谷子抽穗時間基因SiTOC1的表達與單倍型變異分析

張林林，智慧，湯沙，張仁梁，張偉，賈冠清，刁現(xiàn)民

谷子抽穗時間基因的表達與單倍型變異分析

張林林，智慧，湯沙，張仁梁，張偉，賈冠清，刁現(xiàn)民

中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所，北京 100081

【】谷子抽穗時間的適應性表現(xiàn)是廣適性新品種選育的基礎，分析抽穗時間關鍵基因的遺傳變異和單倍型效應，為品種適應性改良提供基礎信息。通過全基因組關聯(lián)分析（genome-wide association study，GWAS），定位谷子抽穗時間關鍵基因，利用多組學數(shù)據(jù)庫（multi-omics database for，MDSi）提供的數(shù)字表達量，分析的組織時空表達特性，并利用原生質體對SiTOC1蛋白進行亞細胞定位。采用qRT-PCR在短日（10 h光照/14 h黑暗）條件下進行24 h節(jié)律表達模式分析。利用有代表性的99份谷子品種，分析編碼區(qū)和啟動子區(qū)的遺傳多態(tài)性、單倍型以及轉錄水平，并對單倍型與抽穗時間的關系進行鑒定。在第1染色體物理位置31 456 761 bp處鑒定到了一個顯著的關聯(lián)信號，與抽穗時間緊密相關，該位點附近存在一個擬南芥抽穗期的同源基因。在光周期響應組織（根、莖、葉等）中高表達，亞細胞定位于細胞核，在傍晚表達量上調，呈現(xiàn)出24 h節(jié)律性表達模式。在不同谷子品種中存在豐富的多態(tài)性，但REC和CCT結構域高度保守。編碼區(qū)2種主要單倍型H-2和H-6分別與啟動子單倍型Hp-591C和Hp-591A共分離，其中，啟動子單倍型Hp-591C較Hp-591A的相對表達量顯著上調了約2.5倍（=0.014），并且該單倍型在三亞市、長治市和烏魯木齊市3個環(huán)境下的抽穗時間分別平均延遲9、11和12 d。啟動子區(qū)第591 bp處的SNP是引起抽穗時間差異的主效位點，單倍型Hp-591A較Hp-591C早熟，可作為主效單倍型用于分子育種選擇。

谷子；抽穗時間；全基因組關聯(lián)分析；單倍型；遺傳變異；節(jié)律性表達

0 引言

【研究意義】農(nóng)作物是人類與動物能量和食物的主要來源。據(jù)預測，在2050年之前，全球農(nóng)作物的單產(chǎn)增加100%—110%才能夠滿足不斷增長人口的食物需求[1]。培育適宜生育期的農(nóng)作物新品種，充分利用光溫資源并實現(xiàn)更高的谷物產(chǎn)量，是解決這一問題的有效途徑?！厩叭搜芯窟M展】谷子（）作為起源于中國黃河流域的古老糧飼兼用作物，在中國的栽培歷史超過一萬年，在長期的栽培和馴化過程中形成了豐富的種質資源[2]。目前，谷子仍然是中國北方干旱、半干旱地區(qū)的重要糧食作物。谷子遺傳資源按照分布區(qū)域和播種期可分為春谷和夏谷兩類。已有研究結果表明，春谷主要分布在中國北方（黑龍江省）和西北部的高海拔地區(qū)，夏谷則分布在氣候溫暖的中部和南部地區(qū)，并且春谷平均抽穗期明顯早于夏谷[3]。谷子是禾本科黍亞科二倍體（2n=2X=18）自花授粉作物，具有C4高光效、基因組較小（約430 M）的特點，目前，谷子高質量基因組測序及組裝已經(jīng)完成[4-5]，穩(wěn)定高效的遺傳轉化體系也已建立[6]，單倍型物理圖譜已經(jīng)構建[3]完成，正在快速發(fā)展成為旱生C4禾谷類作物分子研究的模式植物。植物能夠整合季節(jié)性光周期和冬季溫度等外源信號及其內源性調節(jié)物質來調節(jié)開花時間[7]。日照時數(shù)和溫度，特別是光周期開花和春化過程與抽穗期緊密相關，并且這些調節(jié)途徑由多個基因共同決定[8-9]。CCT家族基因編碼的蛋白（CONSTANS、CO-like和TOC1）具有CCT蛋白保守結構域，作為一類調控開花的轉錄因子，在植物花期調控過程中發(fā)揮了重要作用[10]。根據(jù)N末端結構域，CCT家族基因編碼的蛋白質可分為3個進化枝，即CONSTANS-like（COL）進化枝，CCT MOTIF FAMILY（CMF）進化枝和PSEUDORESPONSE REGULATOR（PRR）進化枝。COL蛋白具有1或2個B-box型鋅指結構域，如擬南芥基因（）和水稻基因（）；CMF蛋白在N末端沒有保守結構域，如水稻基因（）[11]；PRR蛋白具有偽受體（response regulator receiver motif，REC）結構域，如擬南芥晝夜節(jié)律系統(tǒng)關鍵調控基因（，也稱為）和水稻基因（也稱為）[12-14]。CO是第一個被報道的CCT家族基因，在擬南芥中介導了上游光周期信號與下游成花素基因間的協(xié)同調控[15]。研究發(fā)現(xiàn)，水稻CCT結構域發(fā)生錯義突變，形成PRR37/Hd2和Ghd7/Hd4 2種功能缺失突變，進而拓寬了水稻抽穗期從溫暖地區(qū)到寒涼地區(qū)的適應性[16]。已有研究表明，擬南芥晝夜節(jié)律振蕩器由多個連鎖的轉錄反饋網(wǎng)絡環(huán)組合而成[17-19]，振蕩器核心部位成員包括MYB轉錄因子（）和（），以及偽響應調節(jié)器（），其中，的突變體表現(xiàn)為振蕩節(jié)律紊亂，抽穗期提前且早熟，葉片數(shù)及生物量下降[10]。亞細胞定位結果表明，該蛋白定位于細胞核，在被LHY/CCA1蛋白復合體負向調節(jié)的同時可以正向調節(jié)和的表達[20-21]?！颈狙芯壳腥朦c】目前，雖然的晝夜節(jié)律特點和光周期開花調控規(guī)律已經(jīng)在雙子葉植物中初步解析，但在禾谷類作物中的表達規(guī)律和自然變異特點仍然缺乏了解，如何利用節(jié)律振蕩器的早熟效應拓寬農(nóng)作物的適種范圍，尋找優(yōu)異單倍型并進而提高禾谷類作物育種的效率和水平，是目前亟待解決的理論和應用問題。【擬解決的關鍵問題】中國擁有世界上最豐富多樣的谷子種質資源，并且谷子單倍型物理圖譜已經(jīng)構建完成[3]，本研究采用全基因組關聯(lián)分析的方法定位谷子抽穗時間基因，對該基因的時空表達、亞細胞定位、光周期響應規(guī)律及序列變異與抽穗時間之間的關系進行研究，為谷子高效遺傳改良和廣適性分子育種提供指導信息，為解決谷子抽穗時間分子標記匱乏問題奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 種質資源表型鑒定

以盡可能囊括不同地理來源、不同基因型品種多樣性為原則，有代表性地挑選以中國地區(qū)為主來自世界各地的99份谷子品種（地方品種66份和育成品種33份）作為研究材料（電子附表1），分別在三亞市（2010年）、長治市（2016年）和烏魯木齊市（2016年）3個不同生態(tài)環(huán)境下種植。每品種播種兩行，行長3 m，調查出苗期和抽穗期，每穗行50%幼苗展開第一片真葉的日期即為谷子出苗期，每穗行50%植株穗露出旗葉鞘的日期即為谷子抽穗期[22]。計算出苗次日至50%植株抽穗日的天數(shù)即為抽穗時間（單位：天）。

1.2 全基因組關聯(lián)分析

采用TASSEL 5.0軟件進行全基因組關聯(lián)分析，所使用的單倍型圖譜及遺傳結構數(shù)據(jù)均來自已經(jīng)發(fā)表的結果[3]。采用混合線性MLM模型進行數(shù)據(jù)運算，采用R軟件包qqman[23]完成數(shù)據(jù)分析。谷子基因組注釋文件下載自：https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal. html。

1.3 生物信息學分析

將（Photozyme數(shù)據(jù)庫基因號：）的蛋白序列提交至Uniprot蛋白數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org）進行蛋白序列Blast，挑選出擬南芥（）、水稻（）、玉米（）、小麥（）、高粱（）、大豆（）、棉花（）、蒺藜苜蓿（）等不同物種對應同源蛋白序列的Fasta格式導入到MEGA 6軟件中進行多序列比對，將比對好的同源蛋白序列利用鄰接法（Neighbor-joining）構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，步長值設為1 000，其他參數(shù)為默認值。

1.4 表達及亞細胞定位

在谷子多組學數(shù)據(jù)庫（MDSi：Multi-omics Database for，http://foxtail-millet.biocloud. net/home）表達量可視化（expression visualization）欄目中檢索（）獲得數(shù)字表達量FPKM值，分析的時空組織表達特異性。

以已完成全基因組測序的豫谷1號[5]cDNA為模板，分別用亞細胞定位N端載體引物對GFPG5-F1/ GFPG5-R1和C端載體引物對G5GFP-F1/G5GFP-R1（去除終止密碼子）（表1）對的CDS進行PCR擴增，以日本晴cDNA為模板，用亞細胞定位N端載體引物對MYBRFP-F/MYBRFP-R對已報道核定位基因[24]的CDS進行PCR擴增。利用限制性內切酶Ⅰ和Ⅰ消化亞細胞定位PUC-N端載體；限制性內切酶Ⅰ和Ⅰ消化亞細胞定位PUC-C端載體，將獲得的N端、C端和N端PCR回收產(chǎn)物利用同源重組酶Phanta?Max Super-Fidelity DNA Ploymerase（Vazyme #P505）連接到純化回收后的線性化的PUC-N和PUC-C端載體上分別完成35S∷GFP︰SiTOC1、35S∷SiTOC1︰GFP和35S∷RFP︰OsMYB2亞細胞定位載體的構建。將構建好的亞細胞定位N端、C端載體和Marker載體轉化到大腸桿菌中挑取單克隆，分別用N端、C端載體檢測引物對PUCGFPN- TestF/PUCGFPN-TestR（GFPG5-F1.1和GFPG5-R1.1為內部測序引物）、PUCGFPC-TestF/PUCGFPC-TestR（G5GFP-F1.1和G5GFP-R1.1為內部測序引物）和PUCRFPN-TestF/PUCRFPN-TestR檢測陽性克?。ū?），并對陽性克隆完成雙向測序和序列拼接，挑選與參考序列完全一致的單克隆提取質粒（濃度不低于500 ng·μl-1）。提取豫谷1號谷子原生質體，將構建好的SiTOC135S∷ GFP︰SiTOC1和35S∷SiTOC1︰GFP亞細胞定位N端、C端載體分別與Marker載體35S∷RFP︰OsMYB2共轉和空載體同時轉化谷子原生質體，利用共聚焦電子顯微鏡ZenLightEdition（廠家：Carl Zeiss MicroImaging）觀察轉化后的原生質體并生成亞細胞定位結果圖。

表1 SiTOC1亞細胞定位載體構建PCR擴增及測序引物

GFP-N端載體對應35S∷GFP∶SiTOC1，RFP-N端載體對應35S∷RFP∶OsMYB2，其中，GFPG5-F1.1和GFPG5-R1.1僅為測序引物；GFP-C端載體對應35S∷SiTOC1︰GFP，其中，G5GFP-F1.1和G5-R1.1僅為測序引物

The GFP-N end vector corresponds to 35S∷GFP︰SiTOC1, the GFP-N end vector corresponds to 35S∷RFP︰OsMYB2, of which GFPG5-F1.1 and GFPG5-R1.1 are only sequencing primers. the GFP-C end vector corresponds to 35S∷SiTOC1︰GFP, of which G5GFP-F1.1 and G5-R1.1 are only sequencing primers

1.5 表達節(jié)律分析

利用光、溫敏感的Ci846作為研究材料，將Ci846種子播種于短日條件（10 h光照/14 h黑暗）、28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至5葉1心期進行24 h光周期取樣，取地上部組織，每隔2 h取樣一次，其中7：00至17：00為光照階段，17：00至次日7：00為黑暗階段，共取樣13次，將取好的樣品放置于液氮中冷凍，利用全式金的TransZol Up（Lot#O10707）試劑盒，按照操作說明完成所有樣品總RNA的提取，提取好的RNA用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，結果顯示，能夠看到清晰明亮的28s和18s帶型，28s帶型約為18s亮度的2倍，5s帶型亮度較弱，吸取各樣本RNA原液2 μl利用Nanodrop ND 1000分光光度計（廠家：美國Nano Drop）檢測OD260/OD280比值和RNA濃度，OD260/OD280比值為1.7—2.1，代表RNA完整性及純度良好。利用TakaRa廠家的PrimeScriptTM Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit（Cat # 6210A）試劑盒對提取好的樣品RNA取2 000 ng反轉成雙鏈cDNA。利用熒光定量引物對G5Q-F1/G5Q-R1和內參基因熒光定量引物對Cullin-F/Cullin-R（表2）進行熒光定量PCR（3次技術重復），所用試劑為Realtime PCR Super mix SYBRgreen with anti-Taq（Cat #MF013-01）。配置好的PCR反應液瞬離后放入熒光定量PCR儀（廠家：ROCGENE，型號：Archimed-X6系統(tǒng)），對PCR反應結束后輸出的Ct值利用2-△△Ct公式[25]計算各樣品的相對表達量進行節(jié)律表達分析。

表2 SiTOC1 PCR擴增和測序引物

（Photozyme基因號：）為qPCR內參基因，G5P-F1.1和G5P-R1.1僅為測序引物

(Gene ID:) is the reference gene of qPCR, G5P-F1.1 and G5P-R1.1 are only sequencing primers

1.6 單倍型變異分析

利用CTAB法[26]提取不同谷子品種葉片基因組DNA，稀釋一份200 ng·μl-1DNA工作液用于PCR，其余DNA原液-40℃保存。分別設計引物對G5-F1/ G5-R1和G5-F2/G5-R2對編碼區(qū)DNA完成PCR擴增和測序，引物對G5P-F1/G5P-R1對啟動子區(qū)完成PCR擴增，G5P-F1.1和G5P-R1.1為內部測序引物（表2）。采用Primer STAR? HS DNA Polymerase with GC Buffer（Cat#R044A），按試劑說明書配置PCR反應液。配置好的PCR反應液瞬離后放入PCR儀（廠家：新加坡Veriti，型號：VeritiTM 96-well Thermal Cycler）進行PCR反應。用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，結果均為單一的目的條帶，將樣品特異的PCR產(chǎn)物進行雙向測序，利用DNAMAN軟件完成序列拼接。將拼接好的所有樣品序列提交至MEGA 6軟件完成多序列比對，比對好的序列文件提交至DnaSP v.5.0提取變異位點[27]，并對所有變異位點進行單倍型分析。將分析好的單倍型文件（rdf格式）使用Network軟件分析單倍型之間的衍生關系生成單倍型Network網(wǎng)絡圖。

1.7 啟動子單倍型轉錄水平分析

將挑選出的Hp-591A單倍型材料Ci001、Ci023、Ci086、Ci162、Ci846和Hp-591A單倍型材料Ci038、Ci082、Ci115、Ci138、Ci222播種于短日條件（10 h光照/14 h黑暗）、28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至5葉1心期，取地上部組織提取RNA、反轉成cDNA、使用引物對G5Q-F1/G5Q-R1和引物對Cullin-F/Cullin-R（表2）對進行熒光定量PCR（3次技術重復），并計算各樣品的相對表達量。

2 結果

2.1 谷子抽穗時間基因SiTOC1的關聯(lián)分析定位

通過全基因組關聯(lián)分析，在第1染色體物理位置31 456 761 bp處鑒定到了一個顯著的關聯(lián)信號（2010年三亞市），與抽穗期緊密相關（圖1-A）。在該位點上下游50 kb區(qū)間內共存在7個編碼基因（圖1-B），統(tǒng)計7個候選基因的功能注釋信息（表3）發(fā)現(xiàn)為擬南芥同源基因，該基因屬于CCT基因家族，與抽穗時間密切相關。

2.2 SiTOC1的基因結構與同源衍化

編碼區(qū)全長2 266 bp，包含6個外顯子和5個內含子。SiTOC1蛋白N端第28—143位氨基酸（1、2、3外顯子）存在一個REC結構域（response regulator receiver domain），C端第443—486位氨基酸（第6外顯子）存在一個CCT結構域（CCT domain）（圖2-A）。對SiTOC1在擬南芥、水稻、玉米、小麥、高粱、大豆、棉花、蒺藜苜蓿等不同物種中的同源蛋白序列構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，并對其基因結構和作用基序進行比較分析，結果顯示同源蛋白系統(tǒng)進化樹劃分為兩大分枝：分枝Ⅰ均為單子葉植物；分枝Ⅱ均為雙子葉植物。谷子SiTOC1在分枝Ⅰ中與高粱、玉米、水稻具有更高的相似度（圖2-B）?；蚪Y構比較發(fā)現(xiàn)在不同物種中具有保守的基因結構，并且共享保守的REC和CCT結構域。

2.3 SiTOC1的表達規(guī)律及亞細胞定位

利用谷子MDSi數(shù)據(jù)庫表達量數(shù)據(jù)對進行組織特異性表達分析，結果顯示，在根、莖、葉、穗等多個組織中表達，其中，在2葉1心期整株、灌漿期穗下莖、灌漿期旗葉、灌漿期旗葉葉鞘、灌漿期頂端正數(shù)第二莖、灌漿期頂端正數(shù)第四葉、灌漿期頂端正數(shù)第四葉葉鞘、灌漿期根、葉脈、葉肉高表達，但在穗部的小碼表達量相對較低（圖3-A）。SiTOC1和GFP融合蛋白（35S∷SiTOC1︰GFP及35S∷GFP︰SiTOC1）在谷子原生質體中的亞細胞定位結果顯示SiTOC1定位于細胞核（圖3-B），這與擬南芥同源基因結果一致，表明可能和一樣作為轉錄因子執(zhí)行相似的生物學功能。

2.4 SiTOC1 24 h節(jié)律表達模式分析

24 h表達節(jié)律結果顯示，與CCT家族基因相似，在24 h短日（10 h光照/14 h黑暗）光周期條件下具有震蕩表達模式（圖4），在7：00—11：00受光照階段的前4 h表達量較低，在開始光照2 h后（9：00）幾乎不表達，從11：00開始表達量開始上升，在臨近黑暗條件表達量急劇上升，在給光10 h后即在光照與黑暗臨界點17：00時，表達量達到峰值。在黑暗處理2 h（19：00—21：00）后表達量急劇下降，隨后呈現(xiàn)平緩下降的趨勢，在黑暗處理12 h（即次日凌晨5：00）后表達量降至最低。

A：SiTOC1 GWAS定位結果；B：關聯(lián)位點區(qū)間內的候選基因 A: Results of SiTOC1 GWAS; B: Candidate gene in the associated locus range

表3 候選基因注釋信息

紅色字體標注同源基因（Seita.1G236100）；N/A表示無注釋信息

homologous gene(Seita.1G236100) is marked in red font; N/A indicates no annotation

A：SiTOC1的基因結構；B：SiTOC1同源蛋白系統(tǒng)進化樹和基因結構。GRMZM2G020081_T01：玉米；Sobic.004G216700.1：高粱；Sevir.1G241000.1：狗尾草；Seita.1G236100.1 (SiTOC1)：谷子；LOC_Os02g40510.1：水稻；Traes_6AL_A0A31AA9F.1：小麥；AT5G61380.1：擬南芥；Gorial.003G098300.2：棉花；Glyma.06G196200.1：大豆；Medtr4g108880.2：蒺藜苜蓿

2.5 SiTOC1核苷酸序列遺傳多態(tài)性分析

對不同地理來源的99份谷子品種（地方品種66份，育成品種33份）的編碼區(qū)所有的變異位點進行分析，結果表明，編碼區(qū)呈現(xiàn)出豐富的遺傳變異，全長2 266 bp的編碼區(qū)共存在148個變異位點，其中共有130個SNP和18個Indel，這些變異位點共組合成44種單倍型，且變異位點多集中于內含子區(qū)。外顯子區(qū)的SNP多為同義突變，但存在13個非同義SNP位點，分別為g46a（V/M）、g109c（A/P）、g1295a（D/N）、g1428t（I/R）、g1551a（S/N）、t1556a（L/I）、g1707a（R/Q）、g1718t（G/C）、g1756t（Q/H）、a1824c（E/A）、t1847c（Y/H）、c1856t（P/S）和g2180a（V/I）（圖5）。REC結構域共存在25個變異位點，其中20個SNP位點為無義突變，5個位點均導致了移碼突變但均為稀有變異；CCT結構域則十分保守，未發(fā)生突變。編碼區(qū)劃分的44類單倍型中存在2個主型，分別為H-2（單倍型頻率為13）和H-6（單倍型頻率為10）（圖6）；兩類主要單倍型之間共存在7個變異位點，其中1個Indel位點為1099+c（稀有變異），6個SNP位點中5個為無義突變分別是g232t、t305c、a351t、t412c和a831g，1個有義突變?yōu)間1428t（I/R）。對編碼區(qū)的遺傳變異分析發(fā)現(xiàn)編碼區(qū)存在豐富的多態(tài)性，但其重要的2個功能域REC和CCT卻高度保守。

啟動子區(qū)的遺傳變異常與基因的表達量緊密相關。對不同地理來源的29份谷子地方品種的啟動子進行單倍型分析，共檢測到60個變異位點，包括44個SNP位點和16個Indel位點，共有14種單倍型，包括2種主要單倍型Hp-3（單倍型頻率為4）和Hp-4（單倍型頻率為12）（圖7-A）。這兩類單倍型僅在ATG上游第591 bp處存在一個SNP（C-591A），其中單倍型Hp-3在該位點為C，單倍型Hp-4在該位點處為A，暗示該位點可能會影響的轉錄水平。啟動子單倍型Hp-591C（單倍型頻率為16）和Hp-591A（單倍型頻率為13）的相對表達量分析結果顯示，Hp-591C表達量高于Hp-591A（圖7-B），上調了近2.5倍（=0.014）（圖7-C）。

A：SiTOC1的組織特異性分析：a：2葉1心期整株；b：灌漿期穗下莖；c：灌漿期旗葉；d：灌漿期旗葉葉鞘；e：灌漿期頂端正數(shù)第二莖；f：灌漿期頂端正數(shù)第四葉；g：灌漿期頂端正數(shù)第四葉葉鞘；h：灌漿期根；i：發(fā)育早期穗部小碼；j：發(fā)育晚期穗部小碼；k：葉脈；l：葉肉。B：SiTOC1的亞細胞定位，紅色熒光蛋白信號通道顯示35S∷RFP∶OsMYB2的信號，比例尺bar=10 μm

頂部條框的白色部分對應光照時間段（7：00—17：00），黑色部分對應黑暗時間段（17：00—7：00）

SiTOC1編碼區(qū)單倍型Network圖，不同實心圓代表不同單倍型，圓的面積和對應單倍型所包含的品種數(shù)量成正比，黑色連接線代表不同單倍型的突變步驟，連接線上的紅色圓點代表大于一次的突變步驟

2.6 SiTOC1單倍型與抽穗時間的相關性分析

編碼區(qū)兩類單倍型抽穗時間差異分析結果（圖8）表明，H-2單倍型在3個環(huán)境下（2010三亞市、2016長治市、2016烏魯木齊市）的抽穗時間均顯著晚于H-6單倍型，在2016烏魯木齊市達到了極顯著差異水平（=0.0089）（圖8-A）；啟動子區(qū)單倍型Hp-591C和Hp-591A在3個環(huán)境下的抽穗時間差異顯著性分析結果顯示，Hp-591C單倍型在3個環(huán)境下的抽穗時間均顯著晚于Hp-591A單倍型（圖8-B），分別平均延遲9、11和12 d。通過比較編碼區(qū)單倍型H-2和H-6，僅存在一個有義突變：g1428t（I/R），該分離位點在3個環(huán)境下的抽穗時間均無顯著差異（電子附圖1）。鑒于H-2單倍型和Hp-591C單倍型與H-6單倍型和Hp-591A單倍型共分離，推測在3個環(huán)境下抽穗時間的顯著差異主要決定于啟動子區(qū)的變異。

3 討論

3.1 TOC1功能在禾谷類作物中具有保守型

從同源基因進化分析結果可以看出，不同物種中的具有保守的REC和CCT結構域（圖2），暗示不同物種中的也許具有近似的功能，尤其是禾谷類作物中的由于具有較高的序列保守性，功能可能更為接近。擬南芥功能分析發(fā)現(xiàn)，該基因的突變可導致生物鐘節(jié)律由24 h變?yōu)?1 h左右，導致擬南芥植株對24 h光周期下的長日和短日響應變弱，相比野生型表現(xiàn)出了早熟、生物量降低的現(xiàn)象[10]。谷子編碼基因的時空表達規(guī)律也表現(xiàn)出了生物鐘基因特點，并且SiTOC1定位于細胞核，這和擬南芥中研究認為作為核定位的轉錄因子行使功能結果一致。谷子單倍型變異分析顯示，該基因表達量的降低可導致早熟效應，這和擬南芥中觀察到的結果趨勢相同[10]。本研究的結果表明，禾谷類作物中功能與雙子葉植物類似，突變或表達量降低可引起早熟效應，具有潛在的育種利用價值。

A：SiTOC1啟動子單倍型Network圖；B—C：SiTOC1啟動子單倍型相對表達量分析，P=0.014。*：在P＜0.05水平達到顯著差異。下同

**：在P＜0.01水平達到極顯著差異。A：SiTOC1編碼區(qū)單倍型與抽穗時間數(shù)據(jù)的差異顯著性分析，其中2010三亞市P=0.0180，2016長治市P=0.0290，2016烏魯木齊市P=0.0089；B：SiTOC1啟動子單倍型與抽穗時間數(shù)據(jù)的差異顯著性分析，其中2010三亞市P=0.0262，2016長治市P=0.0106，2016烏魯木齊市P=0.0257

已知水稻CCT家族基因/Hd2和/Hd4 2種發(fā)生在CCT結構域的功能缺失的自然等位突變拓寬了水稻抽穗期的適應性[17]。分析不同谷子品種編碼區(qū)的遺傳多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)編碼區(qū)存在豐富的遺傳多樣性，全長2 266 bp的編碼區(qū)在99份谷子不同品種中共檢測到148個變異位點，單倍型分析發(fā)現(xiàn)所有變異位點組合成了豐富的單倍型變異類型共計49種。雖然存在豐富的核苷酸多態(tài)性，但編碼區(qū)REC，CCT結構域卻高度保守，REC結構域檢測到25個變異位點，其中20個SNP位點均為同義突變，5個Indel位點均導致了移碼突變但均為稀有變異。處在光周期途徑中晝夜節(jié)律振蕩器的核心位置，已知REC和CCT結構域是SiTOC1的關鍵作用基序，尤其CCT結構域涉及核定位、DNA結合和蛋白質-蛋白質相互作用，可直接作用于/并抑制其表達，該作用基序發(fā)生突變或者刪除可導致SiTOC1對/的抑制作用消除[15-16]，因此的REC、CCT結構域在不同地理來源的谷子品種中表現(xiàn)出了保守性，對于穩(wěn)定谷子的抽穗時間表現(xiàn)具有重要意義。

3.2 SiTOC1具有主效單倍型并在多環(huán)境下表現(xiàn)早熟效應

本研究分析了編碼區(qū)和啟動子區(qū)的單倍型，發(fā)現(xiàn)編碼區(qū)的2種主要單倍型H-2和H-6與啟動子區(qū)Hp-591C和Hp-591A單倍型共分離，共同引起谷子抽穗時間在多環(huán)境下的顯著差異。通過比較分析發(fā)現(xiàn)相比于編碼區(qū)，啟動子區(qū)C-591A可能是影響谷子抽穗時間的一個重要位點，該分離位點產(chǎn)生的單倍型Hp-591C和Hp-591A的相對表達量以及抽穗時間均存在顯著差異，并且Hp-591C具有更高的表達量和較長的抽穗時間。因此Hp-591A可作為早抽穗單倍型用于育種選擇。已有研究發(fā)現(xiàn)啟動子區(qū)的EE元件（evening element，AAAATATCT）是節(jié)律響應的重要順式作用元件，Myb類轉錄因子CCA1和LHY可直接結合啟動子區(qū)的EE元件抑制的表達[20-21]，而啟動子區(qū)EE元件在所有品種中保守，未發(fā)生突變，因此C-591A分離位點可能位于其他特殊的順式作用元件或者結合位點從而影響的轉錄表達，該位點的具體作用還需要深入開展遺傳研究加以核實。本研究的結果直接證實了主效單倍型的存在，并發(fā)現(xiàn)在不同緯度條件下主效單倍型的效應穩(wěn)定且顯著，具有潛在的育種利用價值。

3.3 谷子廣適性品種選育可能的技術途徑

快速、有效地改良抽穗時間，實現(xiàn)農(nóng)作物對不同光周期環(huán)境的適應性改良具有重要的實踐意義。谷子是光周期敏感作物，對不同光周期生態(tài)區(qū)域的適應性較差。近年來，豫谷18、中谷2等廣適性谷子新品種的選育成功[28]，在一定程度上說明了開展谷子廣適性育種的可行性。本研究發(fā)現(xiàn)主效單倍型的存在和潛在的利用途徑，有望在未來的谷子新品種改良過程中發(fā)揮作用。

在禾谷類作物水稻中關于CCT類基因的研究進展表明，在不同的日長中顯示出雙功能，在日本晴中短日條件促進開花，長日條件延遲開花[29]，而且可在晝夜節(jié)律的調節(jié)下觸發(fā)下游的成花素表達[30]。此外，的雙功能特性與背景有關：在長日照條件下，被誘導抑制谷物中編碼B型響應調節(jié)劑的特異開花激活基因的表達，導致成花素減少和開花時間延遲[31]，在鎮(zhèn)山97中，持續(xù)促進開花，當基因組中存在時，與相互作用并導致開花延遲[32]。除了、和也能夠實現(xiàn)從促進開花到延遲開花的功能逆轉[33-34]。已有的調控網(wǎng)絡分析結果表明，、和之間以及、和之間的遺傳相互作用增強了對的抑制作用[35]。從水稻中已有的研究結果來看，CCT類基因普遍與抽穗期適應性調控緊密相關，開展相關基因的遺傳變異分析對于尋找相關基因的育種利用途徑具有重要的理論和實踐指導意義。

可以看出，谷子CCT類基因之間的轉錄調控及其遺傳相互作用也應該普遍存在，需要育種工作者進一步開展相關基因的自然變異及遺傳效應研究，為谷子廣適性新品種選育提供更多分子標記。此外，通過在禾谷類作物中開展更多CCT類基因的變異和單倍型效應研究，也必將極大地促進相關育種工作的高效開展，為廣適性新品種選育及保障國家糧食安全提供更多指導信息。

4 結論

谷子SiTOC1具有保守的REC和CCT結構域，在響應光周期的組織（根、莖、葉）中高表達，具有CCT家族基因典型的晝夜節(jié)律性表達模式并定位于細胞核。編碼區(qū)主要單倍型H-2和H-6與啟動子區(qū)效應位點（C-591A）共分離，該效應位點單倍型Hp-591C的表達量較Hp-591A顯著上調，導致谷子品種在三亞市、長治市和烏魯木齊市3個不同環(huán)境下的抽穗時間分別平均延遲9、11和12 d。

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Characterizations of Transcriptional and Haplotypic Variations of

ZHANG LinLin, ZHI Hui, TANG Sha, ZHANG RenLiang, ZHANG Wei, JIA GuanQing, DIAO XianMin

Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081

【】Identification of allelic variations of heading date adaptation related genes and laying foundation for breeding of wide-adapted varieties in foxtail millet.【】In this trial, a vital regulator of heading time in foxtail millet,, was identified using genome-wide association analysis. Spatio-temporal transcription (multi-omics database for，MDSi), sub-cellular localization and 24 hours rhythm expression pattern ofwas analyzed. Sequence variations of both promoter and encoding regions inand relationships between haplotypic variations and heading date were characterized in 99 foxtail millet accessions.【】A significant GWAS signal (Position: 31 456 761 bp) was detected on Chromosome 1 and only onehomologue was identified ().highly expressed in root, stem and leaf, and located into cell nucleus. An elevated expression ofwas identified at dusk across whole day transcription survey under short-day environment. Many haplotypic variations ofwere identified but REC and CCT domains of SiTOC1were conserved in foxtail millet accessions, and two main haplotypes including H-2 and H-6 in protein encoding regions combined with two co-segregated haplotypes including Hp-591C and Hp-591A were identified. Nearly 2.5 times higher expression of Hp-591C haplotype combined with 9,11 and 12 days delay of heading time through Hainan, Changzhi and Urumuqi were observed.【】The major haplotype Hp-591A identified at 591 bp in the promoter region ofmatures earlier than Hp-591C and could be selected as a main effective locus for molecular breeding of foxtail millet.

; heading time; genome-wide association study; haplotype; genetic variation; rhythmic expression

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.11.003

2020-11-09；

2020-12-07

國家重點研發(fā)計劃（2018YFD1000701/2018YFD1000700）、國家自然科學基金（31871630）、國家谷子高粱產(chǎn)業(yè)技術體系（CARS-06-13.5- A4）、中國農(nóng)業(yè)科學院創(chuàng)新工程

張林林，E-mail：657044121@qq.com。通信作者賈冠清，E-mail：jiaguanqing@caas.cn。通信作者刁現(xiàn)民，E-mail：diaoxianmin@caas.cn

（責任編輯 李莉）