柚皮素對甲狀腺癌細胞凋亡、自噬的影響及其與AMPK/mTORC1通路的關系

張增嶺，施杲旸，朱乃海，陳濤

（1.江蘇省人民醫(yī)院浦口分院 普通外科，江蘇 南京 211899；2.江蘇省人民醫(yī)院 普通外科，江蘇 南京 210029）

甲狀腺癌是全世界最普遍的內(nèi)分泌實體瘤類型之一，其發(fā)病率呈逐年增加趨勢[1-2]。在大多數(shù)患者中，手術后進行放射性碘或觀察治療是有效的，但是其他罕見的甲狀腺癌亞型患者的靶向治療只能延長生存期，因此迫切需要尋找新型有效的治愈性藥物用于甲狀腺癌的臨床治療[3]。柚皮素（naringenin，NAR）是從柑橘類植物中提取得到的黃酮類化合物，具有抗炎、抗病毒和抗腫瘤等作用[4-5]。在急性白血病HL-60細胞中，NAR能夠激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）誘導細胞自噬和凋亡[6]。此外，AMPK/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物1（mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1）信號通路在調(diào)控細胞自噬和凋亡過程中至關重要[7-8]，但NAR對甲狀腺癌細胞增殖、凋亡和自噬的影響及其作用機制是否與AMPK/mTORC1途徑相關尚不清楚。本實驗旨在探索NAR對甲狀腺癌細胞凋亡和自噬的影響，并初步探索其作用機制，以期為將NAR應用于甲狀腺癌的臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗細胞甲狀腺癌細胞株ACT-1 購自上海冠導生物工程有限公司，批號GD-C521997。

1.1.2 主要試劑和儀器AMPK 抑制劑（compound C）（杭州昊鑫生物科技股份有限公司，批號HY13418-1）；DMEM 培養(yǎng)基、噻唑藍（MTT）試劑、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/ 碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）細胞凋亡檢測試劑盒、RIPA 裂解液、ECL 發(fā)光液（北京Solarbio 公司，批號分別為11995、M8180、CA1020、R0010、PE0010）；綠色熒光蛋白-微管相關蛋白1 輕鏈3（GFP-LC3）質(zhì)粒試劑盒（上海遠慕生物科技有限公司，批號AT-V192）；兔抗人AMPK、磷酸化AMPK（p-AMPK）、核孔蛋白（p62）、微管相關蛋白1 輕鏈3（LC3）I、LC3II、mTORC1、磷酸化mTORC1（p-mTORC1）、半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）單克隆抗體、山羊抗人IgG 二抗（美國Thermo Fisher Scientific 公司，批號分別為MA5-32122、PA5-104982、PA1-16777、PA5-27357、PA5-27247、PA3-10054、PA3-11775、PA2-30472、A109226、A32731）；CO2細胞培養(yǎng)箱（上海Heal Force 公司，型號HF160W）；酶標儀、凝膠成像儀（美國Bio-Rad 公司，型號ELX081U、Gel DocTMXR+）；流式細胞儀（美國貝克曼公司，型號CytoFLEX）；熒光顯微鏡（德國蔡司公司，型號Axioplan 2 imaging E）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)將ACT-1 細胞用含有10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，每2 天更換1 次培養(yǎng)液，待細胞融合度達80% 左右，胰酶消化傳代，收集細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2 MTT 實驗將ACT-1 細胞鋪于96 孔板（密度4.5×104個/ 孔），用濃度為0、6.25、12.50、25.00、50.00、100.00 μg/mL 的NAR 處理12、24、48 h，每個濃度設置6 個復孔，每孔加入100 μLMTT，孵育4 h，加入二甲基亞砜（100 μL/ 孔）充分溶解，同時設置空白組（含有培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜），使用酶標儀測量490 nm 處的OD 值，計算細胞存活率以及半數(shù)抑制率IC50值。然后根據(jù)IC50值，將實驗分為對照組、NAR 低、中、高濃度組，分別使用含有NAR 濃度為0、25、50、100 μg/mL[9]的無血清DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 后，用于后續(xù)實驗。細胞存活率（%）=（實驗組OD 值-空白組OD 值）/（對照組OD 值-空白組OD 值）×100%。

1.2.3 Annexin VP-FITC/PI 實驗調(diào)整ACT-1細胞密度為1.2×106個/孔，鋪于6 孔板，按1.2.2中分組及干預方法處理后，將各組細胞在無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，進行Annexin V-FITC 和PI 染色，于流式細胞儀上檢測各組凋亡情況。

1.2.4 GFP-LC3 轉(zhuǎn)染檢測自噬小體根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑盒說明書步驟轉(zhuǎn)染GFP-LC3 質(zhì)粒至細胞中，更換培養(yǎng)基孵育24 h，參照1.2.2 中分組及干預方法處理各組細胞24 h，熒光顯微鏡下觀察細胞自噬活性情況（綠色點狀聚集為自噬小體）。

1.2.5 Western blot 實驗向?qū)φ战M、3 個NAR濃度組細胞中加入RIPA 裂解液，提取總蛋白，并采用BCA 法測量蛋白含量。取25 μg 蛋白，經(jīng)凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、清洗后，加入一抗LC3I、LC3II、p62、p-AMPK、AMPK、p-mTORC1、mTORC1 和GAPDH（均為1:1000），孵育過夜，加入二抗（1:5000），曝光顯影，分析條帶。

1.2.6 AMPK 抑制劑干預實驗將ACT-1 細胞隨機分為空白對照組、NAR 組、AMPK 抑制劑組和NAR+AMPK 抑制劑組，分別用無血清培養(yǎng)基、100 μg/mLNAR 無血清培養(yǎng)基稀釋液、25 μmol/LAMPK 抑制劑無血清培養(yǎng)基、100 μg/mLNAR+25 μmol/LAMPK 無血清培養(yǎng)基干預24 h。采用1.2.5 中方法檢測各組細胞LC3I、LC3II、p62、caspase-3、p-AMPK、AMPK、p-mTORC1、mTORC1 和GAPDH 蛋白表達情況。

1.3 統(tǒng)計學處理

用統(tǒng)計學軟件SPSS22.0分析實驗數(shù)據(jù)，計量資料以平均數(shù)±標準差（±s）描述，多組間比較使用單因素方差分析，進一步兩組間比較行SNK-q檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 NAR 對ACT-1 細胞存活率的影響

用NAR處理后的ACT-1細胞存活率隨濃度增加呈下降趨勢，同時隨NAR作用時間的延長，ACT-1細胞存活率逐漸下降（均P<0.05）（圖1）。經(jīng)軟件分析算得NAR處理ACT-1細胞12、24、48 h的IC50值分別為85.65、50.12、38.94 μg/mL。后續(xù)實驗選擇NAR干預時間為24 h，藥物濃度為25、50、100 μg/mL。

圖1 NAR 對ACT-1 細胞存活率的影響Figure 1 The effects of NAR on the survival rate of ACT-1 cells

2.2 NAR 對ACT-1 細胞凋亡的影響

與對照組相比，3個濃度的NAR處理組ACT-1細胞凋亡率均明顯增加，且呈濃度依賴性（均P<0.05）（圖2）。

圖2 NAR 對ACT-1 細胞凋亡的影響Figure 2 Effect of NAR on the apoptosis of ACT-1 cells

2.3 NAR 對ACT-1 細胞自噬的影響

轉(zhuǎn)染GFP-LC3質(zhì)粒后，與對照組相比，ACT-1細胞株經(jīng)不同濃度NAR作用后，各組細胞內(nèi)均出現(xiàn)自噬小體，且自噬小體數(shù)量隨濃度增加呈逐漸增加趨勢（圖3）。

圖3 NAR 對ACT-1 細胞自噬的影響（綠色熒光代表自噬小體）（×1000）Figure 3 Effect of NAR on autophagy of ACT-1 cells(green fluorescence showing hte autophagosomes)(×1000)

2.4 NAR 對自噬相關蛋白LC3II、LC3I 和p62蛋白表達的影響

與對照組比較，3個NAR處理組ACT-1細胞LC3II/LC3I蛋白表達水平均明顯升高，而p62蛋白表達水平均明顯降低，均呈濃度依賴性（均P<0.05）（圖4）。

圖4 各組ACT-1 細胞LC3II/LC3I 和p62 蛋白表達情況Figure 4 The expressions of LC3II/LC3I and p62 protein in each group of ACT-1 cells

2.5 NAR 對ACT-1 細 胞p-AMPK、AMPK、p-mTORC1 和mTORC1 蛋白表達的影響

與對照組比較，3個NAR處理組ACT-1細胞p-AMPK/AMPK 蛋白表達水平均明顯升高，而p-mTORC1/mTORC1蛋白表達水平均明顯降低，均呈濃度依賴性（均P<0.05）（圖5）。

圖5 各組ACT-1 細胞p-AMPK、AMPK、p-mTORC1 和mTORC1 表達情況Figure 5 Expressions of p-AMPK,AMPK,p-mTORC1 and mTORC1 in each group of ACT-1 cells

2.6 NAR 與AMPK 抑制劑共處理對各組細胞凋亡和自噬蛋白的影響

與空白對照組比較，NAR組p-AMPK/AMPK、LC3II/LC3I、caspase-3 蛋白表達明顯升高，p-mTORC1/mTORC1和p 62 蛋白表達明顯降低（均P<0.05）；AMPK抑制劑組p-AMPK/AMPK、LC3II/LC3I、caspase-3 蛋白表達明顯降低，p-mTORC1/mTORC1和p62蛋白表達明顯升高（均P<0.05）。與NAR組比較，NAR+AMPK抑制劑組p-AMPK/AMPK、LC3II/LC3I、caspase-3蛋白表達明顯降低，p-mTORC1/mTORC1和p62蛋白表達明顯升高（均P<0.05）。與AMPK抑制劑組比較，NAR+AMPK抑制劑組ACT-1細胞p-AMPK/AMPK、LC3II/LC3I、caspase-3蛋白表達明顯升高；p-mTORC1/mTORC1和p62蛋白表達明顯降低（均P<0.05）（圖6）。

圖6 各組ACT-1 細胞p-AMPK/AMPK、p-mTORC1/mTORC1、LC3II/LC3I、p62 和caspase-3 蛋白表達情況Figure 6 Expressions of p-AMPK/AMPK,p-mTORC1/mTORC1,LC3II/LC3I,p62 and caspase-3 in each group of ACT-1 cells

3 討論

目前，手術和外科手術加放射性碘治療（標準治療）甲狀腺癌會產(chǎn)生永久并發(fā)癥，嚴重影響患者的生活質(zhì)量[10]。此外，甲狀腺后遺癥可能在數(shù)年至數(shù)十年隨訪后出現(xiàn)，且它們產(chǎn)生的臨床癥狀可能是惰性或非特異性的，給臨床治療帶來挑戰(zhàn)[11-12]。因此積極探索更有效的治療藥物以代替放射治療可能有助于改善甲狀腺癌的治療現(xiàn)狀。NAR作為一種柚皮苷苷元，由于其廣泛的生物活性，而成為抗腫瘤方面研究的熱點[13]。曾德貴等[14]發(fā)現(xiàn)，NAR能夠抑制人肺鱗癌細胞增殖。本研究結(jié)果顯示，ACT-1細胞經(jīng)不同濃度NAR處理后，細胞存活率呈濃度依賴性下降，提示NAR對甲狀腺癌細胞增殖具有抑制作用。

自噬是一種自降解系統(tǒng)，在癌癥治療過程中，它可以保護癌細胞免受化學療法的侵害，也可以殺死凋亡途徑不活躍的癌細胞[15]。此外，藥物和饑餓等因素干預能夠改變細胞自噬能力，以維持細胞穩(wěn)態(tài)，參與組織發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)和腫瘤發(fā)生發(fā)展等生理病理過程[16]。LC3I和LC3II是LC3的2種不同表現(xiàn)形式，在自噬形成期間，LC3I可以轉(zhuǎn)化LC3II，因此LC3II含量與自噬膜囊泡數(shù)量呈正相關，通常以LC3II/LC3I比值作為自噬小體標記物來評價自噬的形成[17-18]。p62是細胞自噬的特異性底物，可用于檢測自噬通量，其表達水平與自噬活性成反比[19]。研究[6]顯示，NAR能夠誘導白血病HL-60細胞自噬，抑制白血病的發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)，NAR處理ACT-1細胞后，細胞凋亡率和LC3II/LC3I蛋白顯著增加，p62蛋白顯著降低，提示NAR干預后誘導了LC3I向LC3II轉(zhuǎn)變。熒光顯微鏡下觀察，NAR干預使綠色熒光富集，且綠色熒光強度隨NAR濃度增加而增加，進一步表明NAR能夠促進ACT-1細胞自噬體的形成。

細胞凋亡受細胞內(nèi)外信號調(diào)節(jié)，其特征在于死亡靶細胞形態(tài)、線粒體膜通透性和凋亡小體等形成，該過程可維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，是細胞發(fā)育和程序性死亡的主要機制，在調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展中至關重要[20-21]。近期研究顯示[9,13,22-23]，NAR能夠促進宮頸癌、胃癌、舌鱗癌及肝癌細胞凋亡。本研究用NAR處理ACT-1細胞后經(jīng)流式分析發(fā)現(xiàn)，NAR可誘導細胞發(fā)生凋亡，且隨NAR濃度的增加，凋亡率增加，提示NAR可誘導凋亡的發(fā)生。此外，自噬與凋亡之間存在的平衡過程在細胞存活和死亡中至關重要[24-25]，因此推測NAR可能通過誘導ACT-1細胞自噬，從而促進其凋亡，發(fā)揮對甲狀腺細胞的毒性作用，但其具體作用機制尚不清楚。

AMPK是一種重要的能量因子，可以協(xié)調(diào)細胞代謝途徑，平衡營養(yǎng)供應和能量需求，在控制人類疾病中至關重要[26]。mTOR是細胞生長調(diào)節(jié)劑，能夠形成mTORC1和mTORC2復合物，且由于其在癌癥中被高度激活，成為提高癌癥治療效率的靶標[27]。此外，在胰腺癌細胞中，激活AMPK信號通路，能夠降低mTOR磷酸化水平，誘導細胞自噬，抑制增殖[28]。徐琛瑩等[29]發(fā)現(xiàn)，雌激素受體β能夠通過激活AMPK/mTORC1軸，誘導自噬發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，ACT-1細胞經(jīng)不同濃度NAR作用后，p-AMPK/AMPK蛋白表達顯著升高，p-mTORC1/mTORC1蛋白表達顯著降低，提示NAR可能通過調(diào)節(jié)AMPK/mTORC1信號通路，誘導甲狀腺癌細胞自噬。caspase-3是細胞凋亡的效應蛋白，其受到凋亡刺激后會被激活，因而被稱為“凋亡的執(zhí)行者”[30]。為進一步驗證AMPK/mTORC1信號通路在NAR治療過程中的作用，使用AMPK抑制劑和NAR共同干預甲狀腺癌細胞后發(fā)現(xiàn)，AMPK抑制劑抑制了NAR作用下甲狀腺癌細胞LC3II/LC3I和cleaved caspase-3蛋白表達，并促進p62蛋白表達水平，提示AMPK抑制劑可逆轉(zhuǎn)NAR對甲狀腺癌細胞自噬和凋亡的誘導作用，推測NAR能夠誘導甲狀腺癌細胞自噬和凋亡，可能與調(diào)控AMPK/mTORC1軸相關。

綜上所述，NAR 能夠抑制甲狀腺癌細胞增殖，促進自噬，并誘導細胞凋亡，可能與激活AMPK活化，抑制mTORC1蛋白表達相關，表明NAR在治療甲狀腺癌方面的潛在價值，可能為甲狀腺癌治療提供新思路。但臨床甲狀腺癌的發(fā)生涉及家族遺傳等多方面因素，且具有轉(zhuǎn)移和侵襲性，因此針對NAR對其治療效果及作用機制，仍需聯(lián)合動物模型和臨床試驗進行探索。