胰激肽原酶對血管損傷后再狹窄內(nèi)膜增殖與凋亡的影響

白俐 張林 郭道保

【摘要】 目的：觀察胰激肽原酶對血管損傷后兔血管形態(tài)及MMP-2、TIMP-2、P53蛋白表達(dá)的影響。方法：18只西新蘭兔隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組及胰激肽原酶組，每組6只。通過球囊損傷制備兔腹主動脈損傷模型，并進(jìn)行3周的胰激肽原酶治療，之后觀察血管形態(tài)及檢測MMP-2、TIMP-2、P53蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果：與假手術(shù)組相比，模型組內(nèi)膜增生明顯（P<0.05）;與模型組相比，胰激肽原酶組內(nèi)膜增生有改善（P<0.05）。模型組MMP-2、TIMP-2表達(dá)均較假手術(shù)組升高，胰激肽原酶組MMP-2表達(dá)較模型組下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;胰激肽原酶組TIMP-2表達(dá)與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;模型組P53表達(dá)較假手術(shù)組下降，胰激肽原酶組P53表達(dá)較模型組升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：胰激肽原酶具有抑制血管損傷后內(nèi)膜增生，與促進(jìn)P53蛋白表達(dá)及抑制MMP-2表達(dá)相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 胰激肽原酶 血管損傷 再狹窄 內(nèi)膜增殖

Effects of Pancreatic Kininogenase on Intimal Proliferation and Apoptosis in Restenosis after Vascular Injury/BAI Li， ZHANG Lin， GUO Daobao. //Medical Innovation of China， 2021， 18（12）： 0-020

[Abstract] Objective： To observe the effect of Pancreatic Kininogenase on vascular morphology and MMP-2，

TIMP-2， P53 protein expression in rabbits after vascular injury. Method： A total of 18 rabbits were randomly divided into sham operation group， model group and Pancreatic Kininogenase group， 6 rabbits in each group. The abdominal aortic injury model was prepared by balloon injury and treated with Pancreatic Kiniogenase for 3 weeks. The blood vessel morphology and MMP-2， TIMP-2， P53 protein expression were observed. Result： Compared with the sham group， the intima hyperplasia in model group was obvious （P<0.05）， and compared with the model group， the intimal hyperplasia in the Pancreatic Kininogenase group was improved （P<0.05）. The MMP-2， TIMP-2 expression in the model group were higher than those in the sham operation group， the MMP-2 in the Pancreatic Kininogenase group was lower than that in the model group， and the differences were statistically significant （P<0.05）， and the TIMP-2 expression showed no difference between the Pancreatic Kininogenase group and the model group （P>0.05）. And the P53 expression in the model group was lower than that in the sham operation group， the P53 expression in the Pancreatic Kininogenase group was higher than that in the model group， the differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion： Pancreatic Kininogenase can inhibit intimal hyperplasia after vascular injury， related to promoting P53 protein expression and inhibiting MMP-2 expression.

[Key words] Pancreatic Kininogenase Vascular injury Restenosis Intimal proliferation

First-authors address： Guangzhou Xinhai Hospital， Guangzhou 510000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.12.004

隨著技術(shù)發(fā)展，經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動脈成形術(shù)（PTCA）目前成為治療冠心病常規(guī)療法，但其術(shù)后3～6個月再狹窄（RS）發(fā)生率高，即使使用藥物洗脫支架后再狹窄率仍達(dá)6.4%[1]。故如何防治PTCA術(shù)后再狹窄成為大家探索的熱點話題。其中基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）及其抑制劑（TIMPs）、凋亡相關(guān)因子P53、bcl-2/bax等證實均參與PTCA術(shù)后再狹窄發(fā)生，而近年研究發(fā)現(xiàn)胰激肽原酶有調(diào)控凋亡蛋白、抗纖維化、氧化應(yīng)激等作用，從而對高心病心肌重構(gòu)、腎臟纖維化等產(chǎn)生影響[2-4]。本研究旨在通過胰激肽原酶對兔腹主動脈球囊損傷術(shù)后血管形態(tài)觀察及MMPs、TIMPs、P53檢測而探討其對血管再狹窄影響，為PTCA術(shù)后再狹窄防治提供新的思路。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 本實驗從2019年5月開始人員培訓(xùn)和試劑、動物準(zhǔn)備等前期工作，至2020年11月完成動物實驗、各指標(biāo)檢測及數(shù)據(jù)收集。新西蘭兔，雄性，18只，體重2.5～3.5 kg，平均（2.87±0.51）kg，單籠、恒溫、恒濕度飼養(yǎng)，實驗動物使用許可證號：SYXK（粵）2017-0125。

1.2 藥物與試劑 注射用胰激肽原酶（生產(chǎn)廠家：常州千紅生化制藥股份有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H20023177，規(guī)格：40單位），注射用青霉素鈉（生產(chǎn)廠家：西南藥業(yè)股份有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H50020196，規(guī)格：80萬單位），肝素鈉注射液（生產(chǎn)廠家：天津生物化學(xué)制藥有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H12020505，規(guī)格：

2 mL︰12 500單位），戊巴比妥鈉鹽（生產(chǎn)廠家：廣州鼎國生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)批號：66810240，規(guī)格：25 g/瓶）。

1.3 儀器與器材 3.5 mm×23 mm PTCA球囊擴(kuò)張導(dǎo)管[生產(chǎn)廠家：上海微創(chuàng)醫(yī)療器械（集團(tuán)）有限公司，批準(zhǔn)文號：國食藥監(jiān)械（準(zhǔn)）字2013第3771104號]、生物組織自動脫水機(jī)（生產(chǎn)廠家：泰維科技，型號：TC-120C）、生物組織全自動染色機(jī)（生產(chǎn)廠家：泰維科技，型號：TR-180）、生物組織自動包埋機(jī)（生產(chǎn)廠家：泰維科技，型號：TB-718L）、生物組織自動包埋機(jī)（生產(chǎn)廠家：泰維科技，型號：TB-718D）、輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（生產(chǎn)廠家：徠卡顯微系統(tǒng)有限公司，型號：RM2235）、恒溫攤片烤片機(jī)（生產(chǎn)廠家：泰維科技，型號：TK-218）、顯微鏡（生產(chǎn)廠家：廈門麥克奧迪，型號：AE2000）、離心機(jī)（生產(chǎn)廠家：德國SIGMA，型號：3K15）。

1.4 方法

1.4.1 血管球囊損傷模型建立 術(shù)前12 h禁食，4 h禁水。將3%戊巴比妥鈉鹽（將3 g戊巴比妥鈉鹽溶于100 mL雙蒸水配制獲得）1 mL/kg經(jīng)耳緣靜脈注射麻醉兔，仰臥位固定，無菌條件暴露和分離右股動脈，同時于耳緣靜脈注射肝素鈉注射液100 U/kg，結(jié)扎右股動脈后做一楔形缺口，將3.5 mm×23 mm球囊送入20 cm至腹主動脈膈下處，用壓力泵以

15個大氣壓充盈球囊，回抽球囊至有阻力，到達(dá)股動脈處，釋放球囊內(nèi)壓力，再重復(fù)送入球囊、擴(kuò)張，如此反復(fù)抽拉3次， 30 s/次，間隔1 min。假手術(shù)組除不插入球囊導(dǎo)管外，其余步驟同上。術(shù)后3 d肌內(nèi)注射注射用青霉素鈉80萬單位預(yù)防感染。

1.4.2 分組及給藥 將上述手術(shù)新西蘭兔分為三組，每組6只，分別為假手術(shù)組、模型組、胰激肽原酶組。假手術(shù)組兔不予插入球囊導(dǎo)管損傷腹主動脈，其余兩組行建立血管球囊損傷模型。注射用胰激肽原酶溶于生理鹽水后肌注給藥。假手術(shù)組與模型組給予同體積生理鹽水肌注，胰激肽原酶組給予注射用胰激肽原酶14.4 U/（kg·d）（1 mL/kg）肌注，于術(shù)前1周開始給藥，術(shù)后再連續(xù)給藥2周。兔每周稱體重一次。

1.4.3 標(biāo)本收集 末次給藥后處死兔，先麻醉，然后原位腹主動脈灌注含5 000 U/L肝素的生理鹽水20 min，壓力100 mm Hg，接著用10%甲醛灌注30 min，壓力100 mm Hg，然后分離腹主動脈，剪取每只兔相同部位長約1.5 cm的受損傷腹主動脈血管段，用冰凍生理鹽水清洗血管段，并剪下其中一段置于4%的多聚甲醛中固定，石蠟包埋、切片、HE染色，其余血管段勻漿后3 000 r/min離心10 min取上清，采用ELISA測定血管中P53、MMP-2、TIMP-2蛋白含量。

1.4.4 切片觀察及處理 切片采用顯微鏡進(jìn)行拍照，然后用Image-Pro Plus 6.0的圖像分析軟件對切片照片進(jìn)行圖像分析。首先對圖像進(jìn)行編輯，分別勾選出管腔、內(nèi)彈力膜、外彈力膜的輪廓，然后用工具測出管腔的面積、內(nèi)彈力膜包含的面積、外彈力膜包含的面積，然后通過公式計算：內(nèi)膜面積（I）=內(nèi)彈力膜包含的面積-管腔面積，中膜面積（M）=外彈力膜包含面積-內(nèi)彈力膜包含的面積，并且以I/M來表示球囊損傷后兔腹主動脈內(nèi)膜增生的程度。每組兔的每張切片進(jìn)行5次測量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，多組間均數(shù)比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胰激肽原酶對兔體重的影響 假手術(shù)組、模型組、胰激肽原酶組兔各時間點體重比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表1。

2.2 胰激肽原酶對兔腹主動脈I、M、I/M影響 與假手術(shù)組比較，模型組管腔明顯狹窄，內(nèi)皮下新生內(nèi)膜增厚，其內(nèi)細(xì)胞較正常平滑肌細(xì)胞小，形態(tài)不規(guī)則，排列紊亂。細(xì)胞核多數(shù)呈橢圓或圓形，少數(shù)呈梭形，胞核大小不一。與模型組相比，胰激肽原酶組血管內(nèi)膜增生程度顯著減輕，新生內(nèi)膜纖維結(jié)締組織及平滑肌細(xì)胞均減少，細(xì)胞多呈梭形。見圖1～3。與假手術(shù)組比較，模型組、胰激肽原酶組I、M、I/M均升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;與模型組比較，胰激肽原酶組I、I/M均降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。見表2。

2.3 胰激肽原酶對兔血管中MMP-2、TIMP-2、P53蛋白含量的影響 模型組MMP-2、TIMP-2表達(dá)均較假手術(shù)組升高，胰激肽原酶組MMP-2表達(dá)較模型組下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），TIMP-2表達(dá)與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;模型組P53表達(dá)較假手術(shù)組下降，胰激肽原酶組P53表達(dá)較模型組升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。見表3。

3 討論

胰激肽原酶是一組存在于人體中的絲氨酸蛋白酶，是生物體內(nèi)激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)重要組分，使激肽原釋放激肽而發(fā)揮作用。激肽具有多種生物學(xué)效應(yīng)，包括改善循環(huán)、舒張血管等[5]，故其多用于改善微循環(huán)障礙。有研究發(fā)現(xiàn)，其還有具有促進(jìn)血管新生、抑制氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)、調(diào)控血壓等作用，而在改善梗死后側(cè)支循環(huán)、輸尿管梗阻大鼠腎臟纖維化、高血壓大鼠心肌重構(gòu)等方面發(fā)揮作用，其機(jī)制與胰激肽原酶可調(diào)控凋亡蛋白、增加NO表達(dá)、抑制MMP-2等相關(guān)[2-6]。

PTCA術(shù)后再狹窄是一種血管損傷的修復(fù)反應(yīng)，由多種細(xì)胞因子和生長因子參與介導(dǎo)，主要機(jī)制包括內(nèi)膜損傷后血小板聚集、炎癥反應(yīng)、血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）過度增殖和遷移等[7]。內(nèi)膜增厚和血管重構(gòu)是再狹窄的兩大主要因素[8]。而VSMC增殖、遷移和合成大量細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）在其起到關(guān)鍵性作用[9]?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）及其組織抑制劑（TIMPs）在此過程中發(fā)揮重要作用[10]。MMPs是一種離子依賴性的蛋白酶家族，可由多種細(xì)胞產(chǎn)生[11]。MMP-2、MMP-9作為最主要的明膠酶，通過降解VSMC基底膜基質(zhì)，導(dǎo)致血管VSMC表型發(fā)生改變，使之由中膜向內(nèi)膜遷移并增生，并分泌大量ECM，從而促進(jìn)內(nèi)膜增生、血管重構(gòu)，最終導(dǎo)致 RS的發(fā)生[12]。在生物體內(nèi)，TIMPs為MMPs的主要抑制因子。正常情況下MMP、TIMPs以1︰1的分子比例非共價結(jié)合，而其表達(dá)不平衡與RS發(fā)生緊密相關(guān)[13]。Koike等[14]研究證實TIMP-2通過抑制膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1和MMP2從而抑制血管RS形成。本研究中通過ELISA法測定MMP-2、TIMP-2含量，在假手術(shù)組中，仍含有少量MMP-2、TIMP-2，且兩者比例相近。與假手術(shù)組相比，模型組MMP-2、TIMP-2明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），且兩者升高程度不協(xié)同，MMP-2升高更明顯，考慮此時期MMP-2在VSMC增殖、遷移過程中發(fā)揮重要作用，模型組內(nèi)膜增生明顯。與周曉莉等[15]實驗結(jié)果相同。胰激肽原酶組與模型組相比，內(nèi)膜增生程度顯著改善，MMP-2水平降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），對TIMP-2水平無明顯影響，考慮胰激肽原酶通過降低MMP-2水平，減少VSMC增殖、遷移，改善內(nèi)膜增生。

已有研究表明，在PTCA術(shù)后內(nèi)膜增生過程中細(xì)胞凋亡始終參與其中[16-17]。其與細(xì)胞增殖相伴隨，兩者的抗衡決定內(nèi)膜厚度及細(xì)胞數(shù)量[18]。血管損傷后，細(xì)胞增殖率大于細(xì)胞凋亡率致再狹窄發(fā)生。血管在球囊損傷后，在血管活性因子和生長因子等多種因素作用下抑癌基因活性受抑制，激活原癌基因，細(xì)胞增殖信號啟動，而凋亡不足，導(dǎo)致再狹窄發(fā)生。其中P53是研究較多的抑癌基因，其在血管損傷后促細(xì)胞凋亡，抑制RS發(fā)揮重要作用[19]。p53基因編碼細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的關(guān)鍵蛋白， 通過激活p21發(fā)揮抑制cyclins的活性。其編碼的蛋白質(zhì)可以抑制細(xì)胞從G0期進(jìn)入G1和S期，從而抑制細(xì)胞的增殖[20]。在本次研究中發(fā)現(xiàn)，血管損傷后P53蛋白表達(dá)較正常血管減少，考慮在血管受損后抑癌基因表達(dá)減少，促進(jìn)細(xì)胞增殖，致內(nèi)膜增生。予胰激肽原酶處理后，P53蛋白表達(dá)增加，血管內(nèi)膜增殖受到抑制，考慮胰激肽原酶通過促進(jìn)P53蛋白表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制血管RS發(fā)生。

胰激肽原酶通過降低MMP-2水平、促進(jìn)P53蛋白表示，而抑制內(nèi)膜增生及血管重塑發(fā)生，抑制血管損傷后再狹窄。本研究為臨床預(yù)防血管成形術(shù)后再狹窄提供新的思路，而其過程有無對炎性因子（如白介素）及細(xì)胞因子（如NO）影響而發(fā)揮預(yù)防RS作用，可予后續(xù)研究。

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（收稿日期：2021-02-04） （本文編輯：程旭然）