大葉小檗根提取工藝的優(yōu)化

丘 露曲 帥闞 鴻*唐 姍包海鷹王英平

（1.吉林農業(yè)大學中藥材學院，吉林 長春130118； 2.吉林省生物研究所藥用真菌研究室，吉林 長春130012）

大葉小檗性味苦寒，歸肝、胃、大腸經，具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效，內服治療細菌痢疾、腸胃炎、副傷寒、消化不良、黃疸、肝硬化腹水、泌尿系感染、急性腎炎、扁桃體炎、口腔炎、支氣管炎，外用治療中耳炎、目赤腫痛、外傷感染等［1?2］。現代藥理研究表明，小檗堿是從傳統(tǒng)中藥黃連、黃柏中提取出的一種異喹啉類生物堿，在我國擁有悠久的藥用歷史，有著抗病原微生物、抗炎、抗腫瘤、心臟保護、降血糖、調節(jié)脂質代謝、免疫抑制等多種藥理作用［3］。

黃柏因其顯著的藥理價值，已被廣泛用于開發(fā)中成藥及保健品，尤其是以小檗堿為主要成分開發(fā)了很多相關醫(yī)藥產品，但其種植周期長，需要20 年左右才能達到采收的要求，造成市面上資源緊缺，價格不斷攀升，給企業(yè)生產帶來了壓力［4］。為了解決黃柏資源短缺和市場需要的矛盾，需尋找同科屬中研究較少、藥理活性相似的植物，本實驗選擇大葉小檗根作為研究對象。

前期報道，大葉小檗全株含有生物堿，而其根含大量小檗堿及掌葉防己堿、古倫胺堿、藥根堿、刺檗堿，其中小檗堿為主要有效成分之一［5?7］。目前，針對鹽酸小檗堿提取工藝的研究較多，常用方法有酸水提取、酸水滲漉、乙醇回流提取、微波提取、超聲波輔助提取等［8?10］。近年來，國內外對大葉小檗根抗炎、抗腫瘤作用已有報道［11］，但對其所含成分鹽酸小檗堿提取工藝涉及較少，為了更好地開發(fā)利用該部位，本實驗選擇浸膏得率、鹽酸小檗堿提取率的權重和作為評價指標［12?13］對其提取工藝進行優(yōu)化，以期為進一步相關開發(fā)利用奠定基礎。

1 材料

1.1 儀器 ACQUITY 型超高壓液相色譜儀（美國Waters公司）；PH 計（瑞士Mettler?Toledo 公司）；LD5?2A 型臺式低速離心機（北京京立離心有限公司）；KQ?300ES 型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；BT125D 電子天平［賽多利斯科學儀器（北京）有限公司］；HH?S28s 型數顯恒溫水浴鍋（金壇市大地自動化儀器廠）。

1.2 試劑與藥物 大葉小檗根采自吉林臨江大葉小檗基地，經吉林農業(yè)大學包海鷹教授鑒定為小檗科植物大葉小檗Berberis amurensisRupr.的根。鹽酸小檗堿對照品（CAS＃633?65?8，純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司）。磷酸二氫銨［CAS7722?76?1，阿拉丁試劑（上海）有限公司］；磷酸（批號20121121，天津市光復精細化工研究所）；乙腈為色譜純（賽默飛世爾科技有限公司）；甲醇（批號20180711）、乙醇（批號20181008）、鹽酸（批號20121225）為分析純（北京化工廠）；水為純凈水。

2 方法與結果

2.1 供試品溶液制備 精密稱取干燥至恒重的藥材粉末2.003 g，加入一定體積分數乙醇（含0.12 mol／L HCl），50 ℃下超聲（40 kHz、80 kW）提取30 min，冷卻至室溫，乙醇（含0.12 mol／L HCl）補足減失的質量，離心（4 000 r／min）10 min，取上清液，既得。

2.2 浸膏得率測定 按“2.1”項方法制備供試品溶液，精密量取上清液，置于已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，100 ℃下干燥至浸膏狀，置于干燥器中冷卻至室溫，精密稱定質量，計算浸膏得率。

2.3 小檗堿含量測定

2.3.1 色譜條件 參考文獻［14?16］ 報道。Waters AC?QUITY UPLC? BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流動相乙腈（A）?0.01 mol／L 磷酸二氫銨（B）（磷酸調節(jié)pH 至2.8），梯度洗脫（0～10 min，10%～20% A；10～10.1 min，20%～50% A；10.1～14 min，50% A；14～14.01 min，50%～10%A；14.01～16 min，10%A）；體積流量0.5 mL／min；檢測波長345 nm；柱溫35 ℃；進樣量2 μL，色譜圖見圖1。由此可知，供試品溶液中各成分分離度良好，雜質無干擾。

圖1 鹽酸小檗堿UPLC 色譜圖

2.3.2 對照品溶液制備 精密稱取鹽酸小檗堿對照品，甲醇溶解定容至刻度，即得（質量濃度為1 mg／mL），置于冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.3 線性關系考察 吸取“2.3.2”項下對照品溶液，甲醇依次稀釋至10、20、40、60、80 μg／mL，在“2.3.1”項色譜條件下各進樣2 μL 測定。以鹽酸小檗堿質量濃度為橫坐標（X），峰面積積分值為縱坐標（Y）進行回歸，得方程為Y＝33 729X＋51 471（r＝0.999 1），在10～80 μg／mL范圍內線性關系良好。

2.3.4 精密度試驗 取同一份對照品溶液，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定6 次，測得鹽酸小檗堿峰面積RSD為0.18%，表明儀器精密度較好。

2.3.5 重復性試驗 取同一批藥材粉末6 份，按“2.1”項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定，測得鹽酸小檗堿峰面積RSD 為1.73%，表明該方法重復性良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗 取同一批藥材粉末，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，室溫下于0、2、4、8、12、24 h 在“2.3.1”項色譜條件下各進樣2 μL 測定，測得鹽酸小檗堿峰面積RSD 為0.70%，表明溶液在24 h 內穩(wěn)定性良好。

2.3.7 加樣回收率試驗 取“2.1”項下供試品溶液9 份，隨機分成3 組，每組分別精密加入低、中、高質量濃度的對照溶液，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，鹽酸小檗堿平均加樣回收率為106%，RSD為0.511%。

2.4 提取工藝優(yōu)化

2.4.1 提取方法篩選 固定料液比、提取溶劑，以浸膏率、鹽酸小檗堿提取率的綜合評分（浸膏率×50%＋鹽酸小檗堿提取率×50%）為評價指標，考察超聲提取、超聲加酸提取、回流提取、浸漬提取方法的效果，結果見表1。由此可知，超聲加酸提取效率較高，故選擇其作為提取方法。

表1 提取方法篩選結果

2.4.2 單因素試驗 采用超聲加酸提取，篩選乙醇（含0.12 mol／L HCl）體積分 數、料液比、提取時 間，按“2.1”項下方法制備供試品溶液進行考察，結果見圖2。由此可知，乙醇（含0.12 mol／L HCl）體積分數在0～50%范圍內時提取率增加緩慢，在50%～70%范圍內增加較快，隨后又逐漸減緩，故選擇50%～90% 進行考察；料液比在1 ∶10～1 ∶30 范圍內提取率增加緩慢，在1 ∶30～1 ∶50 范圍內增加較快，在1 ∶50～1 ∶100 范圍內趨于緩和，故選擇1 ∶30～1 ∶50 進行考察；提取時間30 min 時提取率最高，故選擇15～45 min進行考察。

圖2 單因素試驗結果

2.4.3 析因設計 以乙醇（含0.12 mol／L HCl）體積分數（A）、料液比（B）、提取時間（C）為影響因素，浸膏率、鹽酸小檗堿提取率的綜合評分（Y）為評價指標，采用析因設計進行篩選，結果見表2，方差分析見表3。由表3 可知，乙醇（含0.12 mol／L HCl）體積分數有極顯著影響（P＜0.01），提取時間有顯著影響（P＜0.05），料液比無顯著影響（P＞0.05），故將料液比確定為1 ∶50，進一步對其他2 種因素進行優(yōu)化。

表2 析因設計結果

表3 析因設計方差分析

2.4.4 最速上升試驗 參考文獻［17］ 報道。由于乙醇（含0.12 mol／L HCl）體積分數（A）、提取時間（B）有顯著影響（P＜0.05），故按兩者效應比例設定路徑和步長，以浸膏率、鹽酸小檗堿提取率的綜合評分（Y）為評價指標，確定基本步長分別為10%、5 min，結果見表4。由此可知，乙醇（含0.12 mol／L HCl）體積分數80%、提取時間35 min 時的綜合評分最高，故將其作為中心組合設計?響應面法的中心試驗點。

表4 最速上升試驗結果

2.4.5 中心組合設計?響應面法 參考文獻［18?20］ 報道。以浸膏率、鹽酸小檗堿提取率的綜合評分（Y）為評價指標，對“2.4.4”項下中心試驗點進行處理，因素水平見表5，結果見表6。

表5 中心組合設計?響應面法因素水平

表6 中心組合設計－響應面法結果

采用Design Expert 軟件對表6 數據進行多元二次回歸擬合，得方程為Y＝0.17＋7.714×10－3A＋2.789×10－3B－4.5×10－4AB－5.169×10－3A2－0.013B2（R2＝0.939 5），表明模型擬合度較高，方差分析見表7。由此可知，模型具有極顯著影響（P＜0.01）；因素A、B2有極顯著影響（P＜0.01），A2有顯著影響（P＜0.05）。

表7 中心組合設計?響應面法方差分析

響應面分析見圖3。由此可知，因素A達到85%左右時曲面變緩，等高線密度變疏，表明它在取值較小時對響應面值影響明顯；因素B達到35 min 左右時曲面變緩，等高線密度變疏，表明它在取值較小時對響應面值影響明顯。

圖3 各因素響應面圖

2.5 驗證試驗 采用Design Expert 軟件，得到最優(yōu)工藝為乙醇（含0.12 mol／L HCl）體積分數87.42%，提取時間35.49 min，料液比1 ∶50，綜合評分0.170 5，考慮到實際情況，將其修正為乙醇（含0.12 mol／L HCl）體積分數90%，提取時間35 min，料液比1 ∶50。按照優(yōu)化工藝進行3 批驗證試驗，測得綜合評分為0.169 4（浸膏率、鹽酸小檗堿得率分別為32.483 0%、1.403 1%），與預測值0.170 5接近，表明該工藝穩(wěn)定可行。

3 討論

由于生物堿類化合物具有多種生物活性，也是中藥材中重要藥效成分，故研究其提取優(yōu)化條件對于科研和生產具有重要意義。目前，生物堿提取工藝優(yōu)化主要考察醇體積分數、料液比、提取時間、提取溫度、pH 值等指標［21?22］，設計方案采用正交試驗［23］、Box?Behnken 響應面法［24］、星點設計?效應面法［25］。

本實驗采用析因設計、最速上升實驗、中心組合設計?響應面法結合的方法，優(yōu)化大葉小檗提取工藝。其中，析因設計的最大優(yōu)點是所獲得的信息量很多，可準確地估計各試驗因素主效應大小，不僅可用來分析全部因素的主效應、各因素之間的交互作用，還能有效控制或消除其它混雜因素對反應變量的干擾，使結果更準確、可靠、穩(wěn)定，從而為選擇最優(yōu)處理組合提供依據；最速上升法是以梯度方向為搜索方向求極大值的優(yōu)化方法，通過尋求最優(yōu)步長來使在該方向的目標函數值最大；中心組合設計?響應面法的最大優(yōu)點是能克服正交設計和均勻設計預測性較差、精確度不高的缺點，通過非線性模型擬合來預測最佳試驗條件，使工藝得到最大程度的優(yōu)化，將三者有機結合時，可首先篩選顯著影響因素，再根據合理的梯度、設計預測來擬合非線性模型，從而得到更為準確、可靠的最佳實驗條件。

本實驗發(fā)現，各提取方法權重和依次為超聲加酸提?。净亓魈崛。境曁崛。窘n提取，故選擇超聲加酸提取作進一步考察。析因設計顯示，乙醇體積分數（含0.12 mol／L HCl）對實驗結果有極顯著影響，而提取時間有顯著影響。根據函數梯度的特性發(fā)現，在試驗點附近沿梯度方向函數變化率最大，即80%乙醇（含0.12 mol／L HCl），提取時間35 min，故將其作為響應面試驗的中心試驗點。最終確定，大葉小檗根最優(yōu)提取工藝為提取時間35 min，提取溶劑90%乙醇?0.12 mol／L HCl，料液比1 ∶50，并且所得預測值與實測值的相對偏差較小，可為該藥材開發(fā)利用奠定理論基礎。