麥麩阿魏酸糖酯微生物發(fā)酵工藝優(yōu)化及體外抗氧化和益生活性評(píng)價(jià)

陳秋燕,郝希然,王 園,杜 涓,安曉萍,齊景偉

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,內(nèi)蒙古自治區(qū)草食家畜飼料 工程技術(shù)研究中心,內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

全谷物是由種皮、胚乳和胚等組成且組成部分的相對(duì)比例與天然谷物籽粒構(gòu)成相同的谷物原料,常見的全谷物有全小麥、燕麥、黑米、蕎麥等。食用全谷物可有效降低肥胖病、高血壓病、糖尿病和某些胃腸疾病的發(fā)病率[1],因此,全谷物的食用價(jià)值受到越來越多的關(guān)注。研究證實(shí),全谷物的保健功效與其含量豐富的維生素、礦物質(zhì)、類胡蘿卜素和酚酸等活性物質(zhì)有關(guān),特別是其中的酚酸類物質(zhì),可通過激活Nrf2-ARE信號(hào)通路,上調(diào)下游抗氧化酶和谷胱甘肽的表達(dá),起到抗氧化作用[2]。

阿魏酸(Ferulic acid,FA)是全谷物中含量最為豐富的酚酸類物質(zhì),通常以酯鍵與細(xì)胞壁多糖或以醚鍵與木質(zhì)素相連[3]。體內(nèi)、外研究表明,FA具有較強(qiáng)的抗氧化活性,可有效清除自由基[4-5],提高機(jī)體抗氧化功能[6]。阿魏酸糖酯(Feruloylated glycosides,FGs)是阿魏酸羧基與糖中不同位置上的糖羥基酯化而形成的一類化合物[7]。全谷物進(jìn)入消化道后,可經(jīng)由后腸道微生物發(fā)酵產(chǎn)生FGs。研究發(fā)現(xiàn)FGs具有比游離FA更強(qiáng)的抗氧化能力[8-9],并且具有促進(jìn)雙歧桿菌增殖[10]、抑制紅細(xì)胞溶血[11]和抵抗糖尿病[12]的作用。

麥麩作為小麥加工副產(chǎn)品,富含膳食纖維、酚酸等對(duì)人體有益的生物活性物質(zhì),為整個(gè)谷物籽粒功能性營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的核心[13]。FA在麥麩酚酸類物質(zhì)中占主導(dǎo)地位,含量高達(dá)2677.4～3401.8 μg/g[14]。因此,麥麩是制備FGs的良好資源[9,15-16]。目前,FGs的制備方法有物理法[17-18]、化學(xué)法[15,19]以及酶解法[9,20],但存在FGs易被分解,化學(xué)物質(zhì)殘留,成本高昂等問題。固態(tài)發(fā)酵是一種控制營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)釋放的可行方法,可直接利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)酶來制備FGs。解春艷[21]利用食藥用真菌茶薪菇發(fā)酵麥麩,制備了具有抗氧化、益生和抗腫瘤作用的FGs。余曉紅[22]利用選育出的出芽短梗霉發(fā)酵麥麩,其制備的FGs具有免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤活性。卜雯麗等[23]利用出芽短梗霉固態(tài)發(fā)酵啤酒糟制備出了FGs。然而,固態(tài)發(fā)酵制備FGs所使用的發(fā)酵菌種多為霉菌,非常見的食品級(jí)微生物。因此,本研究以植物乳桿菌、釀酒酵母、地衣芽孢桿菌以及枯草芽孢桿菌為發(fā)酵菌種,固態(tài)發(fā)酵麥麩制備FGs,在優(yōu)化最佳發(fā)酵工藝參數(shù)的同時(shí),評(píng)價(jià)FGs體外抗氧化和益生活性,以期為麥麩的合理利用及FGs的工業(yè)化生產(chǎn)提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

麥麩 市場(chǎng);低聚果糖(純度≥90%) 美國Sigma公司;菊粉(純度≥90%) 北京酷來搏科技有限公司;營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;硼砂、甘氨酸、DPPH、無水乙醇、FeSO4、H2O2、水楊酸、三氯乙酸、K3Fe(CN)6、FeCl3國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum,L)CGMCC1.2437、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis,B1)CGMCC 1.0892、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis,B2)CGMCC1.813、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae,S)CGMCC 2.119、嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)CGMCC 1.2471 均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

HVA-85型壓力滅菌器 日本Hirayama公司;SW-CJ超凈工作臺(tái) 上海新苗醫(yī)療器械;QYC-200恒溫培養(yǎng)搖床 上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;LRH-250F生化培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;TDL-5-A型臺(tái)式高速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;微孔板分光光度計(jì) 美國Bio-Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 種子液制備 枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌使用營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基,植物乳桿菌使用MRS肉湯培養(yǎng)基,釀酒酵母使用麥芽汁培養(yǎng)基,將各菌種所需培養(yǎng)基滅菌(121 ℃,0.1 MPa)備用?？莶菅挎邨U菌和地衣芽孢桿菌培養(yǎng)溫度為37 ℃,搖床轉(zhuǎn)速為120 r/min,培養(yǎng)24 h;植物乳桿菌溫度為37 ℃,靜置培養(yǎng)24 h;釀酒酵母培養(yǎng)溫度為28 ℃,搖床轉(zhuǎn)速為120 r/min,培養(yǎng)24 h;分別使菌體濃度達(dá)到108CFU/mL。

1.2.2 菌種篩選

1.2.2.1 單菌種發(fā)酵 滅菌后的麥麩按10%接種量分別接入單一菌種,料水比1∶1,攪拌均勻,置于37 ℃生化培養(yǎng)箱中靜置發(fā)酵培養(yǎng)48 h。測(cè)定發(fā)酵產(chǎn)物中FGs產(chǎn)量,對(duì)比單菌發(fā)酵效果。

1.2.2.2 混菌發(fā)酵 滅菌后的麥麩按10%總接種量分別接入雙菌組合(接種比例為1∶1)、三菌(接種比例為1∶1∶1)和四菌(接種比例為1∶1∶1∶1)混合發(fā)酵,料水比1∶1,攪拌均勻,置于37 ℃生化培養(yǎng)箱中靜置發(fā)酵培養(yǎng)48 h。測(cè)定發(fā)酵產(chǎn)物中FGs產(chǎn)量,對(duì)比混菌發(fā)酵效果。

1.2.3 發(fā)酵條件優(yōu)化

1.2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)FGs的發(fā)酵制備工藝,以枯草芽孢桿菌∶地衣芽孢桿菌∶釀酒酵母=1∶1∶1為發(fā)酵菌種,設(shè)定接種量10%、發(fā)酵溫度37 ℃、發(fā)酵時(shí)間48 h、料水比1∶1為固定條件,分別研究接種量(5%、7.5%、10%、12.5%、15%)、發(fā)酵溫度(32、37、42、47 ℃)、發(fā)酵時(shí)間(24、36、48、60、72 h)、料水比(1∶0.5、1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5 g/mL)對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物中FGs產(chǎn)量的影響。

1.2.3.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,選取最優(yōu)的接種量(12.5%)、發(fā)酵溫度(42 ℃)、發(fā)酵時(shí)間(60 h)、料水比(1∶1)為中心點(diǎn),以發(fā)酵產(chǎn)物中FGs產(chǎn)量為響應(yīng)值,采用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)4因素3水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)因素設(shè)計(jì)如下表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)各因素水平Table 1 Code and level of independent variables used for Box-Behnken design

1.2.4 FGs的提取 發(fā)酵結(jié)束后,取發(fā)酵樣品置于鼓風(fēng)干燥箱中45 ℃烘干48 h,將烘干樣品粉碎,取干燥發(fā)酵麥麩以料水比為1∶10加入蒸餾水中,在水浴鍋中80 ℃浸提30 min,冷卻離心(5000 r/min,10 min),取上清備用[24]。

1.2.5 FGs濃度的測(cè)定 利用雙波長(zhǎng)法[16]測(cè)定FGs濃度,發(fā)酵麥麩水提液:硼砂-甘氨酸緩沖溶液(0.1 mL/L,pH=10)按1∶9比例混合,分別于345和375 nm處測(cè)定吸光度(OD)。根據(jù)FA的摩爾吸光系數(shù)(M-1cm-1):ε′345=19662,ε′375=7630和FGs的摩爾吸光系數(shù)(M-1cm-1):ε345=23064,ε375=31430,計(jì)算FGs濃度。

C=[(ε′345×A375-ε′375×A345)b/(ε′345×ε375-ε345×ε′375)]/C0

式中:C為發(fā)酵麥麩中FGs濃度(nmol/g);b為比色皿厚度(cm);A345為波長(zhǎng)345 nm處OD值;A375為波長(zhǎng)375 nm處OD值;C0為發(fā)酵麥麩水溶液濃度(mg/mL)。

1.2.6 FGs體外抗氧化活性評(píng)價(jià)

1.2.6.2 DPPH自由基清除率的測(cè)定 準(zhǔn)確吸取2 mL濃度為(0、0.5、1、2、4 mg/mL)的發(fā)酵麥麩FGs于試管中,加入2 mL DPPH乙醇溶液(0.5 mmol/L)混勻,靜止30 min后在517 nm處測(cè)定吸光度(A0),同時(shí)測(cè)定只加95%乙醇的DPPH溶液吸光度(A1)以及對(duì)照組吸光度(A2),以BHA為陽性對(duì)照,其中DPPH自由基的清除率(%)=[1-(A0-A1)/A2]×100[26]。

1.2.6.3 羥基自由基清除率的測(cè)定 準(zhǔn)確吸取0.5 mL濃度為(0、0.5、1、2、4 mg/mL)的發(fā)酵麥麩FGs于試管中,加入0.5 mL FeSO4溶液(9.0 mmol/L)與0.5 mL H2O2(8.8 mmol/L),室溫反應(yīng)10 min,加入0.5 mL水楊酸乙醇溶液(9.0 mmol/L),室溫反應(yīng)30 min,與510 nm處測(cè)定吸光度(A1),同時(shí)測(cè)定蒸餾水代替FeSO4溶液吸光度(A2)以及對(duì)照組吸光度(A0);計(jì)算羥基自由基的清除力[26],其中羥基自由基的清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100。

1.2.7 FGs的益生活性評(píng)價(jià) 將植物乳桿菌和嗜熱鏈球菌接種到MRS肉湯液體培養(yǎng)基中,(37±0.1) ℃靜置厭氧培養(yǎng)24 h,取菌懸液備用。以無碳水化合物的MRS培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基(陰性對(duì)照),分別添加10 mg/mL的低聚果糖、菊粉和發(fā)酵麥麩FGs。所有培養(yǎng)基均滅菌(121 ℃,0.1 MPa)30 min,冷卻后分別接種0.5%植物乳桿菌或嗜熱鏈球菌菌懸液,37 ℃靜置厭氧培養(yǎng),每4 h在600 nm處測(cè)定OD值,以相對(duì)培養(yǎng)0 h OD 值的增長(zhǎng)量繪制植物乳桿菌和嗜熱鏈球菌的生長(zhǎng)曲線[27]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Minitab 17軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析;SAS 9.2統(tǒng)計(jì)軟件ANOVA模型進(jìn)行單因素方差分析,用Duncan’s檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較,P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種篩選

2.1.1 不同單菌種對(duì)發(fā)酵麥麩FGs產(chǎn)量的影響 不同單菌種發(fā)酵對(duì)FGs產(chǎn)量的影響見圖1。由圖1可以看出,枯草芽孢桿菌發(fā)酵麥麩獲得的FGs產(chǎn)量顯著高于其他發(fā)酵菌種(P<0.05),經(jīng)過單菌種固態(tài)發(fā)酵,發(fā)酵麥麩FGs產(chǎn)量最高的菌種是枯草芽孢桿菌,其次是植物乳桿菌和釀酒酵母,最低是地衣芽孢桿菌。

圖1 不同單菌種對(duì)FGs產(chǎn)量的影響Fig.1 Effects of single starter strain on FGs yield注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05); 相同字母表示差異不顯著(P>0.05); L表示植物乳桿菌，B1表示枯草芽孢桿菌， B2表示地衣芽孢桿菌，S表示釀酒酵母；圖2～圖6同。

2.1.2 混合種菌發(fā)酵對(duì)發(fā)酵麥麩FGs產(chǎn)量的影響 混合菌種發(fā)酵對(duì)FGs產(chǎn)量的影響見圖2。由圖2可以看出,枯草芽孢桿菌+地衣芽孢桿菌+釀酒酵母菌組合發(fā)酵得到的FGs產(chǎn)量最高,FGs產(chǎn)量為655.90±30.61 nmol/g,顯著高于其他組合(P<0.05)。另外,混合菌種發(fā)酵獲得的FGs產(chǎn)量高于單菌種發(fā)酵,表明混合菌種發(fā)酵可以利用不同菌種間的互補(bǔ)性和協(xié)同性,降低單菌發(fā)酵的劣勢(shì),提高FGs的產(chǎn)量[28-30]。因此選擇枯草芽孢桿菌+地衣芽孢桿菌+釀酒酵母組合固態(tài)發(fā)酵麥麩制備FGs。

圖2 混合種菌發(fā)酵對(duì)FGs產(chǎn)量的影響Fig.2 Effects of different starter strain combination on FGs yield

2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化

2.2.1 接種量對(duì)FGs產(chǎn)量的影響 由圖3可知,接種量在5%～15%的范圍內(nèi),FGs產(chǎn)量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)。隨著接種量的增加,發(fā)酵所產(chǎn)生的麥麩FGs含量逐漸增加,接種量達(dá)到12.5%之后,FGs產(chǎn)量出現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì),由于接種量過多,菌種需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)增加,導(dǎo)致溶氧含量不足[31],影響FGs的合成。雖然接種量15%與接種量12.5%時(shí)的FGs產(chǎn)量差異不顯著(P>0.05)。但考慮到生產(chǎn)成本,選擇12.5%作為響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)的接種量中心點(diǎn)。

圖 3 接種量對(duì)FGs產(chǎn)量的影響Fig.3 Effects of level of inoculum on FGs yield

2.2.2 發(fā)酵溫度對(duì)FGs產(chǎn)量的影響 由圖4可知,隨著發(fā)酵溫度的增加,FGs產(chǎn)量逐漸升高。在發(fā)酵溫度為42 ℃時(shí),FGs產(chǎn)量最高,顯著高于其他發(fā)酵溫度(P<0.05)。可能是因?yàn)榛旌暇N的生長(zhǎng)對(duì)溫度要求較高,只有在適宜溫度范圍內(nèi),菌種才能發(fā)揮最大的作用,溫度過低,不利于菌種生長(zhǎng),FGs產(chǎn)量低;而溫度太高,菌種快速生長(zhǎng),大量孢子出現(xiàn)老化,菌種活力降低[30,32],FGs產(chǎn)量下降。因此,選擇42 ℃作為響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)的發(fā)酵溫度中心點(diǎn)。

圖4 發(fā)酵溫度對(duì)FGs產(chǎn)量的影響Fig.4 Effects of incubation temperature on FGs yield

圖5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)FGs產(chǎn)量的影響Fig.5 Effects of incubation duration on FGs yield

2.2.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)FGs產(chǎn)量的影響 由圖5可知,發(fā)酵時(shí)間為24～60 h,發(fā)酵麥麩FGs產(chǎn)量逐漸升高,發(fā)酵60 h時(shí)FGs產(chǎn)量最高,顯著高于其他發(fā)酵時(shí)間(P<0.05),繼續(xù)延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間,FGs產(chǎn)量反而降低?？赡苁怯捎谠诎l(fā)酵開始階段,麥麩中可用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)較多,能滿足菌種快速生長(zhǎng)的需要,隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng),菌種開始逐漸老化[33],麥麩中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被消耗所剩不多,FGs產(chǎn)量降低。因此,選擇60 h作為響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)的發(fā)酵時(shí)間中心點(diǎn)。

2.2.4 料水比對(duì)FGs產(chǎn)量的影響 由圖6可知,隨著料水比的增加,發(fā)酵麥麩FGs產(chǎn)量先增加后下降。其中,當(dāng)料水比為1∶1時(shí),FGs產(chǎn)量達(dá)到最高,與1∶1.5和1∶2組差異不顯著(P>0.05),顯著高于1∶0.5和1∶2.5組(P<0.05)。當(dāng)料水比增加到1∶2.5時(shí),FGs產(chǎn)量顯著下降(P<0.05)。由于發(fā)酵料中水分太多會(huì)產(chǎn)生黏稠結(jié)塊現(xiàn)象[31],不利于麥麩大分子物質(zhì)的降解。因此,選擇1∶1作為響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)的料水比中心點(diǎn)。

圖6 料水比對(duì)FGs產(chǎn)量的影響Fig.6 Effects of material to water ratio on FGs yield

2.2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析 利用Design-Expert 8.0.6分析,通過對(duì)表2中的FGs產(chǎn)量試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,選擇對(duì)響應(yīng)值顯著的各項(xiàng),可得接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、料水比對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物中FGs產(chǎn)量的二次回歸方程為:FGs產(chǎn)量(nmol/g)=1289.31+9.11A+34.26B-4.13C+121.68D-23.21AB+19.27AC-129.10AD-66.04BC+6.50BD-23.98CD-54.56A2-245.70B2-104.76C2-263.02D2。

表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

表3 響應(yīng)面方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance for response surface regression model

模型方程顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見表3。從表3可知,該模型P值小于0.01,表明回歸模型極顯著;失擬項(xiàng)P值為0.86，大于0.05，失擬項(xiàng)不顯著,試驗(yàn)設(shè)計(jì)可靠。其中復(fù)相關(guān)系數(shù)的平方98.56%(R2=98.56%),表明98.56%的FGs產(chǎn)量變化可以用這個(gè)模型進(jìn)行解釋。線性系數(shù)(B發(fā)酵溫度、D料水比)、二次項(xiàng)系數(shù)(A2、B2、C2、D2)和雙因子交互作用系數(shù)(AD和BC)對(duì)FGs產(chǎn)量的影響都差異顯著(P<0.05),而其他線性系數(shù)和雙因子交互作用系數(shù)對(duì)FGs產(chǎn)量的影響差異不顯著(P>0.05)。

四個(gè)發(fā)酵條件(A接種量、B發(fā)酵溫度、C發(fā)酵時(shí)間、D料水比)之間交互作用對(duì)FGs產(chǎn)量的影響如圖7所示。由圖7可知:B發(fā)酵溫度和D料水比對(duì)FGs產(chǎn)量的影響為顯著(P<0.05),表現(xiàn)為曲線較陡;A接種量和C發(fā)酵時(shí)間對(duì)FGs產(chǎn)量的影響不顯著,表現(xiàn)為曲線平滑。

圖7 兩因素交互作用對(duì)FGs產(chǎn)量的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface plots showing the interactive effects of fermentation parameters on FGs yield

2.2.6 最優(yōu)條件及驗(yàn)證試驗(yàn) 由Design-Expert 8.0.6統(tǒng)計(jì)分析軟件中響應(yīng)面優(yōu)化器并為了方便實(shí)際操作,確定最佳發(fā)酵條件為:接種量為10.7%,發(fā)酵溫度為42.5 ℃,發(fā)酵時(shí)間為58.5 h,料水比為1∶1.16,發(fā)酵產(chǎn)物中FGs產(chǎn)量的理論值為1309.46 nmol/g。用得到的最佳發(fā)酵條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),6次平行試驗(yàn)得到發(fā)酵產(chǎn)物中實(shí)際FGs產(chǎn)量為1273.18±113.25 nmol/g,與理論值相差2%,差值小于3%。

2.3 體外抗氧化活性結(jié)果

2.3.1 還原力 還原力為活性物質(zhì)提供電子的能力,單電子氧化還原電位越低的活性物質(zhì)其還原力越強(qiáng),因此,還原力可以作為評(píng)價(jià)天然化合物潛在抗氧化活性的一個(gè)重要指標(biāo)[34-35]。發(fā)酵麥麩FGs還原力大小如圖8所示,還原力與發(fā)酵麥麩FGs溶液濃度呈劑量依賴性增加;發(fā)酵麥麩FGs溶液濃度在4 mg/mL時(shí),雖然其還原力仍顯著低于標(biāo)準(zhǔn)品BHA(P<0.05),但可達(dá)到1.078,可能是FGs結(jié)構(gòu)中具有阿魏?；陀H水性的低聚糖基團(tuán),這些基團(tuán)的存在降低了氧化還原電位[36],因此發(fā)酵麥麩FGs具有較強(qiáng)的還原能力。

2.3.2 DPPH自由基清除率 DPPH自由基可以接受一個(gè)電子或一個(gè)氫自由基成為穩(wěn)定的抗磁分子[37],被廣泛用于檢測(cè)各種天然產(chǎn)物清除自由基的能力,一種物質(zhì)清除DPPH自由基的能力強(qiáng)弱可以反應(yīng)其抗氧化活性大小[35,38]。發(fā)酵麥麩FGs對(duì)DPPH自由基的清除率如圖8所示,DPPH自由基清除率隨著發(fā)酵麥麩FGs溶液濃度增加呈顯著先增加后趨于平緩的趨勢(shì),雖然不同濃度的發(fā)酵麥麩FGs溶液對(duì)DPPH自由基清除率低于標(biāo)準(zhǔn)品BHA(P<0.05),但DPPH自由基清除率在發(fā)酵麥麩FGs濃度為1 mg/mL時(shí)可達(dá)高到87.42%,且與標(biāo)準(zhǔn)品BHA差異不顯著(P>0.05),可能是因?yàn)镕Gs具有阿魏?；姆恿u基,DPPH自由基更容易與酚羥基上的氫原子反應(yīng)[36],因此發(fā)酵麥麩FGs具有較高DPPH自由基清除能力。

2.3.3 羥基自由基清除率 羥基自由基具有極強(qiáng)的氧化活性,能夠直接損傷細(xì)胞中核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等生物大分子,已被認(rèn)為是一種對(duì)生物體非常有害的氧化劑[34]。發(fā)酵麥麩FGs對(duì)羥基自由基的清除能力由圖8可得,發(fā)酵麥麩FGs對(duì)羥基自由基清除效果與發(fā)酵麥麩FGs溶液濃度呈正相關(guān),濃度在0.5～4 mg/mL之間時(shí),同一濃度下發(fā)酵麥麩FGs溶液對(duì)羥基自由基清除效果顯著低于標(biāo)準(zhǔn)品BHA(P<0.05);當(dāng)濃度為4 mg/mL時(shí),雖然其羥基自由基清除率仍顯著低于標(biāo)準(zhǔn)品BHA(P<0.05),但可達(dá)到33.68%。由于FGs結(jié)構(gòu)中有阿魏酸和低聚糖基團(tuán)的存在,使其更容易和羥基自由基反應(yīng),因此發(fā)酵麥麩FGs具有較高羥基自由基清除能力。

圖8 不同濃度發(fā)酵麥麩FGs體外抗氧化活性 Fig.8 In vitro antioxidant activity of fermented wheat bran FGs注:大寫字母不同表示組間差異顯著(P<0.05); 小寫字母不同表示組內(nèi)差異顯著(P<0.05)。

2.4 體外益生活性結(jié)果

發(fā)酵麥麩FGs對(duì)植物乳桿菌和嗜熱鏈球菌增殖的結(jié)果見圖9。如圖所示,四個(gè)處理組中菌液OD值均隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,表明低聚果糖、菊粉和發(fā)酵麥麩FGs對(duì)植物乳桿菌和嗜熱鏈球菌的生長(zhǎng)均有一定促進(jìn)作用。分子量是影響碳水化合物益生元對(duì)益生菌增殖的重要因素之一,低分子量不易消化的碳水化合物具有較好的促增殖作用,分枝度對(duì)益生菌增殖也有影響[39-40]。如圖9A所示,發(fā)酵麥麩FGs對(duì)植物乳桿菌增殖的促進(jìn)作用顯著低于菊粉(P<0.05),在整個(gè)生長(zhǎng)過程都顯著高于陰性對(duì)照組和低聚果糖組(P<0.05),可能是FGs比低聚果糖多了酯鍵的存在,其分子量比低聚果糖低,所以對(duì)植物乳桿菌的增殖作用更好。如圖9B所示,低聚果糖、菊粉和發(fā)酵麥麩FGs對(duì)嗜熱鏈球菌的增殖影響存在時(shí)間差異,在0～8 h之間,發(fā)酵麥麩FGs對(duì)嗜熱鏈球菌增殖的促進(jìn)作用顯著優(yōu)于陰性對(duì)照與低聚果糖(P<0.05),而在8 h之后,低聚果糖對(duì)嗜熱鏈球菌增殖的促進(jìn)作用更為顯著(P<0.05)。這是由于麥麩FGs含有阿魏?；陀H水性的糖體部分[36],提高了其溶解度,水溶性好的發(fā)酵麥麩FGs可被嗜熱鏈球菌更方便、快速和完全地利用[40],因此,前期發(fā)酵麥麩FGs對(duì)嗜熱鏈球菌增殖具有較強(qiáng)的促進(jìn)作用,而后期的促進(jìn)增殖作用降低。Yuan等[10]研究發(fā)現(xiàn)FGs 對(duì)雙歧桿菌的增殖作用顯著高于低聚木糖,與本研究結(jié)果相似。由以上結(jié)果可得,發(fā)酵麥麩FGs具有一定的促進(jìn)益生菌增殖作用,在一定發(fā)酵麥麩FGs濃度下,其增殖作用與所作用益生菌種類有關(guān)。

圖9 發(fā)酵麥麩FGs對(duì)植物乳桿菌和嗜熱鏈球菌生長(zhǎng)的影響Fig.9 Effects of fermented wheat bran FGs on the growth of Lactobacillus plantarum and Streptococcus thermophiles注:A發(fā)酵麥麩FGs對(duì)植物乳桿菌生長(zhǎng)的影響; B發(fā)酵麥麩FGs對(duì)嗜熱鏈球菌生長(zhǎng)的影響; 小寫字母不同表示組間差異顯著(P<0.05)。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以發(fā)酵麩皮FGs產(chǎn)量為指標(biāo),通過單菌發(fā)酵及混菌發(fā)酵篩選出最優(yōu)菌種組合為枯草芽孢桿菌+地衣芽孢桿菌+釀酒酵母,以該菌種組合發(fā)酵小麥麩皮獲得的FGs產(chǎn)量為655.9 nmol/g,較原料中FGs產(chǎn)量207.5 nmol/g提高了316%。進(jìn)一步對(duì)制備小麥麩皮FGs的發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化,最佳發(fā)酵工藝參數(shù)為:接種量為10.7%,發(fā)酵時(shí)間為58.5 h,發(fā)酵溫度為42.5 ℃,料水比為1∶1.6,在此發(fā)酵條件下得到的小麥麩皮FGs產(chǎn)量為1273.18 nmol/g,發(fā)酵效果較為明顯。此外,對(duì)其體外抗氧化和益生活性評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn),發(fā)酵麥麩FGs對(duì)羥自由基清除率為33.68%(4 mg/mL),對(duì)DPPH自由基清除率為87.42%(1 mg/mL),還原力為1.078 (4 mg/mL),說明發(fā)酵麥麩FGs具有一定的抗氧化能力;發(fā)酵麥麩FGs對(duì)嗜熱鏈球菌和植物乳桿菌增殖均有一定的促進(jìn)作用。

利用枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和釀酒酵母混菌發(fā)酵小麥麩皮,獲得了產(chǎn)量較高且具有體外抗氧化和益生活性的FGs,提高了小麥麩皮的附加值,為提高小麥麩皮的綜合利用率提供了有效的途徑。