梔子總環(huán)烯醚萜對抑郁模型小鼠神經遞質的影響

曲書閱衡 霞戚懿予葛平原楊念云朱華旭茅向軍張啟春

（1.貴州中醫(yī)藥大學，貴州 貴陽550025； 2.南京中醫(yī)藥大學，江蘇省中藥資源產業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇南京210023； 3.南京中醫(yī)藥大學，江蘇省植物藥深加工工程中心，江蘇 南京210023； 4.南京中醫(yī)藥大學，江蘇省中藥藥效與安全評價重點實驗室，江蘇 南京210023； 5.貴州省食品藥品檢驗所，貴州 貴陽550004）

抑郁癥是一種由生物學、心理、遺傳、社會和家庭因素引發(fā)的疾病，主要表現為自卑、快感不足、無價值感、自殺念頭等癥狀［1］，并具有易發(fā)病、易致殘、易反復的特點［2］。臨床上以西藥治療為主，但有不良反應、依從性差、易復發(fā)等缺點［3］。因此，越來越多的研究人員將目光投向于中草藥，中藥成分多、靶點多、作用多的優(yōu)點，在藥物開發(fā)和臨床治療中具有良好的應用前景［4］。抑郁癥發(fā)病機制復雜，主要與神經遞質、神經營養(yǎng)因子以及炎癥因子有關。神經遞質在突觸傳遞中是充當“信使”的特定化學物質，對維持人體正常的生理活動具有重要作用［5］，其含量和受體功能的變化可導致抑郁的發(fā)生，主要包括單胺類、氨基酸類和膽堿類神經遞質。

梔子為茜草科植物梔子的干燥成熟果實，具有瀉火除煩，清熱利尿，涼血解毒的作用。總環(huán)烯醚萜作為梔子的主要活性成分，具有抗抑郁、抗炎和保護細胞等作用［6］。研究表明，梔子苷抗抑郁的作用機制可能與小鼠腦組織中單胺類神經遞質五羥色胺水平升高有關［7］。但目前總環(huán)烯醚萜對不同時間點神經遞質的時程性變化還有待研究，因此我們建立了脂多糖誘導的小鼠抑郁模型，探討脂多糖作用后2、6、12、24 h 對小鼠強迫游泳不動時間的影響以及小鼠海馬區(qū)神經遞質的含量變化。

1 材料

1.1 動物 SPF 級雄性ICR 小鼠，體質量18～22 g，由青龍山動物繁殖中心提供，實驗動物生產許可證號SCXK（蘇）2019?0009。在24 h 的明暗周期中自由飲食飲水，溫度（25±1）℃，相對濕度為（60±5）%。

1.2 藥物與試劑 梔子（產地江西，批號160501），購自安徽中州中藥飲片有限公司，經生藥學教授吳啟楠博士鑒定（南京中醫(yī)藥大學藥學院）為茜草科植物梔子Gardenia jasminoidesJ.Ellis 的干燥成熟果實。對照品γ?氨基丁酸（GABA，批號100482?201601）、氯化乙酰膽堿（ACh，批號111597?200331）、鹽酸多巴胺（DA，批 號100070?201507）均購自中國食品藥品檢定研究院；L?谷氨酸（Glu，批號111576?200201）、5?羥色胺鹽酸鹽（5?HT，批號 111656?200401 ）、梔子苷（純 度 98%，批 號FY18380711）均購自中國藥品生物制品檢定所；脂多糖（LPS，美國Sigma 公司）；鹽酸氟西?。ū本┮林Z凱科技有限公司）；甲醇（色譜純，江蘇漢邦科技有限公司）；乙腈（色譜純，美國默克公司）；甲酸（色譜級，阿拉?。?；羧甲基纖維素鈉（CMC?Na，化學純，國藥集團化學試劑有限公司）；95%乙醇（江蘇花廳生物科技有限公司）；AB?8型和HPD100 型大孔吸附樹脂（南京良緯生物科技有限公司）；純水和超純水均為實驗室自制。

1.3 儀器 液相色譜質譜聯(lián)用儀AB Q?Trap 5500（美國AB SCIEX 公司）；Analyst 分析軟件（美國AB SCIEX 公司）；紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；十萬分之一電子分析天平（日本島津公司）；冷凍干燥系統(tǒng)（南京新飛達光電科學技術有限公司）；旋轉蒸發(fā)器（南京金正教學儀器有限公司）；實驗室級超純水儀（南京易普易達科技發(fā)展有限公司）；高速冷凍離心機（南京百奧生物科技有限公司）；全自動樣品快速研磨儀（上海凈信科技有限公司）；渦旋混合器（北京踏錦科技有限公司）。

2 方法

2.1 總環(huán)烯醚萜的提取和純化 稱取梔子500 g，先加5 L水回流提取1.5 h，再加4 L 水回流提取1 h。用紗布過濾后合并濾液，常壓濃縮至生藥濃度為0.2 g／mL 的梔子水提濃縮液。將此溶液過HPD100 和AB?8（2 ∶1）混合型大孔吸附樹脂柱，大孔吸附樹脂柱的徑高比為1 ∶10，洗脫體積流量1.5 mL／min，先用2 BV 蒸餾水洗去雜質，再用70%乙醇洗脫至無色，得到總環(huán)烯醚萜洗脫液［8］。將洗脫液轉入旋轉蒸發(fā)儀中濃縮后放入冷凍干燥機中凍干，得到總環(huán)烯醚萜凍干粉32.79 g。

2.2 總環(huán)烯醚萜含有量測定

2.2.1 標準曲線的制備 精密稱取梔子苷對照品2.72 mg，用甲醇溶解配制成0.054 4 mg／mL 的對照品儲備液。準確吸取對照品儲備液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL 定容于5 mL量瓶中，配制成系列濃度的標準品溶液。以甲醇為參比溶液，用紫外可見分光光度計于238 nm 波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，溶液的濃度為橫坐標，得到線性回歸方程Y＝27.359X＋0.017，相關系數為0.999 9。

2.2.2 含有量測定結果 精密稱取總環(huán)烯醚萜凍干粉3.21 mg，用甲醇溶解于25 mL 量瓶中，再準確吸取2 mL溶液定容于50 mL 量瓶中，得到供試品溶液。用紫外可見分光光度計于238 nm 波長處測定該溶液的吸光度為0.626，求得溶液質量濃度為0.022 26 mg／mL，總環(huán)烯醚萜含量為86.68%。

2.3 造模、分組與給藥 小鼠適應性喂養(yǎng)7 d 后，隨機分為10 組，每組10 只，分別是對照組、鹽酸氟西汀組（2 h?LPS＋鹽酸氟西汀組，20 mg／kg）、4 個LPS 模型組（2 h?LPS 組、6 h?LPS 組、12 h?LPS 組、24 h?LPS 組）和4 個總環(huán)烯醚萜給藥組（2 h?LPS＋環(huán)烯醚萜組、6 h?LPS＋環(huán)烯醚萜組、12 h?LPS ＋環(huán)烯醚萜組、24 h?LPS ＋環(huán)烯醚萜組，90 mg／kg）?？偔h(huán)烯醚萜給藥組和鹽酸氟西汀組分別溶于0.5% CMC?Na 中，各組以0.2 mL／10 g 連續(xù)灌胃7 d，每天1 次，對照組和模型組給予0.5% CMC?Na 溶液。在最后一次給藥后1 h，對照組小鼠腹腔注射生理鹽水，其余小鼠注射0.83 mg／kg LPS。LPS 注射2 h 后，對照組、2 h?LPS＋鹽酸氟西汀組、2 h?LPS＋環(huán)烯醚萜組和2 h?LPS 組進行強迫游泳實驗；LPS 注射6 h 后，6 h?LPS＋環(huán)烯醚萜組和6 h?LPS 組進行強迫游泳實驗；LPS 注射12 h 后，12 h?LPS＋環(huán)烯醚萜組和12 h?LPS 組進行強迫游泳實驗；LPS 注射24 h 后，24 h?LPS＋環(huán)烯醚萜組和24 h?LPS 組進行強迫游泳實驗。

2.4 強迫游泳實驗 將小鼠放入直徑約12 cm、高約25 cm的透明圓筒中，筒內水深15 cm，水溫（25±1）℃，小鼠無法觸碰圓筒底部。用攝像頭記錄小鼠6 min 內的游泳行為，并統(tǒng)計小鼠在后4 min 內的不動時間［9］。

2.5 海馬處理 強迫游泳結束后，立即處死小鼠，冰上分離出海馬組織并于液氮中快速冷凍。精密稱取海馬組織，加入10 倍量冰冷的0.1% 甲酸，勻漿3 min。取勻漿液100 μL，加入冰冷的0.2% 甲酸?乙腈200 μL，渦旋振蕩3 min，在4 ℃冷凍離心機中12 000 r／min 離心10 min，吸取上清液轉入離心濃縮儀中濃縮揮干，0.1% 甲酸水復溶進樣。

2.6 色譜條件 色譜柱InfinityLab Poroshell 120 EC?C18（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）；流動相A 為乙腈，B 為0.1%甲酸；柱溫30 ℃；體積流量300 μL／min；進樣量2 μL；梯度洗脫（0～2 min，98%～95% B；2～3.5 min，95%～40% B；3.5～4 min，40%～98% B；4～6.1 min，98% B）。

2.7 質譜條件 電噴霧離子源（ESI），正離子模式，多反應監(jiān)測（MRM）；毛細管電壓3.0 kV；錐孔電壓30.0 V；離子源溫度150 ℃；脫溶劑溫度500 ℃。質譜離子對信息見表1。

表1 神經遞質的質譜信息

3 結果

3.1 總環(huán)烯醚萜對小鼠強迫游泳不動時間的影響 LPS 注射后，4 個模型組（2、6、12、24 h）小鼠強迫游泳不動時間較對照組升高（P＜0.01），同時，陽性藥鹽酸氟西汀也能縮短小鼠強迫游泳的不動時間（P＜0.01），表明造模成功。與模型LPS 組比較，2 h?LPS＋環(huán)烯醚萜組和6 h?LPS＋環(huán)烯醚萜組均能縮短小鼠不動時間（P＜0.01），12 h?LPS＋環(huán)烯醚萜組和24 h?LPS＋環(huán)烯醚萜組小鼠強迫游泳不動時間無明顯變化（P＞0.05）。表明總環(huán)烯醚萜在LPS 注射后2～6 h 具有抗抑郁作用。見表2。

表2 各組小鼠強迫游泳不動時間的比較（， n＝10）

表2 各組小鼠強迫游泳不動時間的比較（， n＝10）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與2 h?LPS 組比較，＃＃P＜0.01；與6 h?LPS組比較，＆＆p＜0.01。

3.2 方法學考察

3.2.1 線性范圍及定量限 精密稱取5 種神經遞質對照品各2 mg，用0.1%甲酸溶解配制成1 mg／mL 的對照品儲備液。準確吸取5 種對照品儲備液各200 μL，加0.1% 甲酸至10 mL，配制成20 μg／mL 的混合對照品溶液，0.1%甲酸稀釋至5、10、50、100、200、400、500、1 000、2 500、10 000、20 000 ng／mL，各取2 μL 進行LC?MS／MS 分析，并以各神經遞質濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸。見表3。

表3 5 種神經遞質的線性關系及定量限

3.2.2 精密度試驗 配制低、中、高3 種質量濃度（100、500、2 500 ng／mL）的對照品溶液，每個質量濃度6 份，每天測定3 次，連續(xù)3 d，計算日內和日間精密度。結果，GABA、Glu、DA、5?HT、ACh 的日內精密度RSD≤6.06，日間精密度RSD≤6.52，符合分析要求，見表4。

表4 5 種神經遞質的精密度試驗結果（）

表4 5 種神經遞質的精密度試驗結果（）

3.2.3 穩(wěn)定性試驗 取低、中、高濃度的混合對照品溶液，于4 ℃保存，分別在0、2、4、8、12、24 h 進樣分析，各神經遞質對照品RSD≤6.45%，表明4 ℃下24 h 內對照品穩(wěn)定性較好。另取“2.5”項下的同一種腦組織的供試品溶液，于4 ℃保存，分別在0、2、4、8、12、24 h 進樣分析，各腦組織中神經遞質RSD≤6.0%，表明4 ℃下24 h內樣品穩(wěn)定性較好。見表5。

表5 5 種神經遞質的穩(wěn)定性試驗及加樣回收率（）

表5 5 種神經遞質的穩(wěn)定性試驗及加樣回收率（）

3.2.4 加樣回收率試驗 取空白腦組織勻漿液100 μL，加入已知量的各神經遞質混合對照品溶液，配制成100、500、2 500 ng／mL，每個質量濃度樣品數為6 份，按“2.5”項下方法操作，進樣分析，記錄所測峰面積，用A表示。另取空白腦組織勻漿液6 份，每份100 μL，同法處理，離心取上清后分別加入與上述等濃度的混合對照品溶液，放入離心濃縮儀中濃縮揮干，0.1%甲酸復溶進樣，記錄所測峰面積，用B表示，加樣回收率＝（A／B）×100%。結果見表5。

3.2.5 總環(huán)烯醚萜對海馬中神經遞質的影響 混合對照品及樣品中神經遞質色譜圖見圖1。與對照組相比，2 h?LPS組小鼠海馬區(qū)Glu、ACh 升高（P＜0.01），GABA、5?HT、DA 降低（P＜0.01）；與模型LPS 組相比，2 h?LPS＋環(huán)烯醚萜組和6 h?LPS＋環(huán)烯醚萜組中Glu、ACh 降低（P＜0.01），2 h?LPS＋環(huán)烯醚萜組和6 h?LPS＋環(huán)烯醚萜組中GABA、5?HT、DA 升高（P＜0.01），但12 h?LPS＋環(huán)烯醚萜組和24 h?LPS＋環(huán)烯醚萜組中各神經遞質含量變化與模型組相比無明顯變化（P＞0.05）。見圖2～3。

圖1 混合對照品和海馬中各神經遞質色譜圖

圖2 總環(huán)烯醚萜對抑郁小鼠海馬區(qū)神經遞質的影響（n＝10）

圖3 總環(huán)烯醚萜對不同時間點海馬神經遞質的影響（n＝10）

4 討論

脂多糖是革蘭氏陰性細菌細胞外壁的主要成分，能夠誘導機體產生炎性細胞因子［10］，炎性細胞因子通過影響腦中神經傳遞而發(fā)生氧化應激，從而導致抑郁癥［11］。脂多糖注射后會產生心情低落，體質量減輕，食欲不振等癥狀，可用來模擬抑郁癥的行為絕望狀態(tài)［12］。本研究結果顯示，脂多糖注射后，模型組（2、6、12、24 h）小鼠強迫游泳不動時間增加，總環(huán)烯醚萜給藥后，2 h 和6 h 組小鼠強迫游泳不動時間減少，并與鹽酸氟西汀和對照組小鼠不動時間相當，說明LPS 注射后2～6 h 總環(huán)烯醚萜可以改善小鼠的抑郁樣行為。

海馬是大腦邊緣系統(tǒng)的重要腦區(qū)，人體情緒的改變與海馬組織密切相關［13］。在抑郁癥的發(fā)病過程中，海馬區(qū)功能受損，神經遞質的含量會發(fā)生改變。而抗抑郁藥可以保護海馬神經元細胞，促進海馬神經發(fā)生［14］。研究發(fā)現，大腦功能的正常運行依賴于氨基酸類神經遞質的平衡，Glu 經谷氨酸脫羧酶脫羧生成GABA，是中樞神經系統(tǒng)重要的抑制性遞質，具有神經保護作用［15］，當GABA 缺乏時會造成情緒失落［16］。Glu 是中樞神經系統(tǒng)中的興奮性遞質，是腦內含量最多的一種氨基酸。Glu 在正常情況下參與調節(jié)神經系統(tǒng)發(fā)育和學習記憶等過程，但在病理狀態(tài)下表現出神經毒性［17］。唐亞梅等通過慢性不可預知應激模型發(fā)現抑郁模型大鼠中Glu 水平升高［18］，通過調節(jié)Glu／GABA 的比值而起到神經保護的作用。單胺類神經遞質作為中樞神經系統(tǒng)中的興奮性遞質，主要參與情感、睡眠、運動、神經內分泌的調節(jié)［19］，其抗抑郁作用機制與神經遞質的濃度及數量有關。研究表明抑郁模型大鼠可引起5?HT 和DA 含量下降［20］。膽堿能系統(tǒng)參與情緒調節(jié)，抑郁癥通常與膽堿類遞質異常有關［21］。ACh 在運動、感覺、活動、攝食、體溫調節(jié)、睡眠和學習記憶中都起著重要的作用，當ACh 增多、釋放減少時，可出現活動減少，嗜睡等現象［22］。中藥本身具有多成分，多靶點的作用優(yōu)勢，可通過有效物質成分作用于神經遞質，調節(jié)體內各種神經遞質的表達起到抗抑郁作用。

從本實驗結果分析，海馬區(qū)GABA，5?HT，DA 在LPS注射后2 h 和6 h 比給藥組降低，Glu 和ACh 在LPS 注射后2 h 和6 h 比給藥組升高。但在LPS 注射后12 h 和24 h 與給藥組相比各神經遞質含量無明顯變化。表明梔子總環(huán)烯醚萜通過與海馬區(qū)的神經遞質相互作用，調節(jié)不同時間點神經遞質的變化，結合此結果推測小鼠在LPS 注射后2 h～6 h內總環(huán)烯醚萜有較好的抗抑郁作用，6 h 后總環(huán)烯醚萜無抗抑郁作用。產生此種變化的原因可能是由于梔子總環(huán)烯醚萜在體內逐漸代謝，6 h 后藥效逐漸減弱，導致模型組和給藥組沒有差異。

本研究采用LC?MS／MS 法同時測定LPS 誘導的抑郁模型小鼠海馬區(qū)5 種神經遞質的含量變化。結果表明總環(huán)烯醚萜在LPS 注射后2～6 h 具有良好的抗抑郁作用，其作用機制是通過提升海馬區(qū)GABA、5?HT、DA 水平以及降低Glu，ACh 的水平實現的。揭示了總環(huán)烯醚萜對海馬區(qū)神經遞質具有調節(jié)作用，也為臨床上梔子總環(huán)烯醚萜治療抑郁癥提供了實驗依據。