綠原酸通過增強(qiáng)RsmA的表達(dá)抑制銅綠假單胞菌生物被膜的形成

唐小麗, 韋俊彬, 封毅, 樂寧, 梁丹娜, 卓少元, 尚立國(guó)

1. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)護(hù)理學(xué)院，廣西 南寧 530200； 2. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)與實(shí)驗(yàn)中心，廣西 南寧 530200； 3. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣西 南寧 530200； 4. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)賽恩斯新醫(yī)藥學(xué)院，廣西 南寧 530222

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)是常見的人類條件致病菌之一，能引起多種感染。其可在病灶處形成生物被膜，使其產(chǎn)生耐藥性并逃避人體免疫系統(tǒng)的攻擊而導(dǎo)致慢性難治性感染，常規(guī)抗菌藥物很難將其根除[1-2]。銅綠假單胞菌生物被膜形成的調(diào)控機(jī)制非常復(fù)雜，其中轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子RsmA發(fā)揮關(guān)鍵作用。RsmA主要通過兩種途徑抑制生物被膜的形成。① RsmA與胞外多糖合成相關(guān)基因mRNA的Shine-Dalgarno(SD)序列結(jié)合抑制該基因的翻譯，最終胞外多糖合成量降低，生物被膜的形成也被抑制[3]。② RsmA與環(huán)二鳥苷酸(cyclic dimeric guanosine monophosphate，c-di-GMP)合成酶基因mRNA的SD序列結(jié)合抑制該基因的表達(dá)，也可在轉(zhuǎn)錄水平抑制該基因的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)c-di-GMP水平降低。c-di-GMP是生物被膜形成中起關(guān)鍵調(diào)控作用的第二信使分子，其水平降低會(huì)導(dǎo)致生物被膜形成能力下降[4,5]。

隨著銅綠假單胞菌生物被膜基礎(chǔ)研究的不斷深入，生物被膜的抑制劑備受關(guān)注，其可通過多個(gè)途徑來發(fā)揮抑制作用。主要包括：①抑制菌體的運(yùn)動(dòng)和黏附能力；②抑制胞外多糖等胞外基質(zhì)的合成；③誘導(dǎo)生物被膜的解體；④抑制群體感應(yīng)系統(tǒng)[6-9]。生物被膜的抑制劑種類及其來源非常豐富，包括抗菌藥物、化學(xué)合成藥物、微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物、動(dòng)植物天然化學(xué)產(chǎn)物。綠原酸是植物中存在的一類酚酸類物質(zhì)，由咖啡酸與奎尼酸結(jié)合而成。多種中草藥如金銀花、杜仲、菊花、蒲公英中綠原酸含量豐富，不少研究表明綠原酸是這些中草藥的重要藥效成分[10]。溫紅俠等[11]研究發(fā)現(xiàn)，亞抑菌濃度的綠原酸可顯著抑制銅綠假單胞菌生物被膜的形成，這與綠原酸抑制群體感應(yīng)系統(tǒng)有關(guān)。銅綠假單胞菌生物被膜的形成不僅受群體感應(yīng)系統(tǒng)的調(diào)控，還受Gac-Rsm系統(tǒng)、c-di-GMP系統(tǒng)以及其他系統(tǒng)的調(diào)控，但綠原酸是否可通過群體感應(yīng)系統(tǒng)之外的其他途徑影響生物被膜的形成尚不清楚。因此，本研究重點(diǎn)探討了綠原酸對(duì)Gac-Rsm系統(tǒng)中的關(guān)鍵組分RsmA以及非編碼RNA RsmZ和RsmY表達(dá)的影響，并對(duì)細(xì)胞內(nèi)c-di-GMP水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)綠原酸可通過增強(qiáng)RsmA的表達(dá)來抑制銅綠假單胞菌生物被膜的形成，為采用綠原酸輔助治療銅綠假單胞菌感染提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒銅綠假單胞菌為本實(shí)驗(yàn)室保存的PAO1菌株，大腸埃希菌為DH5α菌株，于37 ℃培養(yǎng)。β-半乳糖苷酶活性測(cè)定中使用的pDG926載體為lacZ融合廣宿主載體，蛋白質(zhì)印跡法中使用的pLAFR3質(zhì)粒為低拷貝廣宿主表達(dá)載體，三親結(jié)合實(shí)驗(yàn)中所用的輔助質(zhì)粒pRK2013質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 引物聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)引物由華大基因公司合成，引物序列見表1。

1.1.3 培養(yǎng)基和試劑將銅綠假單胞菌PAO1和大腸埃希菌于 LB培養(yǎng)基中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。在生物被膜定量測(cè)定、實(shí)時(shí)PCR、胞外多糖測(cè)定等實(shí)驗(yàn)中均采用Jensen培養(yǎng)基(氯化鈉 85.6 mmol/L，磷酸氫二鉀 14.4 mmol/L，谷氨酸鈉 92 mmol/L，纈氨酸 24 mmol/L，苯丙氨酸 8 mmol/L，葡萄糖 70 mmol/L，硫酸鎂 1.33 mmol/L，氯化鈣 0.14 mmol/L，硫酸亞鐵 0.003 9 mmol/L，硫酸鋅 0.008 5 mmol/L，pH=7.3)。抗生素在培養(yǎng)基中的濃度：卡那霉素(kanamycin，Km)50 mg/L；氨芐青霉素(ampicillin，Amp)50 mg/L；四環(huán)素(tetracycline，Tc)在銅綠假單胞菌中用100 mg/L，在大腸埃希菌中用10 mg/L。限制性DNA內(nèi)切酶購(gòu)于寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司，高保真DNA聚合酶、DNA消化與RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)PCR試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA純化試劑盒購(gòu)于南京諾維贊生物科技股份有限公司?；瘜W(xué)試劑均為分析純級(jí)別，購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司以及國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司。

表1 PCR引物序列

1.2 方法

1.2.1 綠原酸最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)的測(cè)定采用2倍稀釋法測(cè)定綠原酸對(duì)銅綠假單胞菌PAO1的MIC，主要步驟如下。將新鮮活化的PAO1菌株接種于LB液體培養(yǎng)基，37 ℃，220 r/min培養(yǎng)過夜。5 000 r/min離心后收集菌體，棄上清液，用無菌生理鹽水懸浮菌沉淀后再次離心，然后用Jensen培養(yǎng)液懸浮菌體，并適當(dāng)稀釋至OD600=0.05。吸取5 mL菌液加入玻璃試管中，再加入適量的綠原酸乙醇溶液(100 mg/mL)，使綠原酸工作濃度為10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5 mg/mL。每個(gè)實(shí)驗(yàn)濃度設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。將試管于37 ℃靜置培養(yǎng)24 h。觀察各試管菌液渾濁情況，判斷綠原酸對(duì)PAO1菌株的抑菌效果，將菌液未見渾濁的綠原酸最低濃度記為MIC。

1.2.2 菌體生長(zhǎng)曲線測(cè)定菌體生長(zhǎng)曲線測(cè)定主要步驟如下。將新鮮活化的PAO1菌株接種于LB液體培養(yǎng)基，37 ℃，220 r/min培養(yǎng)過夜。5 000 r/min離心，收集菌體，棄上清液，用無菌生理鹽水懸浮菌沉淀后再次離心，然后用Jensen培養(yǎng)液懸浮菌體，并適當(dāng)稀釋至OD600=0.1。吸取20 mL菌懸液加入100 mL三角瓶中，37 ℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)，每間隔2 h吸取1 mL菌液測(cè)定OD600。為研究亞抑菌濃度的綠原酸對(duì)PAO1菌株生長(zhǎng)的影響，在振蕩培養(yǎng)前向?qū)嶒?yàn)組三角瓶中加入綠原酸乙醇溶液，使其工作濃度為0.5 mg/mL，對(duì)照組加入等體積無水乙醇。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2.3 生物被膜測(cè)定采用結(jié)晶紫染色法定量測(cè)定生物被膜[12]，主要步驟如下。將新鮮活化的PAO1菌株接種于LB培養(yǎng)液，37 ℃，220 r/min培養(yǎng)過夜。5 000 r/min離心，收集菌體，用滅菌生理鹽水洗滌沉淀后再次離心，然后用Jensen培養(yǎng)液懸浮菌體，并適當(dāng)稀釋至OD600=0.1。吸取150 μL菌懸液加入96孔塑料培養(yǎng)板中，用封口膜密封防止水分揮發(fā)，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h。每個(gè)樣品設(shè)置4個(gè)生物學(xué)重復(fù)。吸取培養(yǎng)板中的菌液，適當(dāng)稀釋后測(cè)定OD600，加入生理鹽水輕輕洗滌培養(yǎng)孔內(nèi)壁，除去多余的菌體。加入160 μL 0.1%結(jié)晶紫乙醇染液，于室溫靜置染色10 min。除去染液，用蒸餾水輕輕洗滌培養(yǎng)板多次，直到洗滌液不再顯藍(lán)色。向每個(gè)培養(yǎng)板孔中加入160 μL 30%乙酸溶液，靜置10 min，用移液器吹吸幾次，確保生物被膜吸附的結(jié)晶紫充分溶解于乙酸溶液中，獲得結(jié)晶紫乙酸洗脫液。吸取150 μL經(jīng)過適當(dāng)稀釋的結(jié)晶紫乙酸洗脫液，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD560。生物被膜形成量的計(jì)算公式：biofilm biomass =(OD560×稀釋倍數(shù))/(OD600×稀釋倍數(shù))。為研究亞抑菌濃度的綠原酸對(duì)PAO1菌株生物被膜形成的影響，于生物被膜靜置培養(yǎng)前向?qū)嶒?yàn)組菌懸液中添加一定體積的綠原酸乙醇溶液，使綠原酸工作濃度為0.5 mg/mL，對(duì)照組加入等體積無水乙醇溶液。生物被膜測(cè)定至少進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 實(shí)時(shí)PCR用細(xì)菌總RNA提取試劑盒提取細(xì)菌總RNA，用DNA消化與RNA反轉(zhuǎn)錄一體試劑盒對(duì)細(xì)菌總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。對(duì)內(nèi)參基因16 s以及待測(cè)基因進(jìn)行熒光引物設(shè)計(jì)，利用美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)網(wǎng)站的Primer-BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)對(duì)熒光引物進(jìn)行擴(kuò)增效率和特異性檢測(cè)。實(shí)時(shí)PCR程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s共40個(gè)循環(huán)。以16 s為內(nèi)參基因，用2-ΔΔCt法分析不同實(shí)驗(yàn)條件下待測(cè)基因的相對(duì)表達(dá)情況。實(shí)時(shí)PCR至少進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 胞外多糖含量測(cè)定采用硫酸苯酚法對(duì)細(xì)菌胞外總多糖含量進(jìn)行測(cè)定[13]。利用Jensen培養(yǎng)液搖床培養(yǎng)PAO1菌株以進(jìn)行胞外多糖提取，主要步驟如下。將新鮮活化的PAO1菌株接種于LB液體培養(yǎng)液，37 ℃，220 r/min培養(yǎng)過夜。5 000 r/min離心，收集菌體，用滅菌生理鹽水洗滌沉淀后再次離心，然后用Jensen培養(yǎng)液懸浮菌體，并適當(dāng)稀釋至OD600=0.1。吸取20 mL菌液加入100 mL三角瓶，37 ℃，220 r/min培養(yǎng)24 h。為研究亞抑菌濃度的綠原酸對(duì)PAO1菌株胞外多糖合成的影響，在開始振蕩培養(yǎng)前向?qū)嶒?yàn)組三角瓶中加入一定體積的綠原酸乙醇溶液，使綠原酸的工作濃度為0.5 ml/mL，對(duì)照組三角瓶加入等體積無水乙醇。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。振蕩培養(yǎng)結(jié)束后，吸取10 mL菌液，用渦旋儀劇烈振蕩后高速離心(13 000 r/min，30 min)，收集上清液，加入三倍體積無水乙醇。4 ℃靜置過夜，13 000 r/min離心10 min，收集沉淀，用10 mL蒸餾水懸浮沉淀，獲得胞外多糖粗提液。胞外多糖提取至少進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。硫酸苯酚法測(cè)定胞外多糖含量的操作如下：向試管中加入適量胞外多糖粗提液，空白組用蒸餾水，標(biāo)準(zhǔn)組用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液(C標(biāo)=0.1 g/L)；依次加入5%苯酚水溶液和2.5 mL濃硫酸，混勻，40 ℃水浴鍋加熱15 min；取出試管，室溫冷卻，吸取150 μL溶液，用分光光度計(jì)測(cè)定OD490。胞外多糖含量的計(jì)算公式為：C測(cè)=OD490測(cè)/OD490標(biāo)×C標(biāo)。

1.2.6 β-半乳糖苷酶活性測(cè)定首先，構(gòu)建lacZ-cdrA融合表達(dá)載體。利用銅綠假單胞菌基因組序列設(shè)計(jì)引物(lacZ-cdrA-F/R)對(duì)cdrA基因啟動(dòng)子(500 bp)進(jìn)行擴(kuò)增，用DNA重組酶將獲得的目標(biāo)DNA整合到自身不含啟動(dòng)子的lacZ表達(dá)載體pGD926上，通過三親結(jié)合方式導(dǎo)入銅綠假單胞菌PAO1中。三親結(jié)合的主要步驟為：將包含pGcdrA質(zhì)粒的大腸埃希菌、銅綠假單胞菌PAO1以及含有pRK2013輔助質(zhì)粒的大腸埃希菌接種于LB培養(yǎng)基，搖床培養(yǎng)過夜；三種菌液等比例混合后，3 000g離心5 min，收集菌沉淀，用無菌生理鹽水懸浮后再次離心，用50 μL生理鹽水懸浮菌體并滴于LB固體培養(yǎng)平板，37 ℃靜置24～48 h；刮下菌苔，用無菌生理鹽水懸浮，吸取100 μL菌懸液涂布于含Tc和Cm的LB固體培養(yǎng)板，37 ℃培養(yǎng) 24～48 h，挑出單菌落進(jìn)行質(zhì)粒提取和PCR驗(yàn)證，以確保成功獲得了含pGcdrA的銅綠假單胞菌。然后，測(cè)定β-半乳糖苷酶活性，主要操作步驟如下[14]。用Jensen培養(yǎng)液培養(yǎng)含lacZ-cdrA表達(dá)載體的銅綠假單胞菌，每個(gè)菌株設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。培養(yǎng)條件為37 ℃，220 r/min搖床培養(yǎng)10 h，測(cè)定OD600。將菌液置于EP離心管，離心后收集菌體，無菌生理鹽水洗滌菌體1次后用Buffer Z懸浮菌體。向菌懸液中加入2～3滴氯仿，混勻，37 ℃保溫40 min，隨后加入200 μL(4.0 g/L)鄰硝基苯-β-D-半乳吡喃糖苷(o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside，ONPG)溶液并混勻，37 ℃繼續(xù)保溫，記錄反應(yīng)起始時(shí)間。待樣品溶液顯黃色，加入Na2CO3溶液以終止反應(yīng)，記錄反應(yīng)終止時(shí)間，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD420和OD550。按以下公式計(jì)算β-半乳糖苷酶的活性：Units=1 000×(OD420-1.75×OD550)/T×V×OD600(T：反應(yīng)時(shí)間，單位為min；V：菌體體積，單位為mL)。β-半乳糖苷酶活性測(cè)定至少進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.7 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)RsmA-flagpLAFR3-RsmA-flag表達(dá)載體的構(gòu)建如下。根據(jù)rsmA基因全長(zhǎng)序列(包含500 bp啟動(dòng)子)設(shè)計(jì)引物，設(shè)計(jì)下游引物時(shí)去除rsmA基因的終止密碼子并添加flag標(biāo)簽序列。以銅綠假單胞菌基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得含500 bp啟動(dòng)子和flag序列的RsmA-flag DNA片段，用EcoR I和BamH I對(duì)廣宿主質(zhì)粒pLAFR3進(jìn)行雙酶切線性化，RsmA-flag片段與線性化載體pLAFR3在重組酶的作用下連接獲得pLAFR3-RsmA-flag表達(dá)載體。通過三親結(jié)合實(shí)驗(yàn)，將pLAFR3-RsmA-flag轉(zhuǎn)移到銅綠假單胞菌PAO1中。蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)RsmA-flag步驟如下。用Jensen培養(yǎng)液培養(yǎng)含pLAFR3-RsmA-flag質(zhì)粒的PAO1菌株，培養(yǎng)條件為37 ℃，220 r/min，培養(yǎng)10 h后離心，收集菌體。為探究綠原酸對(duì)銅綠假單胞菌細(xì)胞內(nèi)RsmA蛋白水平的影響，實(shí)驗(yàn)組添加一定體積的綠原酸乙醇溶液，使綠原酸終濃度為0.5 mg/mL，對(duì)照組添加等體積無水乙醇。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組各設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。用超聲波細(xì)胞破碎儀將收集的細(xì)胞破碎(破碎儀的工作條件設(shè)置為：30%功率，工作3 s，停歇10 s，共45個(gè)工作循環(huán))。細(xì)胞破碎后，于4 ℃以 13 000 r/min離心15 min，收集上清液，即為總蛋白抽提液，用考馬斯亮藍(lán)法對(duì)上清液進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。將總蛋白抽提液進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)，上樣蛋白總量為20 μg。為檢測(cè)電泳后的蛋白條帶，用考馬斯亮藍(lán)染色，同時(shí)采用濕式轉(zhuǎn)移法將蛋白條帶轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，5%脫脂牛奶低溫封閉過夜。加入以1∶5 000 稀釋的flag鼠源單克隆抗體(Sigma公司，美國(guó))10 mL，室溫?fù)u動(dòng)孵育1 h，用含吐溫20的Tris緩沖液(Tris buffered saline with Tween 20，TBST)洗膜4次，每次10 min。加入以1∶2 000 稀釋的辣根過氧化酶(horseradish peroxidase，HRP)偶聯(lián)的抗鼠第二抗體IgG(CST公司，美國(guó))10 mL，室溫?fù)u動(dòng)孵育1 h，用TBST洗膜4次，每次10 min。用超敏型增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence，ECL)底物(北京索萊寶科技有限公司)孵育膜，Bio-Rad化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)膜上的化學(xué)發(fā)光信號(hào)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用Excel作圖，SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(n=3)，P<0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 綠原酸抑制PAO1菌株生物被膜的形成

已有文獻(xiàn)表明綠原酸具有抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的作用，本研究首先通過試管2倍稀釋法測(cè)定綠原酸對(duì)PAO1菌株的MIC為2.5 mg/mL，與溫紅俠等[11]報(bào)道的3 mg/mL接近。為研究亞抑菌濃度的綠原酸對(duì)PAO1菌株的作用，選擇0.5 mg/mL(1/5 MIC)為其工作濃度。從生長(zhǎng)曲線來看，該濃度的綠原酸在Jensen培養(yǎng)基中并不影響菌體生長(zhǎng)，但在生長(zhǎng)后期小幅提高了菌體密度(如圖1所示)。

圖1 綠原酸對(duì)PAO1菌株生長(zhǎng)的影響

結(jié)晶紫染色法結(jié)果顯示，綠原酸顯著抑制PAO1菌株的生物被膜形成(約31%)(如圖2所示)。

注：**P<0.01。

2.2 綠原酸降低PAO1菌株胞外多糖的合成

細(xì)菌胞外多糖的合成能力是影響生物被膜形成的重要因素，綠原酸降低PAO1菌株生物被膜形成的可能原因之一是其抑制了菌株胞外多糖的合成。為驗(yàn)證這一猜想，本研究采用乙醇沉淀法分離提取PAO1菌株的胞外總多糖進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果顯示綠原酸使PAO1菌株胞外多糖合成量下降了47.3%(如圖3所示)。銅綠假單胞菌主要合成三種胞外多糖，分別為alginate、psl和pel，PAO1菌株幾乎不合成pel，主要合成psl以及少量alginate[15]。采用實(shí)時(shí) PCR檢測(cè)psl合成關(guān)鍵基因pslA的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示綠原酸并未顯著改變pslA的表達(dá)量(如圖4所示)，表明其可能通過轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控方式調(diào)節(jié)胞外多糖合成基因的表達(dá)。雖然本研究構(gòu)建了含lacZ-pslA融合表達(dá)載體的PAO1菌株并檢測(cè)了其內(nèi)β-半乳糖苷酶活性，但可能因?yàn)閜slA啟動(dòng)子活性過低，未檢測(cè)到β-半乳糖苷酶活性。

注：** P<0.01。

圖4 綠原酸對(duì)pslA基因表達(dá)水平的影響

2.3 綠原酸增強(qiáng)PAO1菌株RsmA的表達(dá)

Gac-Rsm系統(tǒng)是調(diào)控銅綠假單胞菌生物被膜形成的關(guān)鍵系統(tǒng)，其中RsmA蛋白是RNA結(jié)合蛋白，可通過轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控胞外多糖合成基因pslA的表達(dá)，非編碼RNA RsmY和RsmZ則通過與RsmA競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合而抑制RsmA的功能[16]。為探究綠原酸是否通過Gac-Rsm系統(tǒng)參與PAO1菌株胞外多糖合成的調(diào)控，本研究檢測(cè)了綠原酸對(duì)rsmA、rsmY和rsmZ基因轉(zhuǎn)錄的影響。實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示，綠原酸使rsmA轉(zhuǎn)錄水平升高了2.39倍，而rsmY和rsmZ轉(zhuǎn)錄水平的變化并不顯著(如圖5所示)。為進(jìn)一步探究綠原酸對(duì)PAO1菌株細(xì)胞內(nèi)RsmA蛋白水平的影響，本研究構(gòu)建了在RsmA的C端添加flag標(biāo)簽的表達(dá)載體，導(dǎo)入野生型菌株，蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示綠原酸增強(qiáng)了RsmA-flag的蛋白表達(dá)水平(如圖6所示)。據(jù)此推測(cè)，綠原酸可通過增強(qiáng)RsmA表達(dá)來抑制pslA基因的翻譯，進(jìn)而降低PAO1菌株胞外多糖合成量。已有文獻(xiàn)顯示銅綠假單胞菌中rsmA的轉(zhuǎn)錄水平隨菌體密度的增加而增加，表明rsmA的轉(zhuǎn)錄是群體感應(yīng)依賴型的[17]。用實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)銅綠假單胞菌中三種群體感應(yīng)系統(tǒng)基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)綠原酸作用下las系統(tǒng)以及rhl系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄水平有所升高，但沒有顯著性差異(低于2倍)，pqs系統(tǒng)中的pqsA轉(zhuǎn)錄水平下降約50%，也沒有顯著性差異，表明綠原酸并未在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)群體感應(yīng)系統(tǒng)相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行顯著調(diào)控(如圖7所示)。因此，綠原酸對(duì)rsmA轉(zhuǎn)錄的調(diào)控還需進(jìn)一步探究。

圖5 綠原酸對(duì)Gac-Rsm系統(tǒng)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

圖6 綠原酸對(duì)RsmA蛋白表達(dá)水平的影響

圖7 綠原酸對(duì)群體感應(yīng)系統(tǒng)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

2.4 綠原酸降低PAO1菌株細(xì)胞內(nèi)c-di-GMP水平

c-di-GMP在銅綠假單胞菌生物被膜形成中起關(guān)鍵調(diào)控作用，其胞內(nèi)含量往往與生物被膜形成量呈正相關(guān)，有文獻(xiàn)報(bào)道RsmA可負(fù)調(diào)控c-di-GMP水平[4]。本研究也檢測(cè)到綠原酸可增強(qiáng)PAO1菌株RsmA表達(dá)，據(jù)此推斷其可能也通過RsmA抑制c-di-GMP合成。CdrA是銅綠假單胞菌中與生物被膜形成關(guān)系密切的V型蛋白分泌系統(tǒng)的組成成分，cdrA基因的啟動(dòng)子活性可被c-di-GMP顯著激活，因此可通過lacZ-cdrA啟動(dòng)子融合載體檢測(cè)β-半乳糖苷酶活性來測(cè)定細(xì)胞內(nèi)c-di-GMP的相對(duì)水平[18-19]。結(jié)果顯示，cdrA啟動(dòng)子活性在正常條件下為133.12，綠原酸導(dǎo)致其下降到77.49，表明綠原酸能顯著降低細(xì)胞內(nèi)c-di-GMP水平(如圖8所示)。

3 討論

銅綠假單胞菌對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥性的原因之一是生物被膜的形成，因此研制生物被膜抑制劑來治療其感染已經(jīng)成為非抗生素治療的重要方向。我國(guó)在用中藥抑制銅綠假單胞菌生物被膜形成以輔助抗生素治療方面取得了不少進(jìn)展，例如陳一強(qiáng)等[20]發(fā)現(xiàn)金銀花水煎液可顯著抑制銅綠假單胞菌的菌體黏附作用與生物被膜形成，與頭孢他啶聯(lián)同可增強(qiáng)頭孢他啶對(duì)生物被膜內(nèi)菌體的殺滅作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，綠原酸作為金銀花的主要有效成分，可抑制銅綠假單胞菌生物被膜的形成，這可能是通過抑制菌體群體感應(yīng)系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)的[21]。本研究在此基礎(chǔ)上探究了綠原酸抑制銅綠假單胞菌的作用機(jī)制。

注： **P<0.01。

值得指出的是，本研究培養(yǎng)銅綠假單胞菌生物被膜采用96孔微量塑料培養(yǎng)板，操作簡(jiǎn)單，形成生物被膜的時(shí)間短，8～24 h內(nèi)就可獲得成熟的生物被膜，是培養(yǎng)銅綠假單胞菌生物被膜的最常見方法之一。本研究采用結(jié)晶紫染色法對(duì)PAO1菌株生物被膜進(jìn)行定量測(cè)定，結(jié)果顯示綠原酸顯著降低了PAO1菌株胞外多糖合成以及生物被膜形成，與陳一強(qiáng)的研究結(jié)果相似。有趣的是，胞外多糖合成的關(guān)鍵基因pslA的表達(dá)未受影響，暗示綠原酸通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控方式來發(fā)揮調(diào)控作用。在原核生物中，基因表達(dá)的調(diào)控方式主要包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，轉(zhuǎn)錄調(diào)控占主要地位。但是隨著研究的深入，研究者發(fā)現(xiàn)越來越多的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控在細(xì)菌的各種生理活動(dòng)中發(fā)揮重要作用。到目前為止，銅綠假單胞菌中Gac-Rsm系統(tǒng)是研究的最為深入的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控系統(tǒng)，它在次級(jí)代謝產(chǎn)物合成、致病性、氧化脅迫耐受、生物被膜、群體感應(yīng)等方面都發(fā)揮重要作用[16, 22]。本研究通過實(shí)時(shí)PCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)綠原酸在mRNA水平和蛋白水平提高了rsmA基因表達(dá)，而非編碼RNArsmY和rsmZ的轉(zhuǎn)錄不受影響。由此推斷，在綠原酸存在的條件下，細(xì)胞內(nèi)有更多的RsmA蛋白，這些蛋白通過抑制pslA的翻譯而抑制psl的合成，還可通過抑制c-di-GMP的合成來抑制胞外多糖的合成以及生物被膜的形成。值得指出的是，最近Wang等[23]報(bào)道綠原酸可通過抑制銅綠假單胞菌群體感應(yīng)系統(tǒng)來降低菌體的毒性和致病性，但本研究未檢測(cè)到綠原酸對(duì)群體感應(yīng)系統(tǒng)基因(lasI、rhlI和pqsA)的表達(dá)有顯著影響，可能原因主要有兩個(gè)。①本研究采用的培養(yǎng)基為Jensen培養(yǎng)基，是以葡萄糖為碳源的限制性合成培養(yǎng)基，而Wang等的研究選用了營(yíng)養(yǎng)更加豐富的LB培養(yǎng)基。菌體在不同培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，眾多基因的表達(dá)模式發(fā)生了顯著變化，其中就可能包括群體感應(yīng)系統(tǒng)相關(guān)基因。②本研究與Wang等使用的綠原酸濃度有很大差異，Wang等使用的綠原酸濃度為2.56 mg/mL，比本研究使用的0.5 mg/mL高得多。不少抗菌藥物對(duì)細(xì)菌生理活動(dòng)和基因表達(dá)的調(diào)控與其工作濃度密切相關(guān)，綠原酸發(fā)揮功能的方式復(fù)雜而多樣，在較高濃度與低濃度下并不一致，暗示其可通過多種途徑來抑制銅綠假單胞菌生物被膜的形成。