小麥籽粒超氧化物歧化酶（SOD）活性全基因組關(guān)聯(lián)分析

王繼慶，任毅，時(shí)曉磊，王麗麗，張新忠，蘇力壇·姑扎麗阿依，謝磊，耿洪偉

小麥籽粒超氧化物歧化酶（SOD）活性全基因組關(guān)聯(lián)分析

王繼慶1，任毅1，時(shí)曉磊1，王麗麗1，張新忠2，蘇力壇·姑扎麗阿依1，謝磊1，耿洪偉1

1新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830052；2新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所，烏魯木齊 830091

【】小麥籽粒超氧化物歧化酶活性對(duì)小麥面粉色澤和營養(yǎng)品質(zhì)具有重要影響，挖掘與小麥籽粒超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)及候選基因，為揭示小麥籽粒SOD活性的遺傳機(jī)理和小麥面粉色澤的遺傳改良奠定基礎(chǔ)。采用氮藍(lán)四唑（nitro-blue tetrazolium，NBT）光化還原法對(duì)3個(gè)環(huán)境下種植的212份普通小麥品種（系）進(jìn)行SOD活性檢測，結(jié)合90K SNP芯片的16 705個(gè)高質(zhì)量SNP標(biāo)記對(duì)小麥籽粒SOD活性進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome-wide association study，GWAS），并對(duì)穩(wěn)定遺傳的顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)進(jìn)行候選基因的挖掘。不同環(huán)境下，各小麥品種（系）間的SOD活性表現(xiàn)出豐富的表型變異，變異系數(shù)為4.34%—5.23%，相關(guān)系數(shù)介于0.60—0.90（＜0.001）。多態(tài)性信息含量（polymorphic information content，PIC）為0.24—0.29。全基因組連鎖不平衡（linkage disequilibrium，LD）衰減距離為7 Mb。群體結(jié)構(gòu)分析表明，供試材料可分為3個(gè)亞群。GWAS分析結(jié)果顯示，共檢測到29個(gè)與SOD活性顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)（≤0.001），分布在1A、1B、2A、2B、2D、3B、3D、4B、4D、5A、5B、5D、6A、6B、6D和7B染色體上，單個(gè)位點(diǎn)可解釋5.47%—32.43%的表型變異，其中14個(gè)位點(diǎn)在2個(gè)及以上環(huán)境下均被檢測到。9個(gè)顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)在3個(gè)環(huán)境下被同時(shí)檢測到，分布于1B、2B、4B、5A、5B、6B和6D染色體，貢獻(xiàn)率為6.21%—16.62%。對(duì)穩(wěn)定遺傳的顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)進(jìn)行候選基因的挖掘，共挖掘、、、、、和等7個(gè)SOD基因和、等2個(gè)與SOD活性相關(guān)的候選基因，候選基因的功能主要與抑制細(xì)胞活性氧積累及參與抗氧化劑再生過程有關(guān)。檢測到與小麥籽粒SOD活性顯著關(guān)聯(lián)的29個(gè)SNP位點(diǎn)，共篩選出7個(gè)SOD基因和2個(gè)與SOD活性有關(guān)的候選基因。

小麥籽粒；SOD活性；全基因組關(guān)聯(lián)分析；SNP；候選基因

0 引言

【研究意義】小麥?zhǔn)侨蛑匾Z食作物之一。隨著人們生活水平的提高，優(yōu)質(zhì)已成為中國小麥主要育種目標(biāo)[1]。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）對(duì)小麥面粉色澤及面制品營養(yǎng)品質(zhì)有重要作用[2-6]。SOD能通過歧化反應(yīng)過程中釋放出的分子氧將面粉及面制品中類胡蘿卜素等色素分子的共軛雙鍵氧化為單鍵，從而對(duì)面粉顏色起到漂白作用[2-4]。面團(tuán)流變學(xué)特性是小麥品質(zhì)重要影響因素之一[7]。SOD通過影響面團(tuán)中蛋白質(zhì)的分子內(nèi)或分子間巰基和二硫鍵交換反應(yīng)，產(chǎn)生更多的二硫鍵，將肽鏈上的氨基酸殘基聚攏起來，形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中蛋白質(zhì)分子的排列更有序，從而穩(wěn)定蛋白質(zhì)的構(gòu)象，改善面團(tuán)流變學(xué)特性[6-8]。此外，SOD也能通過歧化超氧化物陰離子自由基（O2-），生成的過氧化氫和分子氧，進(jìn)一步將面粉中的膳食纖維組分降解為具有益生元功效的低聚糖等成分[9]。因此，挖掘小麥籽粒SOD活性基因，進(jìn)而培育高SOD活性小麥品種，對(duì)改善面粉及面制品營養(yǎng)品質(zhì)具有重要的意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】在植物中，SOD可分為Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和Fe-SOD 3種類型[3]。小麥、玉米等主要谷物葉片的SOD活性研究表明，玉米具有最高的SOD活性，在2 500 U·g-1以上，分別是小麥、大豆和水稻的1.5、2和3倍[10]。Bharti等[11]認(rèn)為不同小麥品種（系）在最大分蘗期、開花期和籽粒灌漿期葉片SOD活性均存在顯著性差異（＜0.05）。Eyido?an等[12]對(duì)小麥幼苗時(shí)期根冠組織進(jìn)行了研究，也發(fā)現(xiàn)SOD活性在不同品種間相差1.5—2倍。劉家林等[13]在水稻全基因組水平上對(duì)SOD基因家族進(jìn)行分析，在第3、4、5、6、7和8染色體上共發(fā)現(xiàn)9個(gè)SOD基因，包括6個(gè)Cu/Zn-SOD基因、2個(gè)Fe-SOD基因和1個(gè)Mn-SOD基因。趙艷等[14]將谷子中的8個(gè)SOD基因定位在第2、3、4、6、7和9染色體上，其中包括5個(gè)Cu/Zn-SOD基因和3個(gè)Mn-SOD基因。Wu等[15]和Baek等[16]利用中國春缺四體和雙端體材料，將小麥籽粒Mn-SOD活性基因定位于小麥2A、2B和2D染色體長臂上，將Cu/Zn-SOD活性基因定位于7A、7B和7D染色體長臂上，其中，位于2D長臂上的Xfbb377—Xf'bcd410區(qū)段存在一個(gè)影響小麥種子中SOD含量的上位QTL位點(diǎn)[17]。Jiang等[18]從小麥全基因組中鑒定出26個(gè)SOD基因，分布于第2、4和7同源染色體上。Kumar等[19]在小麥6D染色體上克隆到Mn-SOD基因?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，對(duì)于小麥籽粒中脂肪氧化酶（lipoxygenase，LOX）和過氧化物酶（peroxidase，POD）等抗氧化酶類與小麥品質(zhì)基因挖掘、克隆、功能標(biāo)記開發(fā)等研究已較為深入，其中功能標(biāo)記也已應(yīng)用于育種實(shí)踐[20-21]，但對(duì)小麥籽粒SOD活性測定的研究以及對(duì)控制小麥籽粒SOD活性位點(diǎn)挖掘的研究仍鮮見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究通過對(duì)212份小麥品種（系）的籽粒SOD活性進(jìn)行測定，結(jié)合90K SNP芯片，進(jìn)行該性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析，挖掘與SOD活性顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)，有利于進(jìn)一步揭示小麥籽粒SOD活性的遺傳機(jī)制，為小麥品質(zhì)性狀的分子標(biāo)記輔助育種提供材料與方法。

1 材料與方法

1.1 材料

供試小麥品種（系）共計(jì)212份，包括中國黃淮冬麥區(qū)93份，北部冬麥區(qū)35份，長江中下游冬麥區(qū)26份，西南冬麥區(qū)14份，44份來自法國、羅馬尼亞和意大利等歐洲國家的品種（系）（電子附表1），上述材料均由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院小麥遺傳育種課題組提供。供試材料分別于2016—2017年、2017—2018年和2018—2019年種植于新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院瑪納斯試驗(yàn)站，隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，3次重復(fù)，單行種植，行長2 m，行距0.25 m。田間管理同當(dāng)?shù)匾恢?，采用滴灌澆水，除冬灌水外，分別于冬小麥拔節(jié)前、孕穗期、開花期、灌漿前期和灌漿中期共滴灌5次。每年7月中旬采用人工單行混收，晾曬7 d后，為避免機(jī)械混雜，采用人工脫粒。

1.2 普通小麥籽粒SOD的提取

以磷酸緩沖溶液為提取液進(jìn)行SOD粗酶液提取，首先稱取10 g去雜去劣的小麥籽粒，利用篩孔為0.8 mm的旋風(fēng)磨（瑞典LaboratoryMill 120）研磨成全麥粉，然后稱取0.1 g全麥粉置于2 mL離心管中，加入1 mL 4℃預(yù)冷的0.05 mol·L-1磷酸緩沖溶液（pH 7.8），在混旋振蕩器上振蕩1 min，使緩沖液與全麥粉充分接觸；最后將裝有樣品的離心管放于搖床上，冰浴搖晃2 h后，4℃10 000 r/min離心15 min，吸取上清液，即為SOD粗酶液。

1.3 氮藍(lán)四唑（NBT）光化還原法測定SOD活性

采用氮藍(lán)四唑（NBT）光化還原法測定SOD活性[22]。SOD活性檢測的底物為0.05 mol·L-1磷酸緩沖溶液150 μL、蒸餾水20 μL、130 mmol·L-1Met溶液30 μL、750 μmol·L-1NBT溶液30 μL、100 μmol·L-1EDTA-Na2溶液30 μL和20 μmol·L-1核黃素溶液30 μL的混合液，混勻后立即使用，隨后滴入10 μL的SOD粗酶液（設(shè)2支對(duì)照管，且對(duì)照管以緩沖液代替酶液）。將其中1支對(duì)照管置于暗處，其余均放于4 000 lx日光燈下，反應(yīng)20 min。同一重復(fù)內(nèi)材料的SOD活性測定使用同一批次配置的底物，以避免因底物濃度誤差導(dǎo)致的試驗(yàn)誤差。應(yīng)用酶標(biāo)儀（美國Synergy H1），在560 nm、25℃條件下測定OD值。已知SOD活性單位以抑制NBT光還原的50%為一個(gè)酶活性單位表示，SOD活性計(jì)算公式如下：

SOD總活性（U·g-1）＝（Ack-AE）×V/（Ack×0.5× W×Vt）

式中，SOD總活性以每克樣品鮮質(zhì)量的酶單位表示（U·g-1）；Ack：照光對(duì)照管的吸光度；AE：樣品管的吸光度；V：樣品液總體積（ml）；Vt：測定時(shí)樣品用量（ml）；W：樣品鮮重（g）。

每個(gè)小麥品種（系）的SOD活性重復(fù)測定2次，如果2次測定結(jié)果的相差超過10%，則需進(jìn)行重復(fù)測定。

1.4 表型數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2016和SPSS 21.0軟件對(duì)SOD活性進(jìn)行基本數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析，使用QTL IciMapping V4.1軟件進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)分析和方差分析[23]，計(jì)算廣義遺傳力公式為：2=g2/（g2+e2），其中，g2為遺傳方差，e2為環(huán)境方差。

1.5 群體結(jié)構(gòu)與連鎖不平衡分析

試驗(yàn)前期使用90K SNP芯片對(duì)212份冬小麥材料進(jìn)行了基因分型，人工對(duì)分型結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制，剔除數(shù)據(jù)缺失率＞50%、雜合率＞50%和最小等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）＜0.05的SNP標(biāo)記，共獲得16 705個(gè)高質(zhì)量SNP標(biāo)記。應(yīng)用Power Marker V3.25軟件計(jì)算多態(tài)性信息量（polymorphic information content，PIC）。從篩選過的標(biāo)記中，隨機(jī)選取2 000個(gè)最小等位基因頻率大于10%且在染色體上均勻分布的SNP標(biāo)記，利用Structure 2.3.4軟件進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析。參數(shù)設(shè)置：Length of Burn-Period=10 000，MCMC Reps after Burn-in=100 000，選擇Admixture Ancestry模型和Dependent Allele Frequencies模式，令K=2—12，每個(gè)K值重復(fù)運(yùn)行5次，利用Tassel 5.0軟件繪制群體結(jié)構(gòu)分析圖。以位點(diǎn)間的相關(guān)系數(shù)平方（2）作為衡量多態(tài)性位點(diǎn)兩兩之間的連鎖不平衡（linkage disequilibrium，LD）參數(shù)。利用Tassel 5.0軟件計(jì)算2，以第95百分位的2值作為閾值估測LD衰減距離。關(guān)聯(lián)分析中，超過LD衰減距離的2個(gè)位點(diǎn)則認(rèn)為是2個(gè)不同的位點(diǎn)。

1.6 全基因組關(guān)聯(lián)分析

基于篩選到的高質(zhì)量標(biāo)記，利用Tassel 5.0軟件中的Q+K混合線性模型進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，以=1.0×10-3為閾值，判定SNP標(biāo)記與目標(biāo)性狀關(guān)聯(lián)的顯著性[24]。利用R語言繪制關(guān)聯(lián)分析結(jié)果的曼哈頓圖和Q-Q圖。

2 結(jié)果

2.1 小麥籽粒SOD活性的表型變異

212份供試小麥品種（系）在不同環(huán)境下SOD活性平均值分別為1 784.14、1 798.26、1 774.25和1 781.28 U·g-1，年際間SOD活性最大差異為708.31 U·g-1，變異系數(shù)為4.34%—5.23%。不同環(huán)境之間的SOD活性呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.60—0.90（＜0.001），遺傳力為0.79（表1）。在不同環(huán)境下SOD活性均呈正態(tài)分布（圖1），具有廣泛的SOD活性。就本研究所采用的材料而言，不同麥區(qū)品種（系）的SOD活性表現(xiàn)為，北部冬麥區(qū)＞國外品種＞西南冬麥區(qū)＞黃淮冬麥區(qū)＞長江中下游冬麥區(qū)。北部冬麥區(qū)小麥品種（系）在不同環(huán)境下均表現(xiàn)出較高的SOD活性（表2）。

2.2 SNP多態(tài)性及分布

從小麥90K SNP芯片中篩選出具有多態(tài)性的SNP標(biāo)記16 705個(gè)，分布在A、B和D基因組染色體上的SNP位點(diǎn)數(shù)目分別為7 153（42.82%）、7 346（43.97%）和2 206（13.21%），其中，B基因組的多態(tài)性最高，D基因組的多態(tài)性低于A和B 2個(gè)基因組（表3）。21條染色體中1B、2B染色體上的標(biāo)記數(shù)目最多，均有1 293個(gè)，4D染色體上的標(biāo)記數(shù)目最少，只有99個(gè)。3個(gè)染色體組的PIC表現(xiàn)為B（0.27）＞A（0.26）＞D（0.24）。全基因組的PIC平均值為0.26。

表1 不同環(huán)境中212份冬小麥籽粒SOD活性統(tǒng)計(jì)分析

***表示在＜0.001水平差異顯著；SD：標(biāo)準(zhǔn)差；CV：變異系數(shù)

***Significant at＜0.001; SD: Standard deviation; CV: Variable coefficient

圖1 212份冬小麥在不同環(huán)境下的SOD活性分布頻次

表2 不同麥區(qū)冬小麥籽粒SOD活性

表3 標(biāo)記的分布、物理圖譜長度及標(biāo)記的多態(tài)性

2.3 群體結(jié)構(gòu)與連鎖不平衡分析

利用Structure 2.3.4軟件對(duì)每個(gè)可能的K值模擬運(yùn)算，用K值與ΔK值做圖（圖2-A），在K=3處，ΔK值最大，曲線變化程度最大。由圖2-B可以看出參試材料分為3個(gè)亞群，亞群1包含59份（27.83%）品種（系），主要來自國外（20份）和北京市（19份），亞群2包含93份（43.87%）品種（系），主要來自陜西省（14份）、四川?。?0份）和江蘇?。?份），亞群3包含60份（28.30%）品種（系），主要來自河南省（24份）。利用Tassel 5.0軟件計(jì)算得到212份小麥品種（系）在基因組A、B、D和全基因組的LD衰減距離分別為5、8、9和7 Mb，依據(jù)全基因組的LD衰減距離，將在物理圖譜上前后7 Mb區(qū)間內(nèi)的位點(diǎn)認(rèn)定為一個(gè)候選位點(diǎn)。

2.4 標(biāo)記-性狀關(guān)聯(lián)分析

利用Tassel 5.0軟件將212份小麥品種（系）的SOD活性結(jié)合90K芯片的16 705個(gè)高質(zhì)量SNP標(biāo)記進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，采用Q+K混合線性模型，共檢測到29個(gè)與SOD活性顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)（圖3和表4），貢獻(xiàn)率為5.37%—32.43%；2016—2017年檢測到與SOD活性相關(guān)的16個(gè)顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，分別位于1B、2B、3B、3D、4B、4D、5A、5B、5D、6B、6D和7B等12條染色體上，貢獻(xiàn)率為5.37%—16.62%；2017—2018年檢測到與SOD活性相關(guān)的5個(gè)顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，分別位于1B、2A、6A和6B等4條染色體上，貢獻(xiàn)率為6.27%—17.00%；2018—2019年檢測到與SOD活性相關(guān)的11個(gè)顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，分別位于1B、2B、4B、5A、5B、6B和6D等7條染色體上，貢獻(xiàn)率為6.21%—32.43%；平均環(huán)境下檢測到與SOD活性相關(guān)的20個(gè)位點(diǎn)，分別位于1A、1B、2A、2B、2D、3D、4B、5A、5B、5D、6A、6B和6D等13條染色體上，貢獻(xiàn)率為5.37%—32.43%。其中14個(gè)顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)在2個(gè)及以上環(huán)境下均檢測到，分布于1B、2A、2B、3D、4B、5A、5B、5D、6A、6B和6D等11條染色體上，貢獻(xiàn)率為5.37%—32.43%。在3個(gè)環(huán)境下同時(shí)檢測到9個(gè)顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，分布于1B、2B、4B、5A、5B、6B和6D染色體上，貢獻(xiàn)率為6.21%—16.62%。

2.5 小麥籽粒SOD活性候選基因預(yù)測

將與小麥籽粒SOD活性顯著關(guān)聯(lián)且穩(wěn)定遺傳的SNP標(biāo)記序列在普通小麥中國春基因組數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索，并在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLASTx序列比對(duì)[25]，篩選到7個(gè)SOD基因和2個(gè)與SOD活性相關(guān)的候選基因（表5）。在這些候選基因的注釋中，編碼鋅指應(yīng)激蛋白（Zinc finger stress protein）；注釋為谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因（glutathione transferase gene）。

A：群體的?k值；B：群體結(jié)構(gòu)示意圖 A: Estimation of ?k value in population; B: Group structure diagram

3 討論

3.1 SOD活性的分析

小麥面粉色澤和面制品營養(yǎng)品質(zhì)是小麥品質(zhì)遺傳改良的重要內(nèi)容。多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）、過氧化物酶（peroxidase，POD）、木聚糖酶（xylanase）和a-淀粉酶（a-amylase）等能夠影響面粉色澤和面制品營養(yǎng)品質(zhì)[21,26-28]。對(duì)PPO、POD、EC3.2.1.8和EC3.2.1.1等研究已較為深入，但是對(duì)超氧化物歧化酶SOD研究較少，籽粒中SOD活性變化規(guī)律及遺傳機(jī)理未見報(bào)道。SOD活性屬于數(shù)量性狀，既能夠穩(wěn)定遺傳給后代，同時(shí)又受環(huán)境影響[29]。蒲光蘭等[30]研究表明，群體性狀變異程度或變異幅度越大，對(duì)種質(zhì)變異和創(chuàng)新貢獻(xiàn)率就越高，遺傳力的大小能反映了某一性狀的差異。本研究表明，SOD活性在多個(gè)環(huán)境下的變幅為1 316.83—2 025.14 U·g-1，平均值為1 784.14、1 798.26、1 774.25和1 781.28 U·g-1。不同環(huán)境下的變異系數(shù)介于4.34%—5.23%，表明不同供試材料在不同環(huán)境下均表現(xiàn)出豐富的表型變異，但絕大部分供試材料的SOD活性較低，具有較強(qiáng)的遺傳改良潛力。其廣義遺傳力為0.79，表明不同供試材料的SOD活性雖受環(huán)境因素的影響，但遺傳因素是導(dǎo)致其表型變異的主要原因。另外SOD活性較高的京冬22和陜715可作為優(yōu)良親本進(jìn)行育種工作，為籽粒SOD活性改良奠定基礎(chǔ)。

E1：2016—2017年環(huán)境點(diǎn)；E2：2017—2018年環(huán)境點(diǎn)；E3：2018—2019年環(huán)境點(diǎn)；A：平均環(huán)境

表4 SNP-GWAS檢測到的SOD活性顯著相關(guān)的位點(diǎn)

E1：2016—2017年環(huán)境點(diǎn)；E2：2017—2018年環(huán)境點(diǎn)；E3：2018—2019年環(huán)境點(diǎn)；A：平均環(huán)境

E1: 2016-2017 environmental point; E2: 2017-2018 environmental point; E3: 2018-2019 environmental point; A: average environment

表5 篩選獲得候選基因信息

經(jīng)過K-S檢驗(yàn)，SOD活性在多個(gè)環(huán)境下均呈正態(tài)分布，且供試小麥品種（系）遺傳背景來源廣泛，具有較好的遺傳多樣性，適合進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析。對(duì)不同麥區(qū)SOD活性比較發(fā)現(xiàn)，北部冬麥區(qū)＞國外品種＞西南冬麥區(qū)＞黃淮冬麥區(qū)＞長江中下游冬麥區(qū)，這可能是由于逆境脅迫會(huì)使SOD活性升高[31-32]，北部冬麥區(qū)和國外品種所在區(qū)域緯度較西南冬麥區(qū)、黃淮冬麥區(qū)及長江中下游冬麥區(qū)緯度更高，高緯度地區(qū)比低緯度地區(qū)氣候更加惡劣，長期寒冷和干旱脅迫導(dǎo)致北部冬麥區(qū)和國外品種（系）SOD活性更高。而西南冬麥區(qū)SOD活性高于黃淮冬麥區(qū)和長江中下游冬麥區(qū)的原因可能是西南冬麥區(qū)在20世紀(jì)已經(jīng)開始著重于小麥品質(zhì)改良研究，注重選育高品質(zhì)的小麥作為主推品種[33]。因此，西南冬麥區(qū)品種（系）的平均SOD活性高于以上2個(gè)麥區(qū)。

3.2 SOD活性GWAS分析

全基因組關(guān)聯(lián)分析具有研究時(shí)間短、檢測精度高、高通量和低成本等特點(diǎn)[34]。Stich等[35]研究認(rèn)為GWAS中使用Q+K混合模型法是目前降低假陽性關(guān)聯(lián)的最好方法。本研究采用Q+K混合模型法對(duì)212份供試材料的SOD活性進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，研究結(jié)果表明，共檢測到29個(gè)顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)，分布在小麥的16條染色體上。鞠曉影等[36]利用DH群體在1B上檢測到SOD活性QTL；衛(wèi)憲云等[37]和趙新華等[38]利用不同的RIL群體分別在2D和7B上檢測到SOD活性QTL；本研究同樣在1B、2D和7B上發(fā)現(xiàn)了SOD活性顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)。同時(shí)還在2A、2B、4B、4D和6D上發(fā)現(xiàn)7個(gè)顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，這與Jiang等[18]和Kumar等[19]研究結(jié)果一致。同時(shí)，對(duì)2B上的標(biāo)記BS00026037_51進(jìn)行候選基因篩選，通過基因功能注釋確定基因?yàn)镾OD基因（758.59 Mb），這與Jiang等[18]報(bào)道的基因（758.59 Mb）相同。

與此同時(shí)，本研究還檢測到3D、5A、5B、5D、6A和6B上多個(gè)穩(wěn)定遺傳的新位點(diǎn)。其中5A（BS00024602_51）貢獻(xiàn)率最大，為26.29%—32.43%。在3個(gè)環(huán)境下同時(shí)檢測5A（BS00022191_51）、5B（BobWhite_rep_c62475_70和RAC875_c33791_320）和6B（Kukri_c49331_77）位點(diǎn)，貢獻(xiàn)率為6.21%—16.62%。對(duì)以上位點(diǎn)進(jìn)行候選基因挖掘，篩選到2個(gè)SOD基因和2個(gè)與SOD活性相關(guān)的基因。在下一步研究中，依據(jù)5A上的位點(diǎn)貢獻(xiàn)率最高，5B上存在多個(gè)穩(wěn)點(diǎn)遺傳的位點(diǎn)，可考慮優(yōu)先選擇5A和5B染色體作為熱點(diǎn)區(qū)域進(jìn)一步精細(xì)定位并開發(fā)相應(yīng)的育種可用標(biāo)記，剖析小麥籽粒SOD活性的遺傳機(jī)理，為小麥品質(zhì)改良工作提供基礎(chǔ)。

3.3 候選基因預(yù)測

本研究利用中國春基因組數(shù)據(jù)庫獲取與SOD活性顯著關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記序列，并在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLASTx序列比對(duì)，進(jìn)行候選基因篩選，根據(jù)基因功能注釋信息，篩選到7個(gè)SOD基因和2個(gè)與SOD活性相關(guān)的候選基因。位于3D和5B染色體上各2個(gè)Cu/ Zn-SOD活性基因以及6D染色體上的1個(gè)Cu/Zn-SOD活性基因，2B和6A染色體上各1個(gè)SOD活性基因。位于5A染色體上的基因編碼鋅指應(yīng)激蛋白，能抑制細(xì)胞活性氧積累和丙二醛的形成，且能恢復(fù)線粒體膜電位平衡和抗氧化酶活性，在此過程中達(dá)到調(diào)節(jié)SOD活性的作用[39-40]，位于6B染色體上的基因注釋為谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因，該基因參與植物細(xì)胞抗氧化劑的再生過程，在大分子的生物合成、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和蛋白質(zhì)間相互作用等方面具有重要的調(diào)節(jié)作用，是抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分[41-42]。本研究篩選的SOD基因和與SOD活性相關(guān)基因編碼不同蛋白，在植物代謝途徑中直接或間接調(diào)控SOD活性。

4 結(jié)論

獲得29個(gè)與SOD活性顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)，其中14個(gè)位點(diǎn)被重復(fù)檢測到。獲得7個(gè)小麥籽粒SOD活性候選基因，2個(gè)與SOD活性相關(guān)候選基因，分別為編碼鋅指應(yīng)激蛋白基因和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因，它們通過參與抗氧化劑再生、抑制活性氧積累并組成抗氧化系統(tǒng)來調(diào)節(jié)SOD活性。

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Genome-wide association analysis of superoxide dismutase (SOD) activity in wheat grain

WANG JiQing1, REN Yi1, SHI XiaoLei1, WANG LiLi1, ZHANG XinZhong2, SULITAN·GuZhaLiAYi1, XIE Lei1, GENG HongWei1

1College of Agriculture, Xinjiang Agricultural University/Key Laboratory of Agricultural Biological Technology, Urumqi 830052;2Institute of grain crops, Xinjiang Academy of Agricultural Sciences, Urumqi 830091

【】The activity of superoxide dismutase (SOD) in wheat grains has a significant effect on the color and nutritional quality of wheat flour. Identification of associated loci and candidate genes for SOD activity in wheat grains is important for discovering the genetic mechanism of SOD activity in wheat grains and genetic improvement of wheat flour color.【】The SOD activity of 212 common wheat varieties (lines) planted in 3 environments was detected by photoreduction method of nitro-blue tetrazolium (NBT), and the genome-wide association study (GWAS) of SOD activity in wheat grains was carried out by 16 705 high-quality SNP markers of 90K SNP chip, and candidate genes of significantly associated loci of stable inheritance were identified.【】The phenotypic variation of SOD activity among wheat varieties (lines) was significant in different environments, with the coefficient of variation ranging from 4.34% to 5.23%, the correlation coefficient ranging from 0.60 to 0.90 (＜0.001). Polymorphic information content (PIC) ranging from 0.24 to 0.29 and the whole genome linkage disequilibrium (LD) attenuation distance of 7 Mb. The analysis of population structure showed that the tested materials could be divided into 3 subgroups. GWAS analysis showed that 29 loci (≤0.001) were significantly associated with SOD activity, which were distributed on chromosomes 1A, 1B, 2A, 2B, 2D, 3B, 3D, 4B, 4D, 5A, 5B, 5D, 6A, 6B, 6D and 7B. A single locus can explain the phenotypic variation(2) between 5.47% and 32.43%, of which 14 loci were detected in 2 or more environments. Nine significant associated loci were detected in three environments, distributed on chromosomes 1B, 2B, 4B, 5A, 5B, 6B and 6D, with a contribution rate of 6.21%-16.62%. SOD genes of,,,,and, and SOD-activity-related candidate genes ofandwere used to identify the candidate genes of significantly associated loci of stable inheritance. The functions of the candidate genes were mainly related to the inhibition of cell reactive oxygen species accumulation and the participation in antioxidant regeneration.【】Twenty-nine SNP loci associated with SOD activity in wheat grains were detected, and 7 SOD genes and 2 candidate genes related to SOD activity were screened out.

wheat grain; SOD activity;genome-wide association study; SNP; candidate genes

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.11.001

2020-10-31；

2020-12-28

國家自然科學(xué)基金（31771786）、新疆維吾爾自治區(qū)科技創(chuàng)新基地建設(shè)項(xiàng)目（PT1910）

王繼慶，E-mail：WANGjiqing0655@163.com。通信作者耿洪偉，E-mail：hw-geng@163.com

（責(zé)任編輯 李莉）