì)三因素三水平試驗(yàn),響應(yīng)面結(jié)果見表6。

表6 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 6 Design and results of Box-Behnken experiment

表7 回歸模型方差分析Table 7 Variance analysis for the regression model

采用Design-Expert V 8.0.6軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析,得到的回歸方程為:

Y1=23.14-0.019A-0.92B+0.44C-0.70AB+0.10AC+0.49BC-1.88A2-2.29B2-1.59C2;

Y2=7.08+0.12A-0.37B+0.20C-0.31AB-0.04AC+0.29BC-0.54A2-0.60B2-0.42C2。

對(duì)方程進(jìn)行顯著性及方差分析,結(jié)果見表7。

圖6 pH和溫度對(duì)水解度和肽含量的交互作用Fig.6 Interaction of pH and temperature on peptide content

該模型中三個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值的影響強(qiáng)弱可用F值來進(jìn)行評(píng)價(jià),各因素對(duì)漢麻蛋白肽的水解度和肽含量的影響順序?yàn)?溫度>加酶量>pH,其中溫度的影響極顯著(P<0.01),加酶量影響顯著(P<0.05),pH影響不顯著。對(duì)于因素間的交互作用,模型中只有AB交互作用顯著(P<0.05)。根據(jù)Design Expert軟件得出的回歸模型各因素相互之間作用如圖6所示。

響應(yīng)曲面的交互圖中的橢圓排列越稀疏,各因素的變化對(duì)結(jié)果的影響越小;響應(yīng)面圖斜度越大,響應(yīng)值越敏感,對(duì)結(jié)果的影響越大[28]。由圖6可知,隨著溫度和pH的升高,水解度和肽含量呈先增加后減小的現(xiàn)象，AB交互作用顯著，與方差分析結(jié)果一致。該模型得到的堿性蛋白酶酶解最佳工藝條件為:pH為8.55,溫度為53.74 ℃,加酶量為10120.39 U/g,此時(shí)預(yù)測(cè)水解度為23.24%,肽含量為7.16 mg/mL。為了進(jìn)一步驗(yàn)證模型的可靠性,考慮到實(shí)際生產(chǎn)操作,將最佳堿性蛋白酶酶解工藝調(diào)整為:pH為8.5,溫度為54 ℃，加酶量為10100 U/g,并在此條件下重復(fù)3次試驗(yàn),實(shí)測(cè)水解度為22.95%,肽含量為7.06 mg/mL,與預(yù)測(cè)值較為接近,說明模型擬合較好。

2.4 木瓜蛋白酶水解條件的優(yōu)化

2.4.1 pH對(duì)酶解效果的影響 由圖7可知,隨著pH的增加,水解度和肽含量均先增加后降低;當(dāng)木瓜蛋白酶pH為6.5時(shí),水解度和肽含量都達(dá)到最大值(22.58%和7.59 mg/mL);當(dāng)pH高于6.5時(shí),水解度和肽含量的變化趨勢(shì)都有一定程度的降低。這是因?yàn)槊傅幕钚圆课粚?duì)反應(yīng)體系的pH變化比較敏感,解離狀態(tài)隨pH變化而變化,這些變化會(huì)影響酶的空間構(gòu)象,使蛋白酶的活力下降,反應(yīng)達(dá)到一定的限度。綜合考慮,選擇木瓜蛋白酶pH為6.5。

圖7 pH對(duì)木瓜蛋白酶酶解效果的影響Fig.7 Effect of pH on enzymatic hydrolysis by papain

2.4.2 加酶量對(duì)酶解效果的影響 木瓜蛋白酶的加酶量對(duì)酶解工藝的影響見圖8,在加酶量為2000～4000 U/g范圍內(nèi),隨著加酶量的增加,水解度和肽含量逐漸增加,沒有分解的大分子蛋白逐漸分解成小分子肽;當(dāng)加酶量大于5000 U/g時(shí),酶解達(dá)到飽和狀態(tài),過量的酶不能與底物充分接觸,無法相互作用,因此再進(jìn)一步增加酶量,使水解度和肽含量變化不顯著?？紤]生產(chǎn)成本,選擇最佳加酶量為5000 U/g。

圖8 加酶量對(duì)木瓜蛋白酶酶解效果的影響Fig.8 Effect of papain addition on enzymatic hydrolysis

圖9 時(shí)間對(duì)木瓜蛋白酶酶解效果的影響Fig.9 Effect of time on enzymatic hydrolysis by papain

2.4.3 時(shí)間對(duì)酶解效果的影響 由圖9可知,當(dāng)酶解時(shí)間為1.5 h時(shí),肽含量達(dá)到最大值,此時(shí)的水解度大小與2 h的水解度相比變化不顯著(P>0.05)。隨著時(shí)間的延長(zhǎng),蛋白酶的活性開始逐漸下降,可見,木瓜蛋白酶酶解1.5 h后,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),漢麻分離蛋白基本水解完全,部分多肽分解為氨基酸分布在溶液中,使肽含量降低。與其他因素相比,時(shí)間對(duì)于水解度和肽含量的影響較低,可能是因?yàn)檫x擇的時(shí)間范圍較窄,在此范圍內(nèi)變化不明顯。所以,綜合考慮選擇酶解時(shí)間1.5 h,此時(shí)水解度為23.25%,肽含量為7.47 mg/mL。

2.4.4 溫度對(duì)酶解效果的影響 由圖10可知,當(dāng)溫度為45～50 ℃時(shí),水解度和肽含量逐漸增大,可能是由于溫度的升高,使酶活性中心與反應(yīng)底物分子之間有效碰撞的幾率增大;當(dāng)溫度為50 ℃時(shí)水解度和肽含量都達(dá)到最大值,當(dāng)溫度大于50 ℃時(shí),水解度和肽含量緩慢下降,可能是溫度過高,破壞了蛋白酶的特定空間構(gòu)象,從而使酶活中心受到破壞,蛋白酶活性急劇下降,酶解效果降低。因此,選擇溫度為50 ℃。

表9 回歸模型方差分析Table 9 Variance analysis for the regression model

圖10 木瓜蛋白酶溫度對(duì)酶解效果的影響Fig.10 Effect of temperature on enzymatic hydrolysis by papain

2.4.5 木瓜蛋白酶水解條件優(yōu)化 選用木瓜蛋白酶進(jìn)行第二步酶解,在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,固定底物濃度為5%,水解時(shí)間為1.5 h,選擇影響因素較大的pH(A)、溫度(B)、加酶量(C)進(jìn)行二次回歸分析,以水解度(Y1)和肽含量(Y2)為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn),試驗(yàn)方案及結(jié)果見表8。

表8 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 8 Andexperimental results of Box-Behnken experimental design

采用Design-Expert V 8.0.6軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析,得到的回歸方程為:

Y1=25.46-0.14A-1.17B+0.31C-0.70AB+0.35AC+0.99BC - 1.92A2- 1.58B2- 1.13C2;

Y2=8.08+0.12A - 0.37B+0.2C-0.3AB-0.04AC+0.29BC - 0.54A2- 0.6B2- 0.42C2。

對(duì)方程進(jìn)行顯著性及方差分析,結(jié)果見表9。

圖11 水解度交互作用分析Fig.11 Interaction analysis of degree of hydrolysis

圖12 肽含量交互作用分析Fig.12 Interaction analysis of peptide content

該模型中三個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值的影響強(qiáng)弱可用F值來進(jìn)行評(píng)價(jià),各因素對(duì)漢麻蛋白肽的水解度和肽含量的影響順序?yàn)?溫度>加酶量>pH,其中溫度的影響極顯著(P<0.01),加酶量對(duì)肽含量影響顯著(P<0.05),pH影響不顯著。對(duì)于因素間的交互作用,模型中AB和BC交互作用對(duì)肽含量影響顯著(P<0.05)，BC交互作用對(duì)水解度影響顯著(P<0.05)。根據(jù)Design Expert軟件得出的回歸模型各因素相互之間作用如圖11和圖12所示。BC交互作用對(duì)水解度影響顯著，AB、BC交互作用對(duì)肽含量影響顯著(P<0.05)，與方差分析結(jié)果一致。

該模型得到的木瓜酶酶解最佳工藝條件為:pH為6.44,溫度為50.49 ℃,加酶量為5006.49 U/g,此時(shí)預(yù)測(cè)水解度的為24.68%,肽含量為8.54 mg/mL。為了進(jìn)一步驗(yàn)證模型的可靠性,考慮到實(shí)際生產(chǎn)操作,將最佳酶解工藝調(diào)整為:pH為6.5,溫度為50 ℃,加酶量為5000 U/g,并在此條件下重復(fù)3次試驗(yàn),實(shí)測(cè)水解度為24.48%,肽含量為8.48 mg/mL,與預(yù)測(cè)值較為接近,說明模型擬合較好。

2.5 漢麻蛋白肽抗氧化能力評(píng)價(jià)

DPPH自由基是一種穩(wěn)定的含氮自由基,與乙醇溶液相混合后呈紫色,并在517 nm處具有最大的吸收峰[29]?？寡趸瘎┣宄杂苫姆绞绞峭ㄟ^自身的還原作用來給出電子,還原能力越強(qiáng),代表其抗氧化活性就越強(qiáng)[30]。因此,當(dāng)吸光度越大時(shí),還原能力越強(qiáng),說明抗氧化活性也越強(qiáng)。試驗(yàn)研究了HPI酶解前后的DPPH自由基清除率和鐵還原能力。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖13、圖14)可知,隨著樣品濃度的不斷增大,HPI和HPH的DPPH自由基清除率和鐵還原能力均不斷增加,陽性對(duì)照VC的活性最強(qiáng),其中HPI的DPPH自由基清除率的IC50值為8.97 mg/mL,HPH的IC50值為6.37 mg/mL。且HPI酶解后的抗氧化能力均強(qiáng)于HPI本身,當(dāng)樣品濃度為10 mg/mL時(shí),DPPH自由基清除率達(dá)到了82.32%,鐵還原能力增加了29.6%,可能是蛋白酶對(duì)HPI水解后,大分子肽鏈被切斷,HPI的分子構(gòu)象發(fā)生變化,暴露出其內(nèi)部結(jié)構(gòu),一些具有抗氧化能力的氨基酸殘基也逐漸暴露出來,如色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、組氨酸(His)和苯丙氨酸(Phe)等,這些氨基酸經(jīng)研究具有抗氧化活性[31],王慶玲[32]在熱處理和pH偏移條件下對(duì)HPI的氨基酸組成的影響研究中,經(jīng)測(cè)定含有這些具有抗氧化性的氨基酸且種類豐富,從而使HPI經(jīng)過酶解后其抗氧化能力明顯上升。

圖13 不同濃度樣品的DPPH自由基清除率結(jié)果Fig.13 Results of scavenging rate of DPPH free radicals of samples with different concentrations

圖14 不同濃度樣品的鐵還原能力結(jié)果Fig.14 Results of iron reduction capacity of samples at different concentrations

3 結(jié)論

本研究采用堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶復(fù)合分步酶解的方式制備漢麻蛋白肽。最終得到的最佳工藝條件為:堿性蛋白酶加酶量為10100 U/g,pH為8.5,溫度為54 ℃,酶解時(shí)間2 h;第二步木瓜蛋白酶加酶量為5000 U/g,pH為6.5,溫度為50 ℃,酶解時(shí)間1.5 h,分步酶解后得到的漢麻蛋白水解物的水解度和肽含量分別為24.48%和8.48 mg/mL?？寡趸Y(jié)果表明漢麻多肽具有較好的DPPH自由基清除能力和鐵還原能力,說明漢麻抗氧化肽具有市場(chǎng)潛力,在食品保健領(lǐng)域有一定的開發(fā)利用價(jià)值。同時(shí)此工藝也為今后高F值漢麻寡肽的制備提供一定的理論基礎(chǔ)。今后還將對(duì)漢麻多肽的的結(jié)構(gòu)、氨基酸組成和序列進(jìn)行進(jìn)一步分析。