外界因素和杜仲葉提取物對(duì)雙乙酸鈉的抑菌活性影響

楊秋玲,王 翔,王志宏,黃 韜,彭密軍,*,寧禮信

(1.廣東省科學(xué)院測(cè)試分析研究所(中國(guó)廣州分析測(cè)試中心),廣東廣州 510070; 2.廣東中測(cè)食品化妝品安全評(píng)價(jià)中心有限公司,廣東中山 528437)

食品成分復(fù)雜,蛋白質(zhì)、脂肪和碳水化合物等食品基質(zhì)容易對(duì)食品防腐劑或天然抑菌劑的抑菌活性產(chǎn)生影響[1-3]。食品中豐富的營(yíng)養(yǎng),可能與抑菌成分發(fā)生作用,降低其抑菌活性。此外,食品從生產(chǎn)到消費(fèi)過(guò)程中經(jīng)歷了復(fù)雜的環(huán)境變化，這些外界環(huán)境因素也可能對(duì)其抑菌活性產(chǎn)生影響,尤其是溫度和pH[4-5]。雙乙酸鈉(sodium diacetate,SDA)作為一種新型的高效低毒防霉、防腐劑和保鮮劑,具有安全、無(wú)殘留、無(wú)致癌、無(wú)致畸變等優(yōu)點(diǎn),是山梨酸鉀、苯甲酸鈉、丙酸鈣等防腐劑的理想替代產(chǎn)品,其在美國(guó)、德國(guó)、日本等發(fā)達(dá)國(guó)家已得到普遍使用[6-8],目前在我國(guó)豆制品、肉制品、水產(chǎn)品、調(diào)味品等領(lǐng)域也有廣泛應(yīng)用[9-12]。但是,實(shí)際應(yīng)用中的食品基質(zhì)和食品加工條件對(duì)SDA抑菌活性的影響尚缺乏系統(tǒng)研究。

天然抑菌劑因其來(lái)源廣泛、安全高效等優(yōu)點(diǎn),在食品保鮮、包裝和加工方面有著廣闊的應(yīng)用前景和研究?jī)r(jià)值[13-15]。研究表明杜仲葉(EucommiaulmoidesOliv. leaves)具有多種活性成分(如綠原酸、京尼平苷酸等)及藥理活性,其提取物更是具有廣譜抑菌活性,對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌都有良好的抑制作用[16]。研究杜仲葉提取物對(duì)SDA的抑菌效果是否具有增效作用,對(duì)于減少化學(xué)抑菌劑的使用,拓寬其應(yīng)用范圍具有重要作用。

鑒于此,本試驗(yàn)以SDA為研究對(duì)象,通過(guò)動(dòng)力學(xué)方程擬合細(xì)菌生長(zhǎng)曲線,以細(xì)菌生長(zhǎng)的遲緩期λ和最大比生長(zhǎng)速率μmax為考查指標(biāo),研究其在不同食品基質(zhì)和加工條件等外界因素干擾下,對(duì)沙門氏菌、金黃色葡萄球菌的抑制效果及探討其影響規(guī)律,并采用棋盤法評(píng)價(jià)其與杜仲葉提取物的聯(lián)合抑菌效果,為進(jìn)一步開發(fā)以SDA為主的綠色食品添加劑提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

沙門氏菌SalmonellatyphimuriumATCC 14028、金黃色葡萄球菌StaphylococcusaureusATCC 25923 中國(guó)廣州分析測(cè)試中心微生物實(shí)驗(yàn)室提供;營(yíng)養(yǎng)瓊脂、腦-心浸出液肉湯(BHI)、水解酪蛋白胨(MH)肉湯、牛肉浸粉(總氮12%,氨基氮2.5%) 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;雙乙酸鈉、可溶性淀粉 上海麥克林生化科技有限公司;杜仲葉提取物 參考課題組前期最優(yōu)工藝制備,測(cè)得總多酚含量14.49%[16]。

BHC-1200-11-A2型生物安全柜 蘇州市華宇凈化設(shè)備有限公司;HVE-50型高壓滅菌鍋 日本HIRAYMA公司;SHP-150型生化培養(yǎng)箱 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;SHA-CA型恒溫水浴振蕩器 上海汗諾儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 SDA抑菌實(shí)驗(yàn)

1.2.1.1 培養(yǎng)基的制備 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基:稱取營(yíng)養(yǎng)瓊脂33 g,加入去離子水1 L,攪拌加熱煮沸至完全溶解,分裝三角瓶。BHI液體培養(yǎng)基:稱取腦-心浸出液肉湯(BHI)37 g,加入去離子水1 L,攪拌加熱煮沸至完全溶解,分裝試管。MH液體培養(yǎng)基:稱取水解酪蛋白胨(MH)肉湯21 g,加入去離子水1 L,攪拌加熱煮沸至完全溶解,分裝試管。將配制好的培養(yǎng)基,于121 ℃高壓滅菌15 min。

1.2.1.2 菌懸液的制備 在無(wú)菌條件下,將供試菌種接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上,37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。分別挑取一環(huán)已活化的菌置于10 mL滅菌液體培養(yǎng)基內(nèi),37 ℃搖床培養(yǎng)24 h制成菌懸液后測(cè)定其細(xì)菌濃度,并調(diào)整其菌液濃度為106～107CFU/mL,現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.1.3 最低抑菌濃度(MIC)的測(cè)定 配制56 mg/mL SDA溶液。往第1～11號(hào)試管中加入2 mL MH液體培養(yǎng)基后,再往1號(hào)試管再加入2 mL SDA樣品母液,混合均勻。從1號(hào)試管中移取2 mL樣品稀釋液至第2管,以此類推,直至11管,從11管中吸2 mL棄去，再分別往1～11號(hào)試管中加入2 mL濃度為106～107CFU/mL的菌懸液,12號(hào)試管中加入無(wú)菌液體培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照。由此可得濃度為28.00、14.00、7.00、3.50、1.75、8.75×10-1、4.38×10-1、2.19×10-1、1.10×10-1、5.47×10-2、2.74×10-2mg/mL的樣品稀釋溶液。將上述配好的溶液放置恒溫培養(yǎng)箱內(nèi),37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。若觀察到試管中幾乎無(wú)渾濁現(xiàn)象,則其對(duì)應(yīng)的樣品濃度為此樣品的MIC值。每個(gè)樣品做3個(gè)平行測(cè)試。

1.2.2 不同食品基質(zhì)對(duì)SDA抑菌活性的影響

1.2.2.1 蛋白質(zhì)對(duì)SDA抑菌活性的影響 參照Gutierrez等[3]方法并稍作修改。將不同質(zhì)量的牛肉浸粉加入到MH培養(yǎng)基中,配成低、中、高濃度牛肉湯培養(yǎng)基(W/W),其中1%為低濃度、3%和5%為中濃度,10%為高濃度。分別取0.50 mL SDA溶液到1.50 mL不同濃度的牛肉湯培養(yǎng)基中,使得試管中的SDA溶液的最終濃度為1/2MIC,最后加入2 mL濃度約為106～107CFU/mL的菌懸液,混勻后于37 ℃恒溫條件下培養(yǎng)36 h。不添加SDA作為陽(yáng)性對(duì)照,添加SDA而不添加菌懸液作為陰性對(duì)照。每2 h用酶標(biāo)儀在600 nm下測(cè)定吸光度,計(jì)算細(xì)菌個(gè)數(shù),并用Modified Gompertz生長(zhǎng)模型進(jìn)行S形曲線擬合,計(jì)算遲緩期λ和最大比生長(zhǎng)速率μmax。試驗(yàn)重復(fù)1次,每次處理3個(gè)平行。

1.2.2.2 蛋白質(zhì)對(duì)SDA MIC的影響 參照1.2.1.3方法并稍作修改。配制56 mg/mL SDA溶液。將不同質(zhì)量的牛肉浸粉加入到MH培養(yǎng)基中,配成低、中、高濃度牛肉湯培養(yǎng)基(W/W),其中低濃度為1%、中濃度為3%和5%,高濃度為10%。后續(xù)試驗(yàn)步驟按1.2.1.3進(jìn)行。

表1 沙門氏菌棋盤法示意表Table 1 Schematic diagram of checkerboard method for Salmonella typhimurium

表2 金黃色葡萄球菌棋盤法示意表Table 2 Schematic diagram of checkerboard method for Staphylococcus aureus

1.2.2.3 碳水化合物對(duì)SDA抑菌活性的影響 參照1.2.2.1方法并稍作修改。將不同質(zhì)量的可溶性淀粉加入到MH培養(yǎng)基中,配成低、中、高濃度淀粉培養(yǎng)基(W/W),其中低濃度為1%、中濃度為3%和5%,高濃度為7%。分別取0.50 mL SDA溶液到1.50 mL不同濃度的淀粉培養(yǎng)基中,最后加入2 mL稀釋后的菌懸液,混勻后于37 ℃恒溫條件下培養(yǎng)36 h,后續(xù)檢測(cè)方法同1.2.2.1。

1.2.2.4 碳水化合物對(duì)SDA MIC的影響 配制56 mg/mL SDA溶液。將不同質(zhì)量的可溶性淀粉加入到MH培養(yǎng)基中,配成低、中、高濃度淀粉培養(yǎng)基(W/W),其中低濃度為1%、中濃度為3%和5%,高濃度為7%。后續(xù)試驗(yàn)步驟按1.2.1.3進(jìn)行。

1.2.3 不同加工條件對(duì)SDA抑菌活性的影響

1.2.3.1 溫度對(duì)SDA抑菌活性的影響 研究室溫、巴氏殺菌、高溫和超高溫處理對(duì)SDA抑菌活性的變化。將SDA分別放入60、73、121、138 ℃烘箱中,過(guò)夜烘干直至恒重,備用。SDA放在室溫(25 ℃)作為對(duì)照。參照1.2.2.1方法并稍作修改。分別取不同溫度處理后的SDA溶液0.50 mL加到1.50 mL MH培養(yǎng)基中,最后加入2 mL稀釋后的菌懸液,混勻后于37 ℃恒溫條件下培養(yǎng)36 h,后續(xù)檢測(cè)方法同1.2.2.1。

1.2.3.2 溫度對(duì)SDA MIC的影響 配制經(jīng)不同溫度處理后的SDA溶液,濃度為56 mg/mL。后續(xù)試驗(yàn)步驟同1.2.1.3保持不變。

1.2.3.3 pH對(duì)SDA抑菌活性的影響 用1 mol/L的HCl和NaOH溶液調(diào)節(jié)MH培養(yǎng)基pH為4.50、5.50、6.50、7.50(原MH培養(yǎng)基的pH為7.50,1.2.3.4同)、8.50。參照1.2.2.1方法,取0.50 mL SDA溶液加到1.50 mL不同pH的MH培養(yǎng)基中,最后加入2 mL用不同pH的MH培養(yǎng)基稀釋后的菌懸液,混勻后于37 ℃恒溫條件下培養(yǎng)36 h,后續(xù)檢測(cè)方法同1.2.2.1。

1.2.3.4 pH對(duì)SDA MIC的影響 配制56 mg/mL SDA溶液。用1 mol/L的HCl和NaOH溶液調(diào)節(jié)MH培養(yǎng)基pH為4.50、5.50、6.50、7.50、8.50。其余試驗(yàn)步驟同1.2.1.3保持不變。

1.2.4 杜仲葉提取物聯(lián)合SDA抑菌作用的測(cè)定與評(píng)價(jià) 采用1.2.1.3方法分別測(cè)定EULE對(duì)沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的MIC值,并稍作修改。棋盤法評(píng)價(jià)SDA和EULE的聯(lián)合抑菌效果,按Schelz等[17]方法并稍作修改。根據(jù)上述MIC值配制一定濃度的SDA和EULE溶液(濃度為各細(xì)菌MIC的4倍),用MH培養(yǎng)基稀釋各溶液成所需的工作液(4～1/16 MIC)。取49根試管按7×7依次排好后,分別取2 mL工作液按濃度從高到低依次加入到試管中,最后再加入2 mL稀釋后的菌懸液(各組試管中細(xì)菌終濃度約為106～107CFU/mL),混勻后于37 ℃恒溫條件下培養(yǎng)24 h,試管中幾乎無(wú)渾濁現(xiàn)象所對(duì)應(yīng)的樣品濃度作為該樣品的MIC值。由此可得沙門氏菌棋盤法中的SDA終濃度為14.00、7.00、3.50、1.75、0.875、0.438、0.219 mg/mL,EULE終濃度為1.40、0.700、0.350、0.175、0.0875、0.0438、0.0219 mg/mL,如表1所示。金黃色葡萄球菌棋盤法中的SDA終濃度為14.0、7.00、3.50、1.75、0.875、0.438、0.219 mg/mL,EULE終濃度為0.700、0.350、0.175、0.0875、0.0438、0.0219、0.0110 mg/mL,如表2所示。每個(gè)樣品做3個(gè)平行測(cè)試。

分級(jí)抑菌濃度指數(shù)(fractional inhibitory concentration index,FICI)計(jì)算公式為FICI=MIC(EULE+SDA聯(lián)合)/MIC(SDA單獨(dú))+MIC(EULE+SDA聯(lián)合)/MIC(EULE單獨(dú))。聯(lián)合作用效果評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)Odds的建議[18]:FICI≤0.5為協(xié)同作用,0.5≤FICI≤1為相加作用,14為拮抗作用。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 SDA最低抑菌濃度(MIC)的測(cè)定

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果得知,SDA對(duì)沙門氏菌的MIC值為7.00 mg/mL,對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC值為7.00 mg/mL。

2.2 不同食品基質(zhì)對(duì)SDA抑菌活性的影響

2.2.1 蛋白質(zhì)對(duì)SDA抑菌活性的影響 沙門氏菌和金黃色葡萄球菌在MH培養(yǎng)基(牛肉浸粉濃度為0%)和不同濃度牛肉湯培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況,結(jié)果如圖1和圖2。隨著牛肉浸粉濃度的升高,陽(yáng)性對(duì)照組中沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的最大比生長(zhǎng)速率顯著大于MH培養(yǎng)基(P<0.05)。當(dāng)牛肉浸粉濃度為10%時(shí),其遲緩期顯著長(zhǎng)于MH培養(yǎng)基(P<0.05),而低濃度下的遲緩期和MH培養(yǎng)基無(wú)差異?？傮w而言,牛肉湯培養(yǎng)基同MH培養(yǎng)基一樣,適合細(xì)菌的培養(yǎng)。

如圖1所示,樣品組中沙門氏菌的遲緩期隨牛肉浸粉濃度的升高呈上升趨勢(shì),且比相同濃度的陽(yáng)性對(duì)照組的時(shí)間長(zhǎng);不同濃度牛肉湯培養(yǎng)基中沙門氏菌的最大比生長(zhǎng)速率和MH培養(yǎng)基無(wú)差異(P>0.05),但顯著低于相同濃度的陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.05)。由圖2可知,金黃色葡萄球菌的遲緩期與沙門氏菌的遲緩期變化趨勢(shì)一致。而在牛肉浸粉質(zhì)量濃度增加時(shí)，金黃色葡萄球菌的最大比生長(zhǎng)速率顯著增大(P<0.05)。而當(dāng)濃度上升至10%時(shí),其最大比生長(zhǎng)速率比相同濃度的陽(yáng)性對(duì)照組。表明在此濃度蛋白質(zhì)的作用下,SDA的抑菌活性可能被減弱。

圖1 沙門氏菌在不同牛肉湯培養(yǎng)基中(SDA)的 遲緩期(A)和最大比生長(zhǎng)速率(B)Fig.1 Lag phase(A)and maximum specific growth rate(B)of Salmonella typhimurium in different beef extract media containing SDA注:圖中相同小寫字母或無(wú)字母表示處理組 差異不顯著(P>0.05),不同小寫字母表示 差異顯著(P<0.05)；圖2～8同。

圖2 金黃色葡萄球菌在不同牛肉湯培養(yǎng)基中(SDA)的 遲緩期(A)和最大比生長(zhǎng)速率(B)Fig.2 Lag phase(A)and maximum specific growth rate(B)of Staphylococcus aureus in different beef extract media containing SDA

2.2.2 蛋白質(zhì)對(duì)SDA MIC的影響 由表3可知,當(dāng)牛肉浸粉濃度為1%、3%和5%時(shí),SDA的MIC值與牛肉浸粉濃度為0時(shí)一致;當(dāng)濃度為10%時(shí),SDA的MIC值升高。由此可見,高濃度蛋白質(zhì)(10%牛肉浸粉)對(duì)SDA的抑菌效果產(chǎn)生負(fù)面影響。

表3 不同牛肉湯培養(yǎng)基對(duì)SDA MIC的影響 Table 3 Effect of different beef extract media on SDA MIC

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在高濃度蛋白質(zhì)培養(yǎng)基中,SDA可顯著延長(zhǎng)沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的遲緩期,但也增大金黃色葡萄球菌的最大比生長(zhǎng)速率和這兩種致病菌的MIC值。說(shuō)明高濃度蛋白質(zhì)可使SDA的抑菌活性減弱。Gutierrez等[3]研究表明,某些天然抑菌物質(zhì)如牛至和百里香也有類似效果,其原因可能是過(guò)量的蛋白質(zhì)相比于成品培養(yǎng)基中半合成的蛋白胨更難被細(xì)菌所利用。此外,前期研究表明,蛋白質(zhì)對(duì)微生物具有緩沖作用,且基質(zhì)中的蛋白質(zhì)是微生物生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)成分,豐富的營(yíng)養(yǎng)會(huì)加速微生物的自我修復(fù)。Smith-Palmer等[19]以及Devlieghere等[2]研究發(fā)現(xiàn),蛋白質(zhì)可促進(jìn)細(xì)菌的生長(zhǎng),減弱活性成分的抑菌作用。因此,在高蛋白食品中應(yīng)盡可能避免添加SDA為食品添加劑。

2.2.3 碳水化合物對(duì)SDA抑菌活性的影響 沙門氏菌和金黃色葡萄球菌在MH培養(yǎng)基(可溶性淀粉濃度為0%)和不同濃度淀粉培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況,結(jié)果如圖3和圖4。不同濃度淀粉培養(yǎng)基與MH培養(yǎng)基相比,陽(yáng)性對(duì)照組中的沙門氏菌通過(guò)縮短遲緩期或增大最大比生長(zhǎng)速率的方式來(lái)促進(jìn)生長(zhǎng);而陽(yáng)性對(duì)照組中的金黃色葡萄球菌在1%和3%碳水化合物濃度下的生長(zhǎng)與0%時(shí)無(wú)差異,在5%和7%濃度下則是通過(guò)延長(zhǎng)遲緩期和增大最大比生長(zhǎng)速率的方式來(lái)促進(jìn)生長(zhǎng)?？傮w而言,相對(duì)于MH培養(yǎng)基,這兩種細(xì)菌在淀粉培養(yǎng)基中可以很好生長(zhǎng)。

圖3 沙門氏菌在不同淀粉培養(yǎng)基中(SDA)的 遲緩期(A)和最大比生長(zhǎng)速率(B)Fig.3 Lag phase(A)and maximum specific growth rate(B)of Salmonella typhimurium in different starch media containing SDA

圖4 金黃色葡萄球菌在不同淀粉培養(yǎng)基中(SDA)的 遲緩期(A)和最大比生長(zhǎng)速率(B)Fig.4 Lag phase(A)and maximum specific growth rate(B)of Staphylococcus aureus in different starch media containing SDA

樣品組中沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的遲緩期變化趨勢(shì)基本一致,隨可溶性淀粉濃度的升高先縮短后延長(zhǎng),且在濃度為7%時(shí)的遲緩期顯著長(zhǎng)于MH培養(yǎng)基(P<0.05)。在不同濃度淀粉培養(yǎng)基中,各樣品組的遲緩期顯著長(zhǎng)于相同濃度的陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.05)(圖3A和圖4A)。同樣,沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的最大比生長(zhǎng)速率變化趨勢(shì)一致,其中在高濃度(5%和7%)下顯著大于MH培養(yǎng)基(P<0.05),且各樣品組的最大比生長(zhǎng)速率比相同濃度的陽(yáng)性對(duì)照組的小(圖3B和圖4B)。表明在淀粉培養(yǎng)基中,SDA對(duì)沙門氏菌生長(zhǎng)和金黃色葡萄球菌的抑制作用依舊較為顯著,但高濃度碳水化合物(7%可溶性淀粉)可能使SDA的抑菌活性減弱。

2.2.4 碳水化合物對(duì)SDA MIC的影響 由表4可知,當(dāng)可溶性淀粉濃度為0、1%、3%和5%時(shí),SDA對(duì)沙門氏菌的MIC無(wú)差異,而當(dāng)濃度為7%時(shí),SDA的MIC值升高。在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi),SDA對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC并無(wú)差異。由此可見,高濃度碳水化合物(7%可溶性淀粉)可升高SDA對(duì)沙門氏菌的MIC值,對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC卻無(wú)影響。Gutierrez等[3]研究發(fā)現(xiàn),適當(dāng)濃度的碳水化合物對(duì)細(xì)菌起保護(hù)作用,當(dāng)培養(yǎng)基中淀粉濃度在5%或10%時(shí),可減弱牛至和百里香的抑菌活性。Devlieghere等[2]報(bào)道了碳水化合物對(duì)細(xì)菌的保護(hù)作用,30%的淀粉可減弱殼聚糖的抑菌活性。Ofman等[20]也表明木薯淀粉可減弱防腐劑的抗菌效果,但Shelef等[21]研究結(jié)果卻表明,高濃度碳水化合物(5.80%或11.6%)對(duì)精油的抑菌效果無(wú)影響。因此,在高碳水化合物食品中應(yīng)盡可能避免添加SDA為食品添加劑。

2.3 不同加工條件對(duì)SDA抑菌活性的影響

2.3.1 溫度對(duì)SDA抑菌活性的影響 研究室溫、60、73、121、138 ℃五種溫度處理后的SDA對(duì)沙門氏菌和金黃色葡萄球菌抑菌活性的影響,結(jié)果如圖5和圖6。與室溫相比,樣品組中沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的遲緩期隨溫度的升高逐漸縮短,最大比生長(zhǎng)速率逐漸增大。表明溫度越高,SDA的抑菌活性越弱。當(dāng)溫度為60 ℃時(shí),沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的遲緩期和最大比生長(zhǎng)速率與室溫相比無(wú)明顯差異，表明SDA在此條件下仍具有一定的抑菌活性,當(dāng)溫度為138 ℃時(shí),金黃色葡萄球菌的遲緩期與陽(yáng)性對(duì)照組無(wú)差異,最大比生長(zhǎng)速率比陽(yáng)性對(duì)照組的大(P<0.05)。表明SDA對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性可能完全喪失。

圖5 在不同處理溫度的SDA抑制下, 沙門氏菌的遲緩期(A)和最大比生長(zhǎng)速率(B)Fig.5 Lag phase(A)and maximum specific growth rate(B)of Salmonella typhimurium in MH media containing SDA at different treatment temperatures

圖6 在不同處理溫度的SDA抑制下, 金黃色葡萄球菌的遲緩期(A)和最大比生長(zhǎng)速率(B)Fig.6 Lag phase(A)and maximum specific growth rate(B)of Staphylococcus aureus in MH media containing SDA at different treatment temperatures

2.3.2 溫度對(duì)SDA MIC的影響 由表5可知,當(dāng)溫度為室溫、60和73 ℃時(shí),SDA對(duì)沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的MIC值沒有顯著差別。當(dāng)溫度上升至121和138 ℃時(shí),其MIC值隨之升高。

表5 不同處理溫度對(duì)SDA的 MIC的影響Table 5 Effect of different treatment temperatures on SDA MIC

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,隨著溫度的升高,SDA對(duì)沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的抑菌活性逐漸減弱。當(dāng)溫度為121和138 ℃時(shí),沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的MIC增大。推測(cè)可能是因?yàn)殡p乙酸鈉在高溫下受熱分解,其抑菌效果也隨之減弱。因此,在以SDA為食品添加劑時(shí),不宜將其置于高溫條件下進(jìn)行加工。

2.3.3 pH對(duì)SDA抑菌活性的影響 沙門氏菌和金黃色葡萄球菌在不同pH環(huán)境下的生長(zhǎng)情況,結(jié)果如圖7和圖8。陽(yáng)性對(duì)照組中沙門氏菌和金黃色葡萄球菌能夠在不同pH的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。當(dāng)實(shí)驗(yàn)組中pH為4.5、5.5和6.5時(shí),未檢測(cè)到遲緩期和最大比生長(zhǎng)速率,表明沙門氏菌和金黃色葡萄球菌可能生長(zhǎng)停止。說(shuō)明在酸性環(huán)境下,SDA的抑菌活性增強(qiáng)。與pH為7.5相比,沙門氏菌和金黃色葡萄球菌在pH為8.5時(shí)的遲緩期顯著縮短,最大比生長(zhǎng)速率顯著增大(P<0.05)。表明此pH條件下,SDA的抑菌活性減弱。

圖7 不同pH培養(yǎng)基中(SDA)沙門氏菌的 遲緩期(A)和最大比生長(zhǎng)速率(B)Fig.7 Lag phase(A)and maximum specific growth rate(B)of Salmonella typhimurium in different pH media containing SDA

圖8 不同pH培養(yǎng)基中(SDA)金黃色葡萄球菌的 遲緩期(A)和最大比生長(zhǎng)速率(B)Fig.8 Lag phase(A)and maximum specific growth rate(B)of Staphylococcus aureus in different pH media containing SDA

2.3.4 pH對(duì)SDA MIC的影響 由表6可知,與pH為7.5的MIC值相比,pH為4.5、5.5和6.5的SDA MIC值減小,pH為8.5的SDA MIC值增大。表明在酸性環(huán)境下,SDA的抑菌活性增強(qiáng);在堿性環(huán)境下,SDA的抑菌活性減弱。

表6 不同pH培養(yǎng)基對(duì)SDA MIC的影響Table 6 Effect of different pH media on SDA MIC

本實(shí)驗(yàn)中,培養(yǎng)基中pH會(huì)對(duì)SDA的抑菌作用產(chǎn)生影響。在酸性環(huán)境下,SDA對(duì)沙門氏菌、金黃色葡萄球菌的抑制作用增強(qiáng);而當(dāng)培養(yǎng)基的pH為8.5時(shí),其對(duì)細(xì)菌的抑制作用減弱。SDA的抑菌作用來(lái)源于乙酸,其含有可釋放的游離乙酸分子,在水溶液中呈酸性,釋放出的乙酸能滲入菌體組織的細(xì)胞壁,干擾細(xì)胞內(nèi)各種酶的體系而產(chǎn)生作用,使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)變性、抑制微生物生長(zhǎng)繁殖,從而起到抗菌作用[22-23],而在堿性環(huán)境下,其能與乙酸分子發(fā)生酸堿中和,從而減弱其抗菌作用。Campo等[24]和Hsieh等[25]研究發(fā)現(xiàn),精油的抗菌活性隨pH的降低而增加。

2.4 杜仲葉提取物聯(lián)合SDA抑菌作用的測(cè)定與評(píng)價(jià)

表7 EULE的MIC值和其與SDA聯(lián)合抑菌的FICI值Table 7 MIC vaules of EULE and FICI values of EULE+SDA combinations in MH media

由表7可知,杜仲葉提取物對(duì)沙門氏菌的MIC值為0.700 mg/mL,對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC值為0.350 mg/mL。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的FICI為1,說(shuō)明杜仲葉提取物和雙乙酸鈉聯(lián)合使用時(shí)表現(xiàn)為相加作用,能夠部分替代SDA。

3 結(jié)論

食品基質(zhì)(蛋白質(zhì)和碳水化合物)和食品加工條件(溫度和pH)能影響SDA對(duì)沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的抑制效果。高濃度蛋白質(zhì)(10%牛肉浸粉),高濃度碳水化合物(7%可溶性淀粉),高溫處理(121和138 ℃)和堿性環(huán)境(pH8.5)可減弱SDA對(duì)沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的抑菌活性,增大其MIC值,而酸性環(huán)境(pH為4.5、5.5和6.5)增強(qiáng)SDA的抑菌活性。SDA與EULE聯(lián)用對(duì)抑菌效果有相加作用,該結(jié)果表明EULE可作為天然抑菌劑與SDA聯(lián)合使用,并一定程度可起到替代作用,將擴(kuò)寬其在食品領(lǐng)域的應(yīng)用范圍。