基于SRAP分子標記的特早熟荔枝種質(zhì)資源遺傳多樣性分析

胡福初 吳小波 陳哲 吳鳳芝 周文靜 馮學杰 范鴻雁 周瑞云 王祥和

摘? 要：以22份特早熟、6份早熟及2份中熟荔枝種質(zhì)資源為材料，利用SRAP分子標記進行遺傳多樣性分析，探索特早熟荔枝種質(zhì)資源的親緣關系。結果表明：對182對SRAP引物組合進行篩選，獲得16對多態(tài)性高、條帶清晰的SRAP引物組合，共計產(chǎn)生擴增條帶182條，其中多態(tài)性條帶140條，占76.9%。材料間遺傳相似系數(shù)為0.47～0.99，根據(jù)UPGMA聚類分析，在遺傳相似系數(shù)0.73處可將30份荔枝樣本分成4類，其中第Ⅰ類20份，占66.7%，包括絕大多數(shù)特早熟荔枝資源;第Ⅱ類4份，占13.3%，包括‘妃子笑與部分雜交早熟資源;第Ⅲ類和第Ⅳ類各3份，分別占10%。以上研究結果為特早熟荔枝種質(zhì)資源發(fā)掘、評價及新品種培育提供理論參考。

關鍵詞：荔枝;SRAP標記;特早熟;遺傳多樣性

中圖分類號：S667.1? ? ? 文獻標識碼：A

Genetic Diversity Analysis of Very Early Maturing Litchi Germplasm Resources Based on SRAP Molecular Markers

HU Fuchu， WU Xiaobo， CHEN Zhe， WU Fengzhi， ZHOU Wenjing， FENG Xuejie， FAN Hongyan， ZHOU Ruiyun， WANG Xianghe*

Institute of Tropical Fruit Trees， Hainan Academy of Agricultural Sciences / Key Laboratory of Tropical Fruit Tree Biology of Hainan Province / Haikou Investigation Station of Tropical Fruit Trees， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Haikou， Hainan 571100， China

Abstract： Utilizing the SRAP molecular markers technology， the genetic diversity and relationship of 30 litchi germplasm resources， including 22 extremely early maturity varieties， 6 early maturity varieties and 2 middle maturity varieties， were analyzed in this study. The results showed that 16 pairs SPAP primers with high polymorphism and clear bands were selected in 182 pairs SPAP primers. A total of 182 loci were obtained using 16 pairs SPAP primers and 140 loci were polymorphic. UPGMA cluster analysis and genetic similarity coefficient showed that the similarity coefficient of 30 litchi germplasm resources ranged from 0.47 to 0.99， and 30 resources could be grouped into four distinct families based on similarity of 0.73. There were 20 （66.7%） resources in groupⅠ， including the majority of extremely early maturing resources， 4 （13.3%） resources in group Ⅱ， including ‘Feizixiao and some hybrids， 3 （10.0%） resources respectively in group Ⅲ and group Ⅳ. The results would provide theoretical references for the exploration， evaluation and new variety cultivation of extra-early litchi germplasm resources.

Keywords： litchi; SRAP; very early maturing; genetic diversity

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.04.002

荔枝（Litchi chinensis Sonn.）為無患子科（Sapindaceae）荔枝屬（Litchi Sonn.）多年生常綠喬木，在我國熱帶亞熱帶地區(qū)廣泛栽培，具有十分悠久的種植歷史。近年來，我國荔枝產(chǎn)業(yè)發(fā)展興旺，總面積穩(wěn)定保持在5.4×105 hm2，產(chǎn)量超過2.0×106 t，已成為一些區(qū)域鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略的重要抓手，也是連接“一帶一路”戰(zhàn)略的一個紐帶[1]。在荔枝產(chǎn)業(yè)優(yōu)勢區(qū)域布局及新品種新技術的推動下，我國荔枝已經(jīng)形成了早熟、中熟、中晚熟、晚熟、特晚熟的生產(chǎn)格局，果實成熟期從4月中旬延續(xù)至8月中下旬[2]。其中，早熟產(chǎn)區(qū)包括海南、粵西、桂南及云南部分產(chǎn)區(qū)，早熟品種主要有‘妃子笑‘白糖罌‘三月紅‘桂早荔等，而‘妃子笑‘白糖罌在早熟品種中占有絕對的主導作用，例如在海南產(chǎn)區(qū)，‘妃子笑占種植面積的90%以上。需冷量低的早熟優(yōu)良品種缺乏，導致早熟產(chǎn)區(qū)品種結構過于單一，往往造成果實產(chǎn)期集中，給銷售帶來較大壓力。因此，開展早熟荔枝種質(zhì)資源的發(fā)掘、鑒定評價及新品種培育，對于增加早熟品種的遺傳多樣化類型、優(yōu)化荔枝品種結構具有重要意義[3]。

采用分子標記技術對荔枝種質(zhì)資源遺傳多樣性分析，前人已經(jīng)開展了大量的研究。丁曉東等[4]利用RAPD分子標記鑒定了34個荔枝品種的親緣關系，基于37個多態(tài)性RAPD標記將34個品種分為4類。李明芳[5]利用22個荔枝特異性SSR標記對37個荔枝種質(zhì)和2個龍眼品種進行了遺傳多樣性分析。彭宏祥等[6]利用AFLP標記對27份廣西優(yōu)稀荔枝資源進行了遺傳多樣性及分類研究。鄧穗生等[7]應用RAPD方法對海南60份野生荔枝進行基因組多態(tài)性分析，并通過聚類分析將其分為6類。昝逢剛等[8]采用SRAP標記分析了海南46份荔枝種質(zhì)的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)相似系數(shù)為0.469～0.838，在0.644處可將46份資源劃分為4個類群。向旭等[9]利用EST-SSR分子標記對96份荔枝種質(zhì)資源進行遺傳多樣性分析，將96份荔枝種質(zhì)資源分成了8大類群。劉忠等[10]采用SRAP標記對岷江下游41份荔枝古樹和3份合江荔枝進行分析，相似系數(shù)為0.5586～0.9279。李煥苓等[11]基于SSR和InDel標記對232份主要來自海南的荔枝種質(zhì)資源進行遺傳多樣性分析，在遺傳相似系數(shù)為0.76處將供試材料分為15類。以上研究表明，采用分子標記技術對荔枝種質(zhì)資源遺傳多樣性及親緣關系進行鑒定，具有較好的準確性和可行性。

然而，關于特早熟荔枝種質(zhì)資源的遺傳多樣性卻少有研究。近年來，我國特早熟荔枝種質(zhì)資源調(diào)查搜集與鑒定評價工作已經(jīng)取得了一定的進展，為后續(xù)特早熟優(yōu)良新品種的選育提供了材料。早期的調(diào)查顯示，廣西的崇左、百色和河池等地有較長的早熟荔枝種植歷史，并且集中分布著比較豐富的早熟實生種質(zhì)資源[12]。歐陽若等[13]在廣西和廣東調(diào)查分別發(fā)現(xiàn)‘桂紅‘早荔果等特早熟古樹荔枝，并通過自然授粉和雜交育種等方式獲得了一批特早熟的育種中間材料。沈慶慶等[14-15]對桂西南早熟荔枝實生資源進行了系統(tǒng)調(diào)查，對部分早熟荔枝實生單株進行了鑒定評價，基于ISSR標記開展了遺傳多樣性分析，為當?shù)卦缡熨Y源發(fā)掘、保護和利用提供了依據(jù)。朱建華等[16]通過實生選育，獲得了特早熟優(yōu)良品種‘桂早荔，并在海南陵水地區(qū)試種成功。此外，在云南‘褐毛荔中也發(fā)現(xiàn)了大量的特早熟資源，據(jù)報道，‘元陽2號和‘元矮一號都具有特早熟的特性，其中‘元陽2號在元陽當?shù)氐某墒炱谠?月下旬至5月中旬[17]。然而，與豐富的中晚熟荔枝資源相比，我國特早熟荔枝種質(zhì)資源相對匱乏，且遺傳背景比較單一[13]。為了系統(tǒng)地研究特早熟荔枝種質(zhì)資源遺傳多樣性和親緣關系，本研究以國內(nèi)外收集的30份荔枝種質(zhì)資源為材料，包括特早熟種質(zhì)22份，早熟種質(zhì)6份，中熟種質(zhì)2份，通過SRAP分子標記確定供試種質(zhì)資源間的遺傳背景差異，為構建特早熟荔枝雜交育種模式及選育優(yōu)良新品種提供研究基礎和理論依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

供試材料全部定植于海南省農(nóng)業(yè)科學院永發(fā)果樹科研創(chuàng)新基地，共計30份荔枝種質(zhì)。以傳統(tǒng)的特早熟品種‘三月紅、早熟品種‘妃子笑及中熟品種‘桂味的成熟期為參照，在正常開花結果情況下，根據(jù)同一基地連續(xù)3 a果實成熟期的表現(xiàn)，確定4月中旬或者之前進入成熟期的資源為特早熟，4月下旬至5月下旬進入成熟期的資源為早熟，6月上旬至6月中旬進入成熟期的資源為中熟。以此劃分，30份荔枝種質(zhì)中，其中特早熟資源22份，早熟資源6份，中熟資源2份。供試種質(zhì)資源的編號與基本信息見表1。分別采集對應種質(zhì)的幼嫩葉片，經(jīng)無菌水清洗后存于?80 ℃冰箱備用。

1.2? 方法

1.2.1? 基因組DNA提取? 采用改良CTAB法提取樣品基因組DNA[18]，通過1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，使用核酸蛋白測定儀（Biorad SmartSpec Plus）進一步檢測DNA純度與濃度，檢測合格后置于?20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2? SRAP-PCR擴增? 選取13條正向引物和14條反向引物（表2），一共組成182對SRAP引物組合，篩選出條帶清晰、多態(tài)性豐富且擴增穩(wěn)定的引物組合進行PCR擴增。SRAP-PCR反應體系參照昝逢剛等[19]的體系并進行優(yōu)化，在20 μL的反應體系中，加入2×Taq PCR Master Mix（含染料）10.0 L，20 ng/L的DNA模板2 L，10 mol/L的正反向引物各0.5 L。擴增程序為：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性1 min，35 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，5個循環(huán);94 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。擴增結束后，使用2.0%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

對30份荔枝樣品的SRAP檢測結果進行分析，相同電泳位置上有條帶記為“1”，無條帶記為“0”，依據(jù)電泳圖譜構建0-1矩陣，通過NTSYSpc-2.1e軟件計算30份荔枝種質(zhì)資源間的遺傳系數(shù)[20]，并采用UPGMA法進行聚類分析，構建樹狀聚類圖。

2? 結果與分析

2.1? SRAP標記多態(tài)性分析

以30份荔枝種質(zhì)資源的DNA為模板進行SRAP-PCR（圖1），從182對引物組合中篩選出條帶清晰、多態(tài)性好的引物組合16對。由表3可知，16對引物組合共計產(chǎn)生擴增條帶182條，其中多態(tài)性條帶140條，多態(tài)性條帶比例76.9%。每對SRAP引物組合擴增產(chǎn)生條帶6～16條，平均每對引物擴增8.5條，其中有11對引物組合的擴增帶達到10條以上，Me4-Em13、Me4-Em14、Me6-Em8、Me6- Em10、Me9-Em3、Me10-Em7、Me10-Em9和Me12-Em1等8對引物擴增條帶數(shù)在12條以上，Me9-Em3組合的引物擴增條帶數(shù)達16條。多態(tài)性條帶比例為41.7%～100%，大多數(shù)引物擴增的多態(tài)性較高，說明SRAP分子標記可用于特早熟荔枝遺傳多樣性及親緣關系分析。

2.2? 遺傳多樣性分析

通過NTSYSpc-2.1e軟件計算出30份荔枝種質(zhì)材料間的遺傳相似系數(shù)，得到遺傳相似系數(shù)矩陣表（表4）。遺傳相似系數(shù)結果顯示，供試荔枝種質(zhì)資源遺傳相似系數(shù)為0.47～0.99，說明供試荔枝種質(zhì)間遺傳變異較大。其中編號03和17遺傳相似系數(shù)最大，親緣關系最近;01和08的遺傳相似系數(shù)最小，親緣關系最遠。值得注意的是，絕大多數(shù)特早熟荔枝種質(zhì)之間的遺傳系數(shù)較大，編號01、02、03、05、06、07、09、10、11、13、15、17、19、20、21、26、28、29等18份特早熟種質(zhì)的親緣關系幾乎都超過了0.85，說明它們之間具有相似的遺傳背景，親緣關系較近。

2.3? 聚類分析

根據(jù)所得到的遺傳相似系數(shù)矩陣，利用NTSYSpc-2.1e軟件的UPGMA法構建聚類樹狀圖（圖2）。聚類分析結果顯示，在遺傳相似系數(shù)0.73處可將供試荔枝材料劃分為4個類群。第Ⅰ類群包括‘A20‘99133‘D13‘早優(yōu)2號‘D14‘早優(yōu)3號‘99111‘三月紅‘B8‘99112‘B7‘B13‘99149‘9918‘A16‘早美人‘D11‘B14‘桂早荔‘褐毛荔等20份種質(zhì)，這20份材料全部為國內(nèi)收集的特早熟資源，說明它們具有相似的遺傳背景，可能直接或間接來自同一種群;此外，‘D13和‘早優(yōu)2號相似系數(shù)高達0.99，有可能屬于同物異名現(xiàn)象。第Ⅱ類群包括‘水東‘妃子笑‘早桂2號‘早糯等4份資源，其中‘早桂2號‘早糯分別是特早熟種質(zhì)與‘桂味和‘糯米糍的雜交后代，在早熟性狀方面具有類似的遺傳背景。第Ⅲ類群包括‘KOM‘紫娘喜和‘Kaloka，其中‘KOM和‘Kaloka均來自于泰國，海南本地品種‘紫娘喜與這2個品種有較近的遺傳關系，該結果還有待于進一步驗證;第Ⅳ類群包括‘桂味‘A4無核荔和‘白糖罌3個品種。來自泰國的特早熟荔枝種質(zhì)‘KOM和‘Kaloka與國內(nèi)收集的特早熟荔枝種質(zhì)親緣關系較遠，遺傳相似系數(shù)為0.57～0.66。

3? 討論

SRAP分子標記具有操作簡單、重復性好、多態(tài)性產(chǎn)率高等優(yōu)點，已經(jīng)廣泛應用于熱帶果樹種質(zhì)遺傳多樣性和親緣關系研究。劉榮等[21]利用SRAP分子標記分析了13份貴州芒果種質(zhì)資源遺傳多樣性;張立杰等[22]開展了16份龍眼及1份龍荔種質(zhì)資源的SRAP遺傳多樣性分析，鑒定出17份材料間的遺傳相似系數(shù)范圍為0.399～0.871;張穎聰?shù)萚23]篩選出28對SRAP引物，完成了20份番木瓜種質(zhì)資源的親緣關系和遺傳多樣性分析。此外，在香蕉[24]、菠蘿[25]、荔枝[19]、菠蘿蜜[26]、西番蓮[27]、澳洲堅果[28]等果樹上也有相關報道。以上研究表明，SRAP分子標記技術能較好地反映樣本間的遺傳變異，可用于開展特早熟荔枝種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析。

本研究以30份特早熟荔枝為主的荔枝種質(zhì)資源為材料，包括22份特早熟資源，6份早熟資源和2份中熟資源，分別來自云南、廣西、廣東、海南等荔枝起源地，其中2份特早熟種質(zhì)來自泰國本地資源，資源采集的區(qū)域具有一定的覆蓋范圍和代表性。從182對SRAP引物中篩選出引物組合16對用于擴增，獲得182條擴增條帶，其中多態(tài)性條帶140條，多態(tài)性條帶比例76.9%，遺傳相似系數(shù)為0.47～0.99，0.73處可將供試荔枝材料劃分為4個類群;從分子水平來看，遺傳距離的變幅越大，表明樣本的遺傳分化越大，遺傳多樣性越高，遺傳背景越復雜[29]，說明供試的30份荔枝材料間具有較豐富的遺傳多樣性。

聚類結果顯示，共有20份特早熟荔枝歸屬于同一大類，包括‘三月紅‘桂早荔‘褐毛荔‘9918等國內(nèi)起源的所有特早熟種質(zhì)及部分培育的育種材料。該結果進一步說明了我國特早熟荔枝種質(zhì)資源相對匱乏，現(xiàn)有種質(zhì)的特早熟性狀可能主要來自云南‘褐毛荔群落，從而導致這些資源具有較為相似的遺傳背景，這給特早熟荔枝新品種的選育帶來了一定的限制。來自廣西的‘桂早荔與‘褐毛荔和‘三月紅都具有很高的遺傳相似性（0.84和0.82），而朱建華等[16]通過ISSR分子標記鑒定‘桂早荔與‘黑葉親緣關系最近，遺傳相似系數(shù)為0.88，意味著‘黑葉與‘褐毛荔可能同樣具有較強的親緣關系。此外，‘水東‘妃子笑‘早桂2號‘早糯等4份早熟種質(zhì)聚為一類，具有相似的遺傳背景，且由于‘早桂2號和‘早糯分別是特早熟‘桂味和‘糯米糍的雜交后代，因而推測‘水東和‘妃子笑也可能是特早熟資源與中晚熟品種通過自然雜交獲得的早熟品種。起源于海南的本地品種‘紫娘喜和‘A4無核荔分別聚在第Ⅲ類和第Ⅳ類，二者的遺傳相似性為0.73，一定程度上反映了海南荔枝具有較豐富的遺傳多樣性。來自泰國的特早熟品種‘KOM和‘Kaloka與國內(nèi)特早熟種質(zhì)的遺傳相似系數(shù)較低，為0.57～0.66，說明它們之間存在較明顯的基因型差異。根據(jù)遺傳學研究，在一定范圍內(nèi)，雙親的遺傳差異越大，其后代的分離幅度也就越廣，從而得到優(yōu)良后代的機會也就越多[30]，預示著這2個泰國品種參與特早熟荔枝新品種的選育，將有助于豐富雜交后代的變異程度。

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責任編輯：謝龍蓮