郝雪潔,陳赫,周效寶,張步云,張安然,王瑞,張海東
1.山東省職業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)病防治研究院,山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院),山東 濟(jì)南 250062
2.青島阜外心血管病醫(yī)院,山東 青島 266034
3.濟(jì)寧市精神病防治院(濟(jì)寧市職業(yè)病醫(yī)院),山東 濟(jì)寧 272051
4.山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院(基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所),山東 濟(jì)南 250062
矽肺是塵肺中最為常見(jiàn)的一種類型,是由于長(zhǎng)期吸入大量游離二氧化硅(SiO2)粉塵所引起,以肺部廣泛的結(jié)節(jié)性纖維化為主的疾病。對(duì)于矽肺的發(fā)病機(jī)制,細(xì)胞因子學(xué)說(shuō)認(rèn)為,SiO2進(jìn)入肺部后被肺泡巨噬細(xì)胞吞噬,巨噬細(xì)胞受到刺激,從而產(chǎn)生大量細(xì)胞因子,如白細(xì)胞介素-1、腫瘤壞死因子-α、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)等,其中TGF-β1被認(rèn)為是最重要的致纖維化因子,可與下游多種蛋白形成信號(hào)通路誘導(dǎo)塵肺病的發(fā)生[1]。因此,阻斷TGF-β1與下游蛋白的聯(lián)系成為研究矽肺臨床治療的一個(gè)重要途徑。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)家族是TGF-β1 的重要下游激酶,可刺激肺纖維化的形成,細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶5(excellular signal-regulated kinase 5,ERK5)是MAPK 家族最后一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的亞族,其對(duì)肺纖維化的作用少有研究,國(guó)內(nèi)尚未有明確研究證明TGF-β1/ERK5 信號(hào)通路在肺纖維化中的作用,國(guó)外也僅有少量報(bào)道證明體外實(shí)驗(yàn)中TGF-β1/ERK5 信號(hào)通路對(duì)肺纖維化有影響[2]。本研究擬通過(guò)Disitertide 抑制大鼠體內(nèi)TGF-β1 與其受體的結(jié)合,觀察TGF-β1/ERK5信號(hào)通路在肺纖維化中的作用。
選取SPF 級(jí)Wistar 健康雄性大鼠21 只(購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司),年齡為6~7 周,體重為240~260 g,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)為37009200019540號(hào)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于山東省職業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)病防治研究院SPF 屏障動(dòng)物房,許可證號(hào):SYXK(魯)20140012,溫度21~25℃,相對(duì)濕度45%~65%,晝夜交替時(shí)間為12 h/12 h,飼養(yǎng)期間動(dòng)物自由攝食、飲水。飼養(yǎng)條件符合GB 14925—2010《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境及設(shè)施》有關(guān)要求。本研究經(jīng)山東省職業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)病防治研究院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(審批號(hào):2019-16)。
偏振光顯微鏡(日本尼康有限公司),灰度分析 軟件(美國(guó)Alpha Innotech 公 司),SiO2粉 塵(美國(guó)Sigma 公司),ELISA 檢測(cè)試劑盒(中國(guó)武漢華美生物工程有限公司),TGF-β1 抑制劑Disitertide(美國(guó)MCE 公司),兔抗鼠絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase kinase,MEKK)2、MEKK3、磷酸化絲裂原活化蛋白激酶激酶5(phospho-mitogen activated protein kinase kinase 5,P-MEK5)(英國(guó) Abcam 公司),兔抗鼠磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶5(phospho-excellular signal-regulated kinase 5,P-ERK5)(德國(guó)CST 公司),IRDye680RD 羊抗兔抗體(美國(guó)Li-COR 公司),BCA 蛋白定量檢測(cè)試劑盒(中國(guó)武漢塞維爾生物科技公司)。
大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d 后,隨機(jī)分為對(duì)照組(7 只)、模型組(7 只)和干預(yù)組(7 只)。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的NaCl 溶 液配制100 mg·mL-1的SiO2粉 塵(質(zhì)量分 數(shù)80%,粉塵粒徑為1~5 μm)懸浮液,采用一次性非暴露氣管染塵法建造大鼠急性矽塵暴露模型,對(duì)照組大鼠經(jīng)同樣的方法氣管灌注1 mL 滅菌生理鹽水。造模完成24 h后,干預(yù)組大鼠腹腔注射Disitertide溶液0.8 mL(1 mg Disitertide粉末溶解于1 mL DMSO和9 mL生理鹽水混合液中),模型組大鼠腹腔注射同比例溶劑0.8 mL(1 mL DMSO混合9 mL生理鹽水),每3 d注射一次,共注射9 次。此染毒劑量和染毒頻率的成本較低且能較好地抑制TGF-β1 表達(dá)[3]。每天觀察大鼠一般情況,記錄大鼠體重變化。
造模后28 d,各組大鼠腹腔注射體積分?jǐn)?shù)為10.0%的水合氯醛溶液麻醉,以心臟取血法處死,取肺組織稱重。稱重后取大鼠左肺上葉同一部位制備石蠟標(biāo)本,用4℃、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的氯化鈉溶液沖洗后,立即置于體積分?jǐn)?shù)為4.0%的多聚甲醛溶液中固定24 h 以上,常規(guī)取材脫水、石蠟包埋,左肺行HE 染色、Masson染色,以3D Histech 掃描儀掃描病理切片,觀察大鼠肺組織病理學(xué)改變情況。
剪取大鼠右肺下葉組織100 mg 放在離心管中置于碎冰上,研磨成漿,用RIPA蛋白裂解液抽提總蛋白,通過(guò)蛋白定量試劑盒,采用Brandford 法進(jìn)行蛋白定量。每個(gè)樣取20 μg 在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯凝膠中電泳、轉(zhuǎn)膜。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的脫脂奶粉封閉2 h 后與一抗抗體孵育過(guò)夜,第二天與二抗抗體孵育1 h 后成像。
將血漿用離心機(jī)以3 000~3 500 r·min-1離心5 min(離心半徑10 cm),取上清液,按照ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,檢測(cè)細(xì)胞因子TGF-β1 水平。
采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)服從正態(tài)分布,以±s描述,多組間均數(shù)比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料的方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t方法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05(雙側(cè))。
造模后第3 天時(shí),對(duì)照組、模型組和干預(yù)組體重差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05);第14 天時(shí),與對(duì)照組大鼠相比,模型組和干預(yù)組大鼠體重降低(P< 0.05),與模型組相比,干預(yù)組大鼠體重升高(P< 0.05);第28 天時(shí),與對(duì)照組相比,模型組和干預(yù)組大鼠體重均降低(P< 0.05)。第28天時(shí),與對(duì)照組相比,模型組和干預(yù)組肺濕重、肺臟比升高(P< 0.05),與模型組相比,干預(yù)組肺濕重、肺臟比降低(P< 0.05)。見(jiàn)表1。
表1 各組大鼠體重、肺濕重及肺臟比(n=7,±s)Table 1 Body weight, lung wet weight, and lung coefficient of rats (n=7, ±s)
表1 各組大鼠體重、肺濕重及肺臟比(n=7,±s)Table 1 Body weight, lung wet weight, and lung coefficient of rats (n=7, ±s)
[注]a:與同時(shí)間對(duì)照組比,P < 0.05;b:與同時(shí)間模型組比,P < 0.05。
組別體重/g肺濕重/g 肺臟比第3天 第14天 第28天對(duì)照組 282.29±5.71 367.86±9.56 389.29±15.78 1.65±0.10 0.42±0.03模型組 288.29±13.38 331.00±16.21a 356.29±25.23a 3.12±0.36a 0.88±0.09a干預(yù)組 281.14±9.81 350.86±15.81ab 361.14±11.78a 2.73±0.30ab 0.75±0.09ab F 1.01 11.83 6.51 52.94 71.7 P 0.386 0.001 0.007 <0.001 <0.001
第28 天時(shí),對(duì)照組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)清晰,肺泡壁薄,組織結(jié)構(gòu)正常(圖1A);模型組大鼠肺組織呈肺氣腫樣改變,肺泡壁增厚,肺泡腔大小不一,局部可見(jiàn)單核細(xì)胞聚集成團(tuán)(圖1B);干預(yù)組大鼠組織肺泡壁略增厚,肺泡數(shù)較模型組增多,有輕微肺氣腫樣改變(圖1C)。見(jiàn)圖1。
圖1 大鼠肺組織HE染色結(jié)果Figure 1 HE staining results of rat lung tissues
第28天時(shí),對(duì)照組大鼠未見(jiàn)明顯的藍(lán)色膠原產(chǎn)生(圖2A);模型組可見(jiàn)藍(lán)色膠原分布,且有明顯纖維性結(jié)節(jié)產(chǎn)生(圖2B);干預(yù)組大鼠肺組織內(nèi)有少量藍(lán)色膠原分布,有少量且小的結(jié)節(jié)產(chǎn)生(圖2C)。見(jiàn)圖2。
圖2 大鼠肺組織Masson染色結(jié)果Figure 2 Masson staining results of rat lung tissues
Western blotting 檢測(cè)結(jié)果顯示,各組大鼠肺組織中MEKK2、MEKK3、P-MEK5、P-ERK5 蛋白表達(dá)水平均發(fā)生改變。與對(duì)照組相比,模型組和干預(yù)組大鼠肺組織各蛋白表達(dá)水平均升高(P< 0.05);與模型組相比,干預(yù)組大鼠MEKK2、MEKK3、P-MEK5、P-ERK5 蛋白表達(dá)水平均降低(P< 0.05)。見(jiàn)圖3、表2。
圖3 各組大鼠肺組織中相關(guān)蛋白的表達(dá)Figure 3 Relative expression levels of target proteins in lungtissues of rats
表2 各組大鼠肺組織MEKK2、MEKK3、MEK5、P-ERK5蛋白的相對(duì)表達(dá)變化Table 2 Relative expression levels of MEKK2, MEKK3, MEK5, and P-ERK5 in lung tissues of rats
第28天時(shí),對(duì)照組大鼠血清中TGF-β1表達(dá)量為(211.98±25.37)pg·mL-1,模型組為(577.02±35.43)pg·mL-1,干預(yù)組為(274.84±39.42)pg·mL-1。與對(duì)照組相比較,模型組、干預(yù)組大鼠血清TGF-β1質(zhì)量濃度升高(P< 0.05),與模型組相比較,干預(yù)組大鼠血清TGF-β1 質(zhì)量濃度降低(P< 0.05)。
本實(shí)驗(yàn)采用一次性非暴露式氣管灌注法建立大鼠矽肺模型,通過(guò)Disitertide 抑制TGF-β1 的表達(dá),模型組大鼠肺濕重和肺臟比較對(duì)照組升高,干預(yù)組較模型組降低,HE、Masson染色后,模型組可見(jiàn)纖維性結(jié)節(jié)形成,干預(yù)組較模型組結(jié)節(jié)小且少,這與高芳瑜等[4]研究結(jié)果類似,表明矽肺模型造模成功。
研究表明,SiO2進(jìn)入機(jī)體后與效應(yīng)因子相互作用,活化細(xì)胞因子TGF-β1,TGF-β1 作為重要的促肺纖維化調(diào)控因子,可以促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞過(guò)度增殖及細(xì)胞外基質(zhì)的聚集,導(dǎo)致組織結(jié)構(gòu)破壞,當(dāng)纖維化程度加重時(shí),TGF-β1 表達(dá)增多[5-6]。ERK5 是TGF-β1 的下游信號(hào)分子,幾乎在所有細(xì)胞中都有表達(dá),能夠被一些有絲分裂原和細(xì)胞應(yīng)激等刺激因素激活。例如,當(dāng)生長(zhǎng)因子、氧化或高滲透壓發(fā)生變化時(shí),細(xì)胞外信號(hào)首先刺激MEKK2/MEKK3,然后磷酸化MEK5,P-MEK5再激活ERK5,P-ERK5 從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核,從而將信號(hào)從細(xì)胞外傳遞到細(xì)胞內(nèi),以活化底物[7]。Kadoya 等[2]通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1/ERK5 信號(hào)通路對(duì)肺纖維化有促進(jìn)作用,為探討體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中TGF-β1/ERK5 信號(hào)通路對(duì)矽肺纖維化的影響,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Disitertide展開(kāi)研究。
Disitertide 是一種肽型TGF-β1 抑制劑,用于阻斷與其受體的相互作用。Yang 等[8]采用Disitertide 研究發(fā)現(xiàn),miR-590 可以通過(guò)TGF-β1/磷脂酞肌醇3 激酶(phosphatidyl inositol 3 kinase,PI3K)/絲氨酸蘇氨酸激酶(silk threonine protein kinase,Akt)信號(hào)通路的傳導(dǎo)介導(dǎo)骨關(guān)節(jié)炎并調(diào)節(jié)骨細(xì)胞凋亡;He 等[9]采用Disitertide 研究發(fā)現(xiàn),間充質(zhì)干細(xì)胞在晚期胃癌耐藥性的形成中起著重要作用,而作用于TGF-β1 信號(hào)通路可能是抑制這種化學(xué)耐藥性的潛在策略。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Disitertide 可以有效抑制TGF-β1 的表達(dá),為本實(shí)驗(yàn)研究提供依據(jù)。
本研究TGF-β1含量測(cè)定結(jié)果顯示,干預(yù)組較模型組TGF-β1表達(dá)大量減少,表明Disitertide效果較好,可達(dá)到抑制TGF-β1表達(dá)的目的。與對(duì)照組相比,模型組和干預(yù)組MEKK2、MEKK3、P-MEK5、P-ERK5 的表達(dá)量均出現(xiàn)明顯升高,提示ERK5及其相關(guān)蛋白可能與肺纖維化的進(jìn)展密切相關(guān);與模型組相比,干預(yù)組各蛋白表達(dá)均有下降,提示與Disitertide 阻斷了TGF-β1/ERK5信號(hào)通路中MEKK2、MEKK3、P-MEK5、P-ERK5 的表達(dá)有關(guān),結(jié)合大鼠肺部病理學(xué)觀察,證明TGF-β1/ERK5信號(hào)通路對(duì)大鼠矽肺纖維化有影響,抑制TGF-β1/ERK5信號(hào)通路,可能對(duì)急性矽塵暴露導(dǎo)致的肺部損傷起一定的保護(hù)作用。
本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),在大鼠矽肺纖維化進(jìn)程中,抑制TGF-β1 能夠抑制ERK5 等相關(guān)蛋白表達(dá),這與Badshah 等[10]的研究結(jié)果類似;Disitertide 在抑制肺泡炎、肺纖維化、膠原纖維方面和調(diào)控TGF-β1/ERK5信號(hào)通路中各蛋白表達(dá)方面都起著顯著作用,證明了抑制TGF-β1/ERK5 信號(hào)通路能夠抑制矽肺纖維化,這為矽肺的臨床防治提供了新的指標(biāo)。在生產(chǎn)生活中,矽肺纖維化患者多為反復(fù)吸入游離SiO2粉塵,因而抑制TGF-β1/ERK5 信號(hào)通路對(duì)矽肺纖維化患者能發(fā)揮多少作用尚未可知,且本實(shí)驗(yàn)為通過(guò)抑制TGF-β1 來(lái)抑制ERK5,關(guān)于直接抑制ERK5 能否減緩矽肺纖維化尚缺乏有效實(shí)驗(yàn)。此研究為初步研究,若想證明臨床上長(zhǎng)期應(yīng)用TGF-β1 抑制藥物或ERK5 抑制藥物能否延緩或減輕矽肺纖維化以及是否會(huì)引起副作用,有待進(jìn)一步研究。