東方蜜蜂幼蟲(chóng)封蓋信息素含量及生物合成通路

秦秋紅，何旭江，江武軍，王子龍，曾志將

東方蜜蜂幼蟲(chóng)封蓋信息素含量及生物合成通路

秦秋紅1,2，何旭江1，江武軍3，王子龍1，曾志將1

1江西農(nóng)業(yè)大學(xué)蜜蜂研究所/江西省蜜蜂生物學(xué)與飼養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌 330045；2廣西科技大學(xué)醫(yī)學(xué)部，廣西柳州 545005；3江西省養(yǎng)蜂研究所，南昌 330052

【】在蜜蜂中，甲基棕櫚酸酯（MP）、甲基油酸酯（MO）、甲基亞油酸酯（ML）和甲基亞麻酸酯（MLN）是重要的封蓋信息素成分，它們觸發(fā)成年工蜂對(duì)幼蟲(chóng)的封蓋行為。本研究旨在比較封蓋信息素化學(xué)成分在不同封蓋時(shí)期的東方蜜蜂（）工蜂與雄蜂幼蟲(chóng)體內(nèi)的含量，并分析其在幼蟲(chóng)體內(nèi)的生物合成通路，進(jìn)一步探索蜜蜂幼蟲(chóng)與成年工蜂之間的信息素交流機(jī)制。以中華蜜蜂（）為實(shí)驗(yàn)材料，分別取未封蓋、正在封蓋和已封蓋的工蜂與雄蜂幼蟲(chóng)，利用GC/MS分析技術(shù)，比較4種封蓋信息素成分在不同封蓋時(shí)期的工蜂與雄蜂幼蟲(chóng)體內(nèi)的含量；同時(shí)利用RNA-seq技術(shù)對(duì)不同封蓋時(shí)期的工蜂與雄蜂幼蟲(chóng)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，分析其基因表達(dá)差異，并根據(jù)差異表達(dá)基因KEGG富集分析推測(cè)封蓋信息素的生物合成通路。在工蜂幼蟲(chóng)中，4種封蓋信息素成分在正在封蓋和已封蓋幼蟲(chóng)體內(nèi)的含量均顯著高于未封蓋幼蟲(chóng)，其中MP和MO的含量均隨幼蟲(chóng)日齡增長(zhǎng)而顯著增加，而ML和MLN的含量在正在封蓋和已封蓋幼蟲(chóng)體內(nèi)差異不顯著；在雄蜂幼蟲(chóng)中，4種信息素成分含量均隨日齡增長(zhǎng)而增加，且已封蓋幼蟲(chóng)的信息素含量顯著高于未封蓋和正在封蓋的幼蟲(chóng)。對(duì)工蜂與雄蜂3個(gè)封蓋時(shí)期幼蟲(chóng)的基因表達(dá)量進(jìn)行組間比較分析，分別從3個(gè)比較組中獲得4 299和3 926個(gè)差異表達(dá)基因，并且在差異表達(dá)基因KEGG注釋分析中分別獲得152和130個(gè)KEGG通路。根據(jù)差異表達(dá)基因KEGG富集結(jié)果，推測(cè)出東方蜜蜂工蜂與雄蜂幼蟲(chóng)可能利用乙酰輔酶A合成MP、MO、ML和MLN的生物合成通路以及11個(gè)調(diào)控候選基因，并發(fā)現(xiàn)該生物合成通路與西方蜜蜂相同。東方蜜蜂工蜂幼蟲(chóng)與雄蜂幼蟲(chóng)在被封蠟蓋的關(guān)鍵階段增加了MP、MO、ML和MLN的釋放量，進(jìn)一步驗(yàn)證了它們是與蜜蜂封蓋行為相關(guān)的信息素，并且推測(cè)這些信息素可能是在相關(guān)基因的調(diào)控下由乙酰輔酶A從頭合成，而東方蜜蜂幼蟲(chóng)與西方蜜蜂幼蟲(chóng)可能利用相同的生物合成通路進(jìn)行信息素的生物合成。

東方蜜蜂；封蓋信息素；含量；轉(zhuǎn)錄組；生物合成通路

0 引言

【研究意義】蜜蜂是一種高度社會(huì)化的昆蟲(chóng)，蜂群成員間需要進(jìn)行信息交流來(lái)協(xié)調(diào)個(gè)體活動(dòng)，以確保群體能夠健康生存和持續(xù)繁衍。作為完全依賴(lài)群體的成員，蜜蜂幼蟲(chóng)通過(guò)各種化學(xué)信號(hào)向成年工蜂表明自己的生物狀態(tài)和需求，以便得到必需的喂養(yǎng)和照料[1-4]。從分子水平研究東方蜜蜂（）幼蟲(chóng)封蓋信息素的生物合成通路，進(jìn)一步探索蜜蜂幼蟲(chóng)誘導(dǎo)成年工蜂封蓋幼蟲(chóng)巢房行為的分子機(jī)理，可為深入了解東方蜜蜂信息素交流的內(nèi)在機(jī)制提供新的啟示?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】Le Conte等首次從西方蜜蜂（）雄蜂幼蟲(chóng)中鑒定出10種幼蟲(chóng)酯類(lèi)信息素（the brood ester pheromone，BEP）：甲基棕櫚酸酯（methyl palmitate，MP）、甲基油酸酯（methyl oleate，MO）、甲基亞油酸酯（methyl linoleate，ML）、甲基硬脂酸酯（methyl stearate，MS）、甲基亞麻酸酯（methyl linolenate，MLN）、乙基棕櫚酸酯（ethyl palmitate，EP）、乙基油酸酯（ethyl oleate，EO）、乙基亞油酸酯（ethyl linoleate，EL）、乙基硬脂酸酯（ethyl stearate，ES）和乙基亞麻酸酯（ethyl linolenate，ELN）[5]。近30年來(lái)科研工作者發(fā)現(xiàn)，蜜蜂幼蟲(chóng)信息素中單一或組合的脂肪酸酯能夠引起工蜂不同的行為與發(fā)育變化，這些信息素成分隨著幼蟲(chóng)日齡和性別的不同而發(fā)生變化（工蜂或雄蜂），成年工蜂也相應(yīng)地調(diào)整它們對(duì)幼蟲(chóng)的行為反應(yīng)[1,6-7]。然而目前大多數(shù)的研究?jī)H涉及信息素的化學(xué)成分鑒定和功能描述，對(duì)蜜蜂信息素的合成途徑研究較少。He等研究發(fā)現(xiàn)E--羅勒烯可能是工蜂幼蟲(chóng)的饑餓信息素，并利用RNA-seq技術(shù)分析推測(cè)出E--羅勒烯在工蜂幼蟲(chóng)體內(nèi)通過(guò)乙酰輔酶A和乙酰乙酰輔酶A從頭合成的生物合成通路及其調(diào)控候選基因[8]。進(jìn)一步研究表明，蜜蜂蜂王與雄蜂幼蟲(chóng)通過(guò)同樣的通路在體內(nèi)從頭合成E--羅勒烯作為其饑餓信息素來(lái)乞求食物[9]。蜜蜂是一種變態(tài)發(fā)育的昆蟲(chóng)，其生活史要經(jīng)過(guò)卵、幼蟲(chóng)、蛹和成蟲(chóng)4個(gè)階段。在正常的蜂巢環(huán)境中（巢房溫度約35℃），卵孵化成幼蟲(chóng)并發(fā)育到一定時(shí)期（蜂王幼蟲(chóng)5 d、工蜂幼蟲(chóng)6 d、雄蜂幼蟲(chóng)7 d），成年工蜂就會(huì)從蠟腺分泌蜂蠟對(duì)其巢房進(jìn)行封蓋，以利于幼蟲(chóng)在一個(gè)干凈、穩(wěn)定的封閉環(huán)境中化蛹[10]。Le Conte等研究發(fā)現(xiàn)，蜜蜂幼蟲(chóng)信息素中MP、MO、ML和MLN 4種成分中的單一或混合成分都可以誘導(dǎo)成年工蜂對(duì)幼蟲(chóng)巢房的封蓋行為[11]。Qin等利用RNA-seq技術(shù)分析推測(cè)出西方蜜蜂工蜂與雄蜂幼蟲(chóng)利用乙酰輔酶A合成MP、MO、ML和MLN的生物合成通路以及12個(gè)調(diào)控候選基因，并利用穩(wěn)定同位素示蹤劑證實(shí)了這些封蓋信息素成分是由幼蟲(chóng)合成的，而不是從它們的食物中獲得[12]。蜂螨是危害蜜蜂最嚴(yán)重的寄生性病害之一，導(dǎo)致全球蜜蜂很高的死亡率[13]。研究表明，大蜂螨能利用蜜蜂幼蟲(chóng)信息素找到即將封蓋的工蜂或雄蜂幼蟲(chóng)[5,11]，在幼蟲(chóng)被封蓋前潛入其巢房?jī)?nèi)，吸食幼蟲(chóng)血淋巴，繁殖后代，而蜂螨更偏好于寄生在雄蜂的幼蟲(chóng)巢房?jī)?nèi)[10]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】東方蜜蜂和西方蜜蜂是目前世界上廣泛飼養(yǎng)的兩個(gè)蜂種，它們?cè)谕獠啃螒B(tài)、個(gè)體發(fā)育、生活習(xí)性和學(xué)習(xí)記憶等生物學(xué)特性方面存在較大差異[14-16]。目前對(duì)蜜蜂信息素的研究大多集中在以意大利蜜蜂（）為代表的西方蜜蜂上。雖然近年來(lái)我國(guó)學(xué)者逐漸對(duì)東方蜜蜂信息素展開(kāi)研究[17-18]，獲得了一些東方蜜蜂化學(xué)通訊的知識(shí)，但相對(duì)于西方蜜蜂而言，人們對(duì)東方蜜蜂信息素仍知之甚少，尤其是信息素分子水平層面的研究較為缺乏。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】為了豐富對(duì)東方蜜蜂信息素的了解，分別利用GC/MS技術(shù)和RNA-seq技術(shù)，分析封蓋信息素化學(xué)成分在不同封蓋時(shí)期的東方蜜蜂工蜂與雄蜂幼蟲(chóng)體內(nèi)的含量變化及轉(zhuǎn)錄組差異，驗(yàn)證MP、MO、ML和MLN是與東方蜜蜂封蓋行為相關(guān)的信息素并探究其生物合成分子機(jī)理，進(jìn)一步揭示東方蜜蜂幼蟲(chóng)與成年工蜂之間的信息素交流內(nèi)在機(jī)制。

1 材料與方法

信息素鑒定試驗(yàn)于2017年4—5月在江西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司完成，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析于2017年4—8月在北京百邁客生物科技有限公司完成，熒光定量PCR驗(yàn)證于2018年4—5月在江西農(nóng)業(yè)大學(xué)蜜蜂研究所完成。

1.1 供試?yán)ハx(chóng)

供試樣品均采自中華蜜蜂（）蜂群，由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)蜜蜂研究所（28.46°N，115.49°E）根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的養(yǎng)蜂技術(shù)飼養(yǎng)。

幼蟲(chóng)樣品均分為以下3個(gè)不同封蓋時(shí)期：4日齡未封蓋的工蜂與雄蜂幼蟲(chóng)（4-day-old WL/DL）；正在封蓋的工蜂與雄蜂幼蟲(chóng)（capping WL/DL），即蜂房上的蠟蓋正在被筑建的幼蟲(chóng)；已封蓋的工蜂與雄蜂幼蟲(chóng)（capped WL/DL），樣品取自完全封蓋的蜂房，蠟蓋下有一層薄薄的繭衣，工蜂約8日齡，雄蜂約9日齡。各組幼蟲(chóng)均為從蜂箱中直接取出巢脾新鮮采集，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)分別來(lái)自于群勢(shì)相同的不同健康蜂群。

1.2 氣相色譜-質(zhì)譜（GC/MS）分析

3個(gè)不同封蓋時(shí)期的幼蟲(chóng)樣品數(shù)量分別為4日齡未封蓋的工蜂與雄蜂幼蟲(chóng)各40只，正在封蓋和已封蓋的工蜂幼蟲(chóng)各20只，正在封蓋和已封蓋的雄蜂幼蟲(chóng)各10只，每組樣品進(jìn)行4個(gè)生物學(xué)重復(fù)。將采集的幼蟲(chóng)樣品（未經(jīng)清洗）分別放入裝有3 mL二氯甲烷（分析純，南京化學(xué)試劑股份有限公司）的玻璃瓶中，并添加20 μL甲基十九烷酸酯（≥98%，標(biāo)準(zhǔn)品，10 μg·mL-1，Sigma）作為內(nèi)標(biāo)。隨后，將裝有幼蟲(chóng)的玻璃小瓶放置在水平脫色搖床（ZD-9560，江蘇盛藍(lán)儀器制造有限公司）上輕輕搖晃30 min（120 r/min），最后將上清液轉(zhuǎn)移到干凈的玻璃瓶中并用氮?dú)鉂饪s至約20 μL。分別取1 μL濃縮后的樣品注入氣相色譜-質(zhì)譜（GC/MS）系統(tǒng)（7890A/5975C，Agilent）進(jìn)行檢測(cè)，具體參數(shù)參照Qin等[12]的報(bào)道。

在MP、MO、ML和MLN的基峰重建了單個(gè)離子監(jiān)測(cè)色譜圖，內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)分別為質(zhì)荷比（m/z）270、264、294、292和312。對(duì)于感興趣的化合物，通過(guò)參考每種化合物的校準(zhǔn)曲線(xiàn)，將峰面積轉(zhuǎn)換為數(shù)量。外部標(biāo)準(zhǔn)品為MP、MO、ML和MLN（≥99.5%，Sigma），7個(gè)濃度的外標(biāo)（0.25、0.5、1、2、5、10和25 μg·mL-1）被用來(lái)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。所構(gòu)建的4條標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的相關(guān)系數(shù)均大于99.96%，說(shuō)明GC/MS系統(tǒng)足夠穩(wěn)定[19]，可用于后期對(duì)蜜蜂幼蟲(chóng)MP、MO、ML和MLN的定量分析。

1.3 RNA-seq分析

采集未封蓋、正在封蓋和已封蓋的工蜂與雄蜂幼蟲(chóng)各6只，每組樣品進(jìn)行3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。取樣時(shí)將幼蟲(chóng)放入5 mL EP管中，隨后迅速放入液氮速凍，并于-80℃保存。按標(biāo)準(zhǔn)TRlzol Reagent法提取RNA（Life technologies，California，USA），并使用瓊脂糖凝膠電泳和核酸蛋白分析儀（IMPLEN）對(duì)RNA進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，將檢測(cè)合格的RNA樣品用于cDNA文庫(kù)構(gòu)建。cDNA文庫(kù)的構(gòu)建和測(cè)序由北京百邁客生物科技有限公司完成，具體操作方法參見(jiàn)余愛(ài)麗等[20]的報(bào)道。

對(duì)測(cè)序獲得的18個(gè)樣品的Raw Data進(jìn)行去接頭、去引物序列、過(guò)濾低質(zhì)量Reads等質(zhì)量控制，最終獲得高質(zhì)量Clean Reads。采用中華蜜蜂的全基因組序列（ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCA/002/290/385/GCA_002290385.1_ApisCC1.0/）作為參考基因進(jìn)行比對(duì)。以FPKM（Fragments per Kilobase of transcript per Million fragments mapped）作為衡量指標(biāo)，對(duì)測(cè)序樣品的基因表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。用斯皮爾曼相關(guān)系數(shù)2評(píng)估各組樣品3個(gè)生物學(xué)重復(fù)的相關(guān)性[21]。以fold change≥2且FDR＜0.05作為篩選差異表達(dá)基因（differential expressed gene，DEG）的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)各幼蟲(chóng)樣品組間的基因表達(dá)差異。

為了進(jìn)一步解讀差異表達(dá)基因的功能，探究東方蜜蜂幼蟲(chóng)封蓋信息素的生物合成途徑，利用KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行通路（Pathway）注釋和富集分析。首先將差異表達(dá)基因最長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄本轉(zhuǎn)化為蛋白序列，然后利用BLAST軟件與KEGG蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，界定標(biāo)準(zhǔn)為e＜10-5。為了識(shí)別RNA-seq數(shù)據(jù)中假定的代謝通路富集，使用基于KEGG Orthology的注釋系統(tǒng)2.0（KOBAS 2.0）分析KEGG映射的結(jié)果。KOBAS 2.0將提供的基因數(shù)據(jù)庫(kù)與代謝和信號(hào)通路的多個(gè)現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)照，以識(shí)別RNA-seq樣本中富集的通路[22]。

1.4 差異表達(dá)基因qRT-PCR驗(yàn)證

從本研究的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中推測(cè)出東方蜜蜂工蜂與雄蜂幼蟲(chóng)封蓋信息素的生物合成通路及參與該通路的11個(gè)基因。為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的可靠性，以中華蜜蜂工蜂幼蟲(chóng)為實(shí)驗(yàn)材料，隨機(jī)選取5個(gè)參與該通路的候選基因進(jìn)行qRT-PCR定量分析：（gene- APICC_00421：3-ketoacyl-CoA thiolase）、（gene-APICC_06057：Trifunctional enzyme subunit alpha）、（gene-APICC_00389：PREDICTED: probable trans-2-enoyl-CoA reductase, mitochondrial）、（gene-APICC_02088：PREDICTED: very-long- chain（3R）-3-hydroxyacyl-CoA dehydratase hpo-8）和（gene-APICC_01118：Acyl-CoA Delta（11）desaturase）。

采集未封蓋、正在封蓋和已封蓋的工蜂幼蟲(chóng)各3只，每組樣品進(jìn)行3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。將采集的樣品迅速放入液氮中速凍，并于-80℃保存。按標(biāo)準(zhǔn)TRlzol Reagent法提取RNA并檢測(cè)RNA樣品的質(zhì)量，隨后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）將檢測(cè)合格的總RNA反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。用Primer 5.0軟件進(jìn)行基因引物設(shè)計(jì)，并由上海生物工程有限公司進(jìn)行引物合成（引物序列詳見(jiàn)表1）。選用為“管家基因”。qRT-PCR反應(yīng)體系（10 μL）： cDNA模板1 μL，上、下游引物各0.4 μL（10 μmol·L-1），SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ 5 μL，無(wú)RNA酶水3.2 μL。qRT-PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃ 10 s，60℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后繼續(xù)從50℃緩慢加熱到90℃，建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線(xiàn)。對(duì)于每個(gè)基因，每個(gè)樣品進(jìn)行3個(gè)技術(shù)重復(fù)。用公式2-ΔΔCt計(jì)算各個(gè)基因在各樣品中的相對(duì)表達(dá)水平[23-24]，然后做平方根轉(zhuǎn)換后進(jìn)行方差分析，檢驗(yàn)各基因在工蜂幼蟲(chóng)不同封蓋時(shí)期的表達(dá)量差異情況。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

使用StatView 5.01（SAS Institute，Cary，NC，USA）分析GC/MS和qRT-PCR的數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)采用“ANOVA and-test”中的“ANOVA or ANCOVA”進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組間用Fisher’s PLSD進(jìn)行差異顯著性比較分析。組間差異被認(rèn)為是顯著的概率水平為0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同封蓋時(shí)期幼蟲(chóng)封蓋信息素含量

在工蜂中，4個(gè)封蓋信息素成分在正在封蓋和已封蓋幼蟲(chóng)體內(nèi)的含量均顯著高于4日齡未封蓋的幼蟲(chóng)。其中，MP和MO的含量均隨幼蟲(chóng)年齡的增長(zhǎng)而增加，且在3個(gè)封蓋時(shí)期間差異顯著（＜0.05），而ML和MLN的含量在正在封蓋和已封蓋的幼蟲(chóng)中差異不顯著（＞0.05）（圖1）。

在雄蜂中，從4日齡未封蓋幼蟲(chóng)到已封蓋幼蟲(chóng)，4種信息素成分含量均隨年齡增長(zhǎng)而增加，且已封蓋幼蟲(chóng)的信息素含量顯著高于4日齡和正在封蓋的幼蟲(chóng)（＜0.05）。此外，除了ML在正在封蓋幼蟲(chóng)體內(nèi)的含量顯著高于4日齡未封蓋幼蟲(chóng)外（＜0.05），其余3種信息素成分在這兩個(gè)封蓋時(shí)期的幼蟲(chóng)中均差異不顯著（＞0.05）（圖2）。

圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，柱上標(biāo)不同字母表示差異顯著（P＜0.05）。圖2同

圖2 雄蜂不同封蓋時(shí)期幼蟲(chóng)封蓋信息素含量

2.2 RNA-seq分析

完成了18個(gè)樣品RNA-seq測(cè)序，經(jīng)過(guò)質(zhì)量控制，共獲得57.26 Gb Clean Data，各樣品Clean Data均達(dá)到2.65 Gb，且Q30堿基百分比均≥94.74%。分別將各樣品的Clean Reads與中華蜜蜂參考基因組進(jìn)行序列比對(duì)，比對(duì)效率均在88.89%—95.37%，且Unique Reads的比對(duì)率≥87.99%，數(shù)據(jù)利用率正常。各試驗(yàn)組3個(gè)生物學(xué)重復(fù)的斯皮爾曼相關(guān)系數(shù)2均＞0.75，說(shuō)明本研究中工蜂與雄蜂各封蓋時(shí)期幼蟲(chóng)3個(gè)重復(fù)樣品的相關(guān)性較強(qiáng)。

對(duì)工蜂與雄蜂3個(gè)不同封蓋時(shí)期幼蟲(chóng)的基因表達(dá)量進(jìn)行組間比較分析，分別獲得4 299和3 926個(gè)差異表達(dá)基因。在未封蓋與正在封蓋、正在封蓋與已封蓋以及未封蓋與已封蓋3個(gè)比較組中，工蜂幼蟲(chóng)分別有62、3 288和3 701個(gè)基因存在表達(dá)差異，其中表達(dá)上調(diào)的基因數(shù)分別為20、1 812和2 022個(gè)，表達(dá)下調(diào)的基因數(shù)分別為42、1 476和1 679個(gè)（圖3-A）；雄蜂幼蟲(chóng)分別有355、2 343和3 489個(gè)基因存在表達(dá)差異，其中表達(dá)上調(diào)的基因數(shù)分別為204、1 517和1 936個(gè)，表達(dá)下調(diào)的基因數(shù)分別為151、826和1 553個(gè)（圖3-C）。分別對(duì)工蜂與雄蜂幼蟲(chóng)的差異表達(dá)基因集進(jìn)行集合分析（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/ Venn/），在未封蓋與正在封蓋、正在封蓋與已封蓋以及未封蓋與已封蓋3個(gè)比較組中，工蜂幼蟲(chóng)有21個(gè)共有的差異表達(dá)基因，4、587和983個(gè)獨(dú)有的差異表達(dá)基因（圖3-B）；雄蜂幼蟲(chóng)有116個(gè)共有的差異表達(dá)基因，58、341和1 382個(gè)獨(dú)有的差異表達(dá)基因（圖3-D）。

圖3 工蜂與雄蜂不同封蓋時(shí)期幼蟲(chóng)差異表達(dá)基因

在KEGG注釋分析中，工蜂不同封蓋時(shí)期幼蟲(chóng)間的所有差異表達(dá)基因共注釋到152個(gè)KEGG通路，其中未封蓋與正在封蓋、正在封蓋與已封蓋以及未封蓋與已封蓋3個(gè)比較組中的差異表達(dá)基因分別注釋到31、99和22個(gè)通路。雄蜂不同封蓋時(shí)期幼蟲(chóng)間的所有差異表達(dá)基因共注釋到130個(gè)KEGG通路，其中上述3個(gè)比較組中的差異表達(dá)基因分別注釋到65、128和125個(gè)通路。KEGG分類(lèi)注釋結(jié)果表明，上述KEGG通路涉及到新陳代謝、細(xì)胞過(guò)程、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理和有機(jī)系統(tǒng)5個(gè)方面，其中與代謝有關(guān)的通路數(shù)量最多。

進(jìn)一步對(duì)注釋到的所有KEGG通路進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)脂肪酸延伸通路（ko00062：Fatty acid elongation）和不飽和脂肪酸生物合成通路（ko01040：Biosynthesis of unsaturated fatty acids），它們可能涉及長(zhǎng)碳鏈的生物合成途徑：首先由乙酰輔酶A通過(guò)脂肪酸延伸通路從頭合成十六鹽酸（C16），然后以C16為前體通過(guò)不飽和脂肪酸生物合成通路形成一個(gè)或多個(gè)雙鍵的不飽和脂肪酸，如油酸和亞油酸。據(jù)報(bào)道，一些昆蟲(chóng)通過(guò)這一途徑進(jìn)行信息素的生物合成[25-27]。因此推測(cè)，這兩個(gè)KEGG通路可能與東方蜜蜂工蜂與雄蜂幼蟲(chóng)封蓋信息素的生物合成有關(guān)。

在工蜂與雄蜂幼蟲(chóng)中，共有11個(gè)差異表達(dá)基因富集在脂肪酸延伸通路和不飽和脂肪酸生物合成通路。其中5個(gè)基因gene-APICC_00389、gene-APICC_00421、gene-APICC_05477、gene-APICC_06057和gene- APICC_10032富集在脂肪酸延伸通路，4個(gè)基因gene- APICC_01118、gene-APICC_01590、gene-APICC_03413和gene-APICC_06057富集在不飽和脂肪酸生物合成通路，此外還有2個(gè)基因gene-APICC_05451和gene-APICC_02088同時(shí)富集到上述兩個(gè)通路中。推測(cè)這11個(gè)基因可能參與調(diào)控東方蜜蜂工蜂與雄蜂幼蟲(chóng)封蓋信息素MP、MO、ML和MLN的生物合成過(guò)程（表2）。

根據(jù)上述結(jié)果，提出東方蜜蜂工蜂與雄蜂幼蟲(chóng)封蓋信息素的生物合成通路，以及調(diào)控這些通路的相關(guān)基因（圖4）。

2.3 qRT-PCR

調(diào)控東方蜜蜂工蜂與雄蜂幼蟲(chóng)封蓋信息素生物合成的5個(gè)候選基因、、、和在封蓋前后3個(gè)時(shí)期的表達(dá)量上、下調(diào)趨勢(shì)和差異情況均與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果相一致（圖5）。qRT-PCR結(jié)果驗(yàn)證了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的可靠性。

網(wǎng)格表示工蜂與雄蜂不同封蓋時(shí)期幼蟲(chóng)的基因表達(dá)量。每個(gè)格子的灰度等級(jí)代表各個(gè)基因在幼蟲(chóng)中的絕對(duì)表達(dá)量，各灰度等級(jí)對(duì)應(yīng)的FPKM值分別為0—10、10—20、20—40、40—80、80—160、160—320、320—640、640—1280、1280—2560和2560—5500

表2 工蜂與雄蜂幼蟲(chóng)封蓋信息素生物合成相關(guān)候選基因注釋

圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，柱上標(biāo)不同字母表示表達(dá)量差異顯著（qRT-PCR：P＜0.05；RNA-seq：FDR≤0.05）

3 討論

Le Conte等提出MP、MO、ML和MLN是誘導(dǎo)蜜蜂封蓋行為的重要信號(hào)[11]。本研究表明，工蜂與雄蜂幼蟲(chóng)在被封蠟蓋的關(guān)鍵階段均增加了這4種信息素成分的釋放量，這與前人報(bào)道的西方蜜蜂結(jié)果相一致[12,28]，進(jìn)一步驗(yàn)證了MP、MO、ML和MLN是與東方蜜蜂封蓋行為相關(guān)的信息素。

在蜂螨的生活周期里，可分為體外寄生期和蜂房繁殖期兩個(gè)不同的時(shí)期。體外寄生期的雌性成螨寄生在巢房外的成年蜂體上，依靠吸取成年蜂的血淋巴生活，當(dāng)巢房?jī)?nèi)的蜜蜂幼蟲(chóng)將要被工蜂封蓋時(shí)，便潛入到幼蟲(chóng)巢房中，并于巢房封蓋后轉(zhuǎn)移到幼蟲(chóng)或預(yù)蛹體上，靠吮吸其血淋巴補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)，隨后產(chǎn)卵繁殖。蜂螨更偏好于寄生在雄蜂的幼蟲(chóng)巢房?jī)?nèi)[10]。據(jù)報(bào)道，在蜂群中有3種BEP成分對(duì)蜂螨有吸引作用，其中MP對(duì)蜂螨的吸引力最強(qiáng)，而EP和ML的作用相對(duì)較弱[5]。在本研究中，MP和ML在正在封蓋的雄蜂幼蟲(chóng)中的含量均顯著高于同發(fā)育時(shí)期的工蜂幼蟲(chóng)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)支持早期的研究結(jié)果，即這些BEP成分可以被蜂螨用來(lái)從正在封蓋的工蜂幼蟲(chóng)中區(qū)分和挑選出雄蜂幼蟲(chóng)。

顏偉玉等[17]測(cè)定了10種幼蟲(chóng)信息素成分在中華蜜蜂不同日齡幼蟲(chóng)和成年蜂個(gè)體中的含量分布情況，張含等[18]和曾云峰等[29]先后研究了幼蟲(chóng)信息素3種酯類(lèi)成分MP、EP和EO對(duì)中華蜜蜂工蜂和蜂王個(gè)體發(fā)育以及工蜂采集、哺育和封蓋等行為的影響，并與意大利蜜蜂作比較，均發(fā)現(xiàn)中華蜜蜂幼蟲(chóng)與意大利蜜蜂幼蟲(chóng)所分泌的幼蟲(chóng)信息素的成分和含量不同，且這兩個(gè)蜂種的工蜂對(duì)幼蟲(chóng)信息素的反應(yīng)靈敏度也不同。本研究中，東方蜜蜂工蜂與雄蜂幼蟲(chóng)的MO、ML和MLN含量整體來(lái)說(shuō)均低于已報(bào)道的相同實(shí)驗(yàn)條件下的西方蜜蜂[12]，筆者推測(cè)這可能是由于東方蜜蜂嗅覺(jué)更靈敏[16]，較低的信息素水平即可引起工蜂對(duì)幼蟲(chóng)的封蓋行為。然而，MP在東方蜜蜂工蜂與雄蜂幼蟲(chóng)中的含量卻高于西方蜜蜂。除了能引發(fā)工蜂的封蓋行為外，MP還被報(bào)道與工蜂的發(fā)育和采集等行為有關(guān)[18,29]，但東方蜜蜂幼蟲(chóng)MP含量高的具體原因還有待進(jìn)一步研究。

信息素的前體主要有3個(gè)來(lái)源：從頭合成、宿主植物或基質(zhì)提供的前體的轉(zhuǎn)化以及宿主分子的直接結(jié)合，但大部分的信息素還是通過(guò)昆蟲(chóng)自身的從頭合成而來(lái)[30]。脂類(lèi)信息素廣泛存在于鱗翅目昆蟲(chóng)中且種類(lèi)繁多，其生物合成通常是在一系列酶的作用下，利用軟脂酸和硬脂酸等脂肪酸中間產(chǎn)物作為前體，經(jīng)過(guò)碳鏈縮短、去飽和化和官能團(tuán)修飾等步驟逐步形成信息素。本研究利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)分析了3個(gè)不同封蓋時(shí)期的東方蜜蜂工蜂與雄蜂幼蟲(chóng)各組間的差異表達(dá)基因，并對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG注釋和富集分析，發(fā)現(xiàn)脂肪酸延伸和不飽和脂肪酸生物合成通路有差異表達(dá)基因顯著富集，由此筆者推測(cè)出東方蜜蜂工蜂與雄蜂幼蟲(chóng)封蓋信息素可能的生物合成通路及相關(guān)的調(diào)控基因。這些生物合成通路是由乙酰輔酶A從頭合成C16，然后以C16為前體通過(guò)去飽和作用形成一個(gè)或多個(gè)雙鍵的不飽和脂肪酸。在許多昆蟲(chóng)中，乙酰輔酶A是主導(dǎo)脂肪酸和酯類(lèi)生物合成的幾個(gè)不同代謝途徑的前體[31-33]，昆蟲(chóng)能利用上述途徑進(jìn)行信息素的生物合成[26-28]，如在家蠶、鉤端螺旋體和大豆中均發(fā)現(xiàn)了類(lèi)似的甲酯合成途徑[26-27,34-35]。這些研究支持關(guān)于東方蜜蜂幼蟲(chóng)4種封蓋信息素成分生物合成通路的推測(cè)。本研究中提出的東方蜜蜂工蜂與雄蜂幼蟲(chóng)封蓋信息素生物合成通路與Qin等[12]報(bào)道的西方蜜蜂工蜂與雄蜂幼蟲(chóng)封蓋信息素生物合成通路相同。東方蜜蜂與西方蜜蜂生存的自然環(huán)境、氣候條件和植物區(qū)系等因素不同，其生物學(xué)特性存在較大的差異，如外部形態(tài)、個(gè)體發(fā)育、生活習(xí)性和學(xué)習(xí)記憶等[14-16]。東方蜜蜂和西方蜜蜂是同屬于蜜蜂屬的兩個(gè)蜂種，其遺傳背景相似，都具有蜜蜂屬的特性，如高度的社會(huì)性生活、采蜜和貯蜜以及筑造雙面六邊形巢房等。已有研究表明，東方蜜蜂幼蟲(chóng)含有與西方蜜蜂幼蟲(chóng)相同的10種脂肪酸酯類(lèi)信息素[17]，其中一些信息素成分已被證實(shí)在影響工蜂發(fā)育和行為方面具有與西方蜜蜂相似的效應(yīng)。因此，筆者推測(cè)東方蜜蜂與西方蜜蜂有可能利用相同的生物合成途徑進(jìn)行信息素的生物合成。

作用于信息素合成過(guò)程的脫氫酶基因已在許多昆蟲(chóng)中被發(fā)現(xiàn)。在本研究中，2個(gè)基因（gene-APICC_01118和gene-APICC_01590）以及2個(gè)基因（gene-APICC_08222和gene-APICC_03413）富集在筆者提出的東方蜜蜂幼蟲(chóng)封蓋信息素的生物合成通路，且GO注釋表明gene-APICC_08222和gene-APICC_03413具有的生物功能。Δ11脫氫酶是蛾類(lèi)和蝴蝶類(lèi)在C11上形成雙鍵最主要的酶[36-41]。Δ11-desaturase是一種生物功能酶，具有類(lèi)似于Δ11和Δ12的去飽和活性，在昆蟲(chóng)信息素生物合成過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[42-46]。Roelofs等研究發(fā)現(xiàn)，紅帶卷葉蛾、大白菜尺蛾和家蠶中的油酸酯、亞油酸酯和亞麻酸酯是從頭合成的，并由去飽和[47]。因此，推測(cè)這4個(gè)基因可能參與了東方蜜蜂幼蟲(chóng)封蓋信息素成分的生物合成途徑。將參與調(diào)控東方蜜蜂封蓋信息素生物合成通路的11個(gè)候選基因與已報(bào)道的西方蜜蜂的12個(gè)候選基因進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)東方蜜蜂中的10個(gè)候選基因（gene-APICC_05477除外）與西方蜜蜂中的10個(gè)候選基因有相同的注釋或基因功能，這些基因分別在東方蜜蜂和西方蜜蜂幼蟲(chóng)封蓋信息素生物合成通路中發(fā)揮著相同的調(diào)控作用。進(jìn)一步比較這些候選基因在未封蓋、正在封蓋和已封蓋工蜂幼蟲(chóng)與雄蜂幼蟲(chóng)中的表達(dá)量可知，這些基因在同一封蓋時(shí)期的工蜂與雄蜂幼蟲(chóng)中的表達(dá)量相近。上述比較結(jié)果進(jìn)一步為這些基因作為參與蜜蜂幼蟲(chóng)封蓋信息素生物合成通路的調(diào)控基因提供了證據(jù)，但確切的調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

東方蜜蜂工蜂幼蟲(chóng)與雄蜂幼蟲(chóng)在被封蠟蓋的關(guān)鍵階段增加了甲基棕櫚酸酯（MP）、甲基油酸酯（MO）、甲基亞油酸酯（ML）和甲基亞麻酸酯（MLN）的釋放量，進(jìn)一步驗(yàn)證了它們是與蜜蜂封蓋行為相關(guān)的信息素，推測(cè)這些信息素可能是在相關(guān)基因的調(diào)控下由乙酰輔酶A從頭合成，而東方蜜蜂幼蟲(chóng)與西方蜜蜂幼蟲(chóng)可能利用相同的生物合成通路進(jìn)行信息素的生物合成。

致謝：本研究得到了江西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司郭磊和江西農(nóng)業(yè)大學(xué)麻俊武老師的幫助，在此表示感謝！

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The Capping Pheromone Contents and Putative Biosynthetic Pathways in Larvae of Honeybees

QIN QiuHong1,2, HE XuJiang1, JIANG WuJun3, WANG ZiLong1, ZENG ZhiJiang1

1Honeybee Research Institute, Jiangxi Agricultural University/Jiangxi Province Key Laboratory of Honeybee Biology and Beekeeping, Nanchang 330045;2School of Medicine, Guangxi University of Science and Technology, Liuzhou 545005, Guangxi;3Apicultural Research Institute of Jiangxi Province, Nanchang 330052

【】In honeybees, methyl palmitate (MP), methyl oleate (MO), methyl linoleate (ML) and methyl linolenate (MLN) are important capping pheromone components, which trigger the capping behavior of adult workers.The objective of this study is to compare the contents of these four pheromone components in the larvae of workers and drones ofat different capping stages, analyze their biosynthetic pathways, and to further explore the mechanism of pheromone communication between larvae and adult workers.【】Usingas the experimental material, the larvae of workers and drones of prior to be capped, in the process of being capped and had been capped were collected for comparing the contents of these four pheromone components by using GC/MS. Simultaneously, RNA-seq was used for gene expression analysis, and the biosynthetic pathways were speculated based on KEGG enrichment of differential expressed genes.【】In worker larvae, the contents of the four capping pheromone components were significantly higher at the capping and capped stage than those of the prior to be capped larvae, and the contents of MP and MO significantly increased with aging of the larvae, while the contents of ML and MLN were not significantly different between the capping and capped stage. Whereas in drone larvae, the contents of the four pheromone components were higher overall and increased with aging, and the content at capped stage was significantly higher than that at prior to be capped and capping. RNA-seq results showed that there were 4 299 and 3 926 differential expressed genes among the larvae groups of three stages of workers and drones, respectively. In addition, 152 and 130 KEGG pathways were obtained from the KEGG annotation analysis of the differential expressed genes, respectively. Furthermore, the possiblebiosynthetic pathways were proposed for MP, MO, ML and MLN from acetyl-CoA, regulating under 11 related candidate genes, and these biosynthesis pathways were found to be similar to those of.【】The release contents of MP, MO, ML and MLN were increased during the critical stage of capping in worker and drone larvae of, which further verified that these four pheromones were related to capping behavior of honeybees, and it was speculated that they were possiblybiosynthesized from acetyl-CoA under the control of related genes.larvae andlarvae may use the same biosynthesis pathway for pheromone biosynthesis.

; capping pheromone; content; transcriptome; biosynthetic pathway

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.11.017

2020-08-24；

2020-11-09

國(guó)家自然科學(xué)基金（31872432）、國(guó)家蜂產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-44-kxj15）

秦秋紅，E-mail：qqhpcc87@163.com。通信作者曾志將，E-mail：bees1965@sina.com

（責(zé)任編輯 岳梅）