豇豆貯藏期軟腐病病原菌鑒定及其生物學特性研究

洪小雨 李敏 弓德強 高兆銀 楊衍 王義 胡美姣

摘? 要：豇豆是海南最主要的冬季瓜菜之一。2019年，調(diào)查發(fā)現(xiàn)豇豆貯運期間出現(xiàn)一種嚴重的軟腐病。通過病原菌分離、致病性測定、形態(tài)學觀察和分子生物學鑒定，鑒定該病原菌為瓜果腐霉[Pythium aphanidermatum （Edson） Fitzp.]。采用生長速率法對該病原菌生物學特性進行初步研究。結(jié)果表明：該菌菌落適宜生長溫度范圍為30～35 ℃，最適生長溫度為35 ℃，菌落致死溫度為50 ℃、10 min;適宜生長的pH為7.0～9.0，最適pH為9.0;最適碳源為可溶性淀粉;最適氮源為蛋白胨;不同光照條件對菌落生長沒有顯著影響。本研究首次報道瓜果腐霉（P. aphanidermatum）引起豇豆的采后病害。

關(guān)鍵詞：豇豆;瓜果腐霉;鑒定;貯藏期;生物學特性

中圖分類號：S643.4;S435.2? ? ? 文獻標識碼：A

Identification and Biological Characteristics of the Pathogen Causing Postharvest Decay of Cowpea

HONG Xiaoyu1， LI Min1， GONG Deqiang1， GAO Zhaoyin1， YANG Yan2， WANG Yi3， HU Meijiao1*

1. Environment and Plant Protection Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Integrated Pest Management on Tropical Crops， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Haikou， Hainan 571101， China; 2. Tropical Crops Genetic Resources Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China; 3. School of Life and Pharmaceutical Sciences， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China.

Abstract： Cowpea is one of the most important winter vegetables in Hainan. The postharvest decay was occasionally found during storage of cowpea in 2019. The pathogen was confirmed to be Pythium aphanidermatum （Edson） Fitzp. based on cultural features， pathogenicity， morphological characteristics and molecular identification. In this study， the biological characteristics of P. aphanidermatum were preliminarily studied by the mycelium growth rate method. The results showed that the suitable temperature was 30 ℃ to 35 ℃， and the optimum temperature was 35 ℃. The lethal temperature was 50 ℃ for 10 min. The suitable pH value was 7.0 to 9.0， and the optimum pH value was 9.0. The optimal carbon source and nitrogen source were starch and peptone， respectively. Different light had no effect on the colony growth. To our knowledge， this is the first report of P. aphanidermatum caused postharvest decay of cowpea in China.

Keywords： cowpea; Pythium aphanidermatum; identify; storage; biological characteristics

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.04.028

豇豆（Vigna unguiculata）是豆科豇豆屬的耐熱性蔬菜[1]，為海南最主要的冬季瓜菜之一。由于海南氣候炎熱，田間病蟲害發(fā)生嚴重，對豇豆產(chǎn)量和農(nóng)民經(jīng)濟收入造成嚴重影響。目前，對豇豆田間病害有較多報道，Adegbite等[2]報道瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum）可引起豇豆苗期莖腐，造成嚴重減產(chǎn);Falade等[3]和Smith等[4]研究發(fā)現(xiàn)炭疽菌（Colletotrichum dematium）可侵染豇豆根部，引起植株倒伏，致使豇豆產(chǎn)量下降;毛勇等[5]也在調(diào)查中發(fā)現(xiàn)瓜果腐霉（P. aphanidermatum）可引起豇豆莖腐;司鳳舉等[6]發(fā)現(xiàn)豆類煤污尾孢菌（Cercospora vignae）可引起豇豆葉片逐漸變黃、脫落，致使植株早衰，采收期縮短，鮮莢產(chǎn)量降低;程曉東[7]在研究中發(fā)現(xiàn)豇豆單孢銹菌（Uromyces vignae）可引起豇豆植株發(fā)生銹病，導致植株中后期葉片枯黃脫落，有時還引起豆莢病變，嚴重時植株體內(nèi)水分大量流失。Emechebe[8]和Suleiman[9]發(fā)現(xiàn)瓜果腐霉是豇豆苗期最重要的病原菌，可造成豇豆幼苗莖基和根部快速腐爛軟化，從而導致豇豆幼苗大面積死亡。然而迄今，豇豆貯藏期病害鮮有報道。2019年，筆者在豇豆貯藏期間發(fā)現(xiàn)一種病害，其在豇豆貯藏期傳染迅速，造成較大的經(jīng)濟損失。筆者通過分離純化、致病性測定、形態(tài)學觀察和分子生物學鑒定，在確定該病原菌的基礎(chǔ)上進一步研究了該病原菌生物學特性，以期為更好防治豇豆貯藏期病害提供參考。

1? 材料與方法

1.1? 材料

供試材料為購自海南省三亞市崖州區(qū)蔬菜批發(fā)市場，經(jīng)采后處理并裝箱待運輸?shù)慕】掉埂?/p>

1.2? 方法

1.2.1? 癥狀觀察? 將采購回來的豇豆，常溫貯藏定期觀察發(fā)病情況。

1.2.2? 病原菌的分離? 采用組織分離法，在豇豆病健交界處剪取約0.5 cm×0.5 cm大小的組織，先用0.1%升汞酒精浸洗15 s，無菌水沖洗3次，然后移接至PDA平板上，20 h后自菌落邊緣挑取菌絲分離純化，菌株命名為JD-1，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3? 致病性及寄主范圍測定? 果實：挑選豇豆、黃瓜、馬鈴薯、茄子和番茄果實，同種大小相似，外形良好的果實置于保鮮盒中，分別采用刺傷接種和無刺傷接種法，將活化菌餅（Φ=5.0 mm）接在果實上，以接種無菌PDA圓塊作為對照，并用無菌脫脂棉保濕。24 h后移走脫脂棉，定期觀察其發(fā)病情況，拍照并記錄發(fā)病癥狀。

幼苗：豇豆苗和番茄苗置于保鮮盒中，分別采用刺傷接種法和無刺傷接種法，將活化菌餅（Φ=5.0 mm）接于莖基處，以接種無菌PDA圓塊作為對照，并用無菌脫脂棉保濕。24 h后移走脫脂棉，定期觀察其發(fā)病情況，拍照并記錄發(fā)病癥狀。

1.2.4? 形態(tài)學鑒定? 將純化菌株接于PDA平板中央，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，觀察菌落形態(tài)特征。

孢子囊誘導：將活化后的菌株接在豇豆上，待其長滿白色絨毛狀菌絲體，直接鏡檢觀察孢子囊形態(tài)，測量孢子囊大小。

有性器官誘導：將活化菌絲接在馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基（PDA）上，28 ℃培養(yǎng)1個月，鏡檢觀察卵孢子形態(tài)，測量卵孢子大小。

1.2.5? 分子生物學鑒定? 采用CTAB法提取病原菌DNA，利用不同的引物序列（表1）分別對提取的基因組DNA分別進行PCR擴增[10-11]，引物由北京六合華大基因科技有限公司武漢分公司合成。PCR反應(yīng)體系為10×Taq buffer 3 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，10 μmol/L正反引物各3 μL，模板DNA 1 μL，5 U/μL Taq DNA聚合酶0.2 μL，加ddH2O將反應(yīng)體系補至30 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預變性5 min;95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán);72 ℃延伸10 min，12 ℃保存。PCR擴增產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，送往北京六合華大基因科技有限公司武漢分公司測序。將測序所得序列經(jīng)過分析，上傳至Genbank數(shù)據(jù)庫，獲得登錄號。通過BLAST進行同源性比對，下載5000條序列比對結(jié)果，篩選出ITS和COX1兩種基因相似度較高的菌株序列，然后將兩種基因序列首尾相連，形成ITS-COX1聯(lián)合序列，通過MEGA 7.0軟件進行聯(lián)合拼接校正，并構(gòu)建鄰接法（neighbor- joining， NJ）系統(tǒng)進化樹，重復1000次，進行聚類分析。

1.2.6? 不同培養(yǎng)條件對菌落生長的影響? （1）溫度對菌落生長的影響。將活化病原菌用打孔器（Φ=5.0 mm）打菌餅，接病原菌菌餅于9 cm的PDA平板中央，分別放在5、10、15、20、25、28、30、35、40、45 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)20 h，每個處理重復3次，采用十字交叉法測量菌落直徑。

（2）菌落致死溫度的測定。將恒溫水浴鍋溫度設(shè)置為40、45、50、55 ℃共4個溫度梯度，將菌餅移入預熱好的裝有2 mL無菌水的試管中，分別加熱10、20、30 min，迅速冷卻，菌餅接種于PDA平板中央，每個處理重復3次，于35 ℃恒溫培養(yǎng)20 h，觀察菌落生長情況。

（3）pH對菌落生長的影響。用1.0 mol/L HCl和1.0 mol/L NaOH，將已滅菌的PDA培養(yǎng)基pH分別調(diào)至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0共計10個梯度，接種菌餅于不同pH培養(yǎng)基的平板中央，其余方法同1.2.6（1）。

（4）碳源對菌落生長的影響。以查氏（Czapek）培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別以等質(zhì)量的木糖、麥芽糖、果糖、乳糖、葡萄糖、纖維素、可溶性淀粉替代蔗糖配成不同碳源培養(yǎng)基，以不加碳源的查氏培養(yǎng)基作為對照，接種菌餅于不同碳源培養(yǎng)基的平板中央，其余方法同1.2.6（1）。

（5）氮源對菌落生長的影響。以查氏（Czapek）培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別以等質(zhì)量的硫酸銨、氯化銨、脲、蛋白胨、酵母粉、丙氨酸、甘氨酸、纈氨酸替代硝酸鈉配成不同氮源培養(yǎng)基，以不加氮源的查氏培養(yǎng)基作為對照，接種菌餅于不同氮源培養(yǎng)基的平板中央，其余方法同1.2.6（1）。

（6）光照對菌落生長的影響。接菌餅于PDA平板中央，分別進行全光照、10 h光照+10 h黑暗、10 h黑暗+10 h光照、全黑暗，其余方法同1.2.6（1）。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Office 2007軟件進行數(shù)據(jù)整理分析，運用SPSS 17.0軟件計算標準誤和進行顯著性分析。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 癥狀分析

發(fā)病初期豇豆豆莢出現(xiàn)褐色水漬狀病斑，略凹陷，病部有少量白色絨毛狀菌絲體附著，病情擴展迅速，48 h后病部表面被濃密的菌絲體完全覆蓋（圖1A），嚴重時整箱豇豆變軟腐爛（圖1B）。

2.2? 致病力及寄主范圍測定

刺傷接種后，豇豆、黃瓜、茄子、番茄和馬鈴薯均發(fā)病，發(fā)病初期刺傷部位出現(xiàn)淺褐色水漬狀病斑，表面有稀疏的白色菌絲體，48 h后，病部被致密的白色菌絲體覆蓋;馬鈴薯感病初期癥狀較輕，表現(xiàn)為輕微水漬狀病斑，表面有稀疏的白色菌絲體，但后期整個快速變軟腐爛并有臭味。其中接種發(fā)病癥狀與初期觀察到的豇豆腐爛癥狀一致。未刺傷接種處理和對照組均無癥狀（圖2）。

豇豆苗和番茄苗莖基刺傷接種后均發(fā)病，24 h出現(xiàn)暗綠色水浸狀病斑，自病部向上快速發(fā)病，48 h后整株植物倒伏，表面有絨毛狀菌絲層附著，刺傷處略內(nèi)陷。未刺傷接種處理無癥狀，對照均無癥狀（圖2）。

2.3? 形態(tài)學鑒定

將豇豆豆莢上分離出的病原菌進行接種，并重新分離純化，癥狀與原培養(yǎng)菌株形態(tài)一致。該菌在豇豆病豆莢上產(chǎn)生大量的白色絮狀菌絲，有分支、無分隔;菌絲頂生或間生棒狀、姜瓣狀的孢子囊，大小為15.1 ?m×65.2 ?m;在PDA平板上菌落生長迅速，白色絮狀，氣生菌絲茂密;黑暗培養(yǎng)30 d后產(chǎn)生卵孢子，卵孢子光滑球形，頂生，有直柄，不滿器，直徑大小為18.00～18.65 ?m。其形態(tài)與陳秀賢[12]、Calvano等[13]、Hashem[14]、徐作珽等[15]和付崗等[16]描述的瓜果腐霉形態(tài)相似（圖3），初步確定該菌為腐霉屬（Pythium sp.）。

2.4? 分子生物學鑒定

病原菌株經(jīng)過rDNA-ITS測定獲得828 bp片段，特異性引物（COX1）測序獲得1115 bp片段，將其分別上傳到NCBI，獲得登錄號分別為MN911297和MN935645。在GenBank中進行BLAST比對，同源性與P. aphanidermatum達到100%。將ITS序列和COX1基因序列進行聯(lián)合拼接，通過MEGA 7.0軟件進行聚類分析，發(fā)現(xiàn)該菌株與瓜果腐霉聚為一支。

通過形態(tài)學觀察，結(jié)合ITS-COX1基因序列聯(lián)合發(fā)育樹分析，確定引起豇豆貯藏期腐爛的病原菌為瓜果腐霉（P. aphanidermatum）（圖4）。

2.5? 不同培養(yǎng)條件對菌落生長的影響

2.5.1? 不同溫度對菌落生長的影響? 試驗結(jié)果表明，該菌在15～40 ℃范圍內(nèi)均能生長;適宜生長溫度為30～35 ℃，并在35 ℃時生長最快，20 h菌落直徑為6.1 cm，菌絲體厚實致密，30 ℃生長良好，直徑達5.6 cm。但是在5～10 ℃范圍內(nèi)不生長，說明該菌適合在高溫生長（圖5）。

菌絲致死溫度的測定結(jié)果表明，在水溫≤45 ℃，處理10～30 min，菌落均能生長，而溫度在≥50 ℃，處理10 min時，菌落不再生長，表明病菌的致死溫度為50 ℃，處理10 min（表2）。

2.5.2? 不同pH對菌落生長的影響? 試驗結(jié)果表明，該菌在pH為5.0～12.0范圍內(nèi)均能生長，適宜pH范圍為7.0～9.0，菌落生長較快，氣生菌絲發(fā)達，致密。在pH為3.0～4.0時，菌落不生長;隨著pH增加，菌落直徑越來越大;當pH為9時，菌落直徑達最大;pH繼續(xù)增大，菌落直徑逐漸減小。說明該菌適合中性偏堿的條件生長（圖6）。

2.5.3? 不同碳源對菌落生長的影響? 試驗結(jié)果表明，該菌在不同碳源培養(yǎng)基上的生長速率差異較大，在可溶性淀粉培養(yǎng)基生長最快，菌落直徑極顯著高于其他碳源的培養(yǎng)基，20 h直徑達6.2 cm，開始菌絲比較稀薄，3 d后厚實致密。其次在含蔗糖的培養(yǎng)基上生長較好，直徑達5.6 cm，再次為在含纖維素、葡萄糖和乳糖的培養(yǎng)基，在含果糖的培養(yǎng)基上生長最差，而在含木糖和麥芽糖的培養(yǎng)基上不生長，在無碳條件下菌落生長較大，直徑達5.1 cm，但是菌絲一直稀疏（圖7）。

2.5.4? 不同氮源對菌落生長的影響? 試驗結(jié)果表明，該菌在含有不同氮源培養(yǎng)基上均能生長，在含蛋白胨培養(yǎng)基上生長最好，菌絲最茂密，20 h菌落直徑達6.6 cm，極顯著高于其他氮源培養(yǎng)基;其次為含酵母粉的培養(yǎng)基，菌落直徑為6.1 cm;在含甘氨酸和纈氨酸的培養(yǎng)基上生長較差，直徑為4.4 cm;在無氮培養(yǎng)基上菌落生長較快，但菌絲稀疏（圖8）。

2.5.5? 不同光照對菌落生長的影響? 試驗結(jié)果表明，全光照、全黑暗、10 h光照+10 h黑暗、10 h黑暗+10 h光照處理菌落均生長，各處理間的菌落大小沒有顯著差異（圖9）。

3? 討論

腐霉屬自1858年被提出，至今在世界各地報道的約有100多種[17]，中國對于腐霉的研究始于Yu [18]1934年首次報道了第1個腐霉種——瓜果腐霉引起的黃瓜猝倒病。此后有大量報道表明該腐霉菌可引起寄主植物莖腐和根腐[19-21]，嚴重時可導致幼苗大面積枯死腐爛，導致農(nóng)作物減產(chǎn)，對當?shù)亟?jīng)濟產(chǎn)生一定影響。腐霉屬種類較多，形態(tài)多樣，一般可通過其孢子囊、雄器和卵孢子是否滿器等形態(tài)進行初步區(qū)分，陳秀賢[12]研究發(fā)現(xiàn)瓜果腐霉與德里腐霉（P. deliense）形態(tài)相似，二者均有姜瓣狀孢子囊和不滿器的卵孢子，但是瓜果腐霉藏卵器柄較直，雄器較大，同絲生或異絲生，而德里腐霉（P. deliense）柄普遍彎向雄器，雄器較小，多為同絲生。這2種腐霉通過形態(tài)學觀察很難完全區(qū)別，因此采用分子生物學技術(shù)作為輔助鑒定方法不可或缺[22]。本研究在形態(tài)學觀察基礎(chǔ)上，結(jié)合分子生物學手段，確定引起貯藏期豇豆腐爛病的病原菌為瓜果腐霉。

瓜果腐霉除引起多種植物的莖腐和根腐外，還引起葫蘆科果實[23]、茄子[24]、番茄[25]、四季豆[26]、絲瓜[27]、生姜[28]、芋[29]等的采后腐爛。而該菌引起貯藏期豇豆腐爛病則為首次報道。

Thomson等[30]研究結(jié)果表明，瓜果腐霉菌絲在24～37 ℃最易侵染大豆;古麗君等[31]指出該菌最佳溫度為30～35 ℃，最適pH為7.0～8.0，最適碳源為淀粉，最適氮源為脲，黑暗條件有利于對菌落生長;毛勇等[5]研究結(jié)果表明該菌最適碳源和氮源分別是淀粉和磷酸氫二銨;劉志恒等[32]認為該菌在溫度為35 ℃和pH為6.0～8.0時生長最快，光照對菌絲生長影響較小;菌絲致死溫度為51 ℃，處理10 min。而本研究與上述結(jié)論略存在差異，即不同光照條件對瓜果腐霉沒有影響，最適氮源為蛋白胨;此外該菌在溫度范圍為15～40 ℃均能生長，最佳溫度為30～35 ℃，這結(jié)果與古麗君等[31]的結(jié)果基本一致。海南島地處熱帶北緣，四季如夏，平均氣溫為22.4～25.5 ℃[33]，冬季平均溫度亦在18～25 ℃之間。冬季高溫有利于瓜果腐霉快速生長，為豇豆腐爛病的發(fā)生提供了條件。

此外瓜果腐霉主要通過傷口侵染[5]，在運輸過程中減少機械傷是避免腐爛病的關(guān)鍵。目前海南冬季豇豆北運多采用泡沫箱加冰水進行低溫貯運，有利于豇豆保鮮的同時抑制病原菌擴展。但仍需在采摘、清洗、包裝及銷售環(huán)節(jié)減少機械傷害和溫度升高，從而避免和降低貯運期間豇豆腐爛病的發(fā)生。

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