基于多元統(tǒng)計(jì)分析和多指標(biāo)評(píng)價(jià)假東風(fēng)草和東風(fēng)草的質(zhì)量

蘇宏娜李學(xué)學(xué)農(nóng)常東李修善李文兵劉 圓

（1.西南民族大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都610041； 2.四川省羌彝藥用資源保護(hù)與利用技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室，四川成都610225； 3.西南民族大學(xué)青藏高原研究院，四川 成都610041； 4.西南民族大學(xué)民族醫(yī)藥研究院，四川 成都610041； 5.廣西萬壽堂藥業(yè)有限公司，廣西 南寧530000）

滇桂艾納香為廣西壯瑤彝傳統(tǒng)使用藥材，具有活絡(luò)經(jīng)血、祛風(fēng)除濕、止血、利尿等功效，用于治療經(jīng)期不準(zhǔn)、產(chǎn)后大出血、不孕癥、陰瘡、風(fēng)濕骨痛等癥［1?3］，在廣西尤其是在百色地區(qū)有較長(zhǎng)的使用歷史。研究發(fā)現(xiàn)［4?7］滇桂艾納香主要含有黃酮類、甾醇類、多糖類及水溶性活性成分等。藥理實(shí)驗(yàn)證明［4?5，8?10］，滇桂艾納香有增強(qiáng)子宮收縮、促凝血、鎮(zhèn)痛、抗炎、保護(hù)肝臟等作用。

廣西省藥材標(biāo)準(zhǔn)、湖南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)［11］僅收載假東風(fēng)草Blumea riparia（Bl.）DC.作為滇桂艾納香藥材來源。但課題組前期文獻(xiàn)［1，3，12?13］考證和實(shí)地走訪調(diào)研、多次采集原植物花期、果期發(fā)現(xiàn)，滇桂艾納香藥材在壯瑤醫(yī)臨床使用、壯瑤草藥材市場(chǎng)有“小花種”“大花種”2 種，制藥企業(yè)生產(chǎn)中滇桂艾納香生產(chǎn)投料中的假東風(fēng)草Blumea riparia（Bl.）DC.（小花種，地標(biāo)收載品種）。課題組開展了進(jìn)行原植物鑒別，確定“小花種”為菊科艾納香屬植物假東風(fēng)草的干燥全草，又名滇桂艾納香［1］；大花種為菊科艾納香屬植物東風(fēng)草Blumea megacephala（Randeria）Chang et Tseng 的干燥全草，又名白花九里明、管芽［3］等，對(duì)風(fēng)濕骨痛、跌打腫痛、產(chǎn)后血崩、月經(jīng)不調(diào)有一定的療效［14?15］。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)東風(fēng)草（大花種，非標(biāo)品種）是否能作為滇桂艾納香藥材來源等同入藥的相關(guān)研究較少［13?14］。因此，本研究擬對(duì)東風(fēng)草與假東風(fēng)草開展藥材質(zhì)量比較，結(jié)合課題組其他研究結(jié)果，為確認(rèn)東風(fēng)草是否能夠納入滇桂艾納香的一個(gè)新的植物基原同等入藥提供參考。

1 材料

LC?7030C 3D 高效液相色譜儀（日本島津公司）；TU?1810 型紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；KQ?259DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；AE240 電子分析天平（瑞士梅特勒?托利多公司）；DHG?9240A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；SX2 型箱式電阻爐（長(zhǎng)沙市遠(yuǎn)東電爐廠）；HH?2 型數(shù)顯恒溫水浴鍋（國(guó)華電器有限公司）。

蘆丁對(duì)照品（批號(hào)100080?200707，純度≥98%）購于中國(guó)食品藥品檢定研究院；3，4?二咖啡?？鼘幩幔ㄅ?hào)17121201）、3，5?二咖啡酰奎寧酸（批號(hào)19061201）對(duì)照品均購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司，純度均大于98%。乙腈、甲醇、甲酸（色譜純，北京迪馬科技有限公司）；甲醇、鹽酸、乙醇（分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司）；水為屈臣氏蒸餾水。藥材由課題組采自廣西省百色市、南寧市，經(jīng)西南民族大學(xué)劉圓教授、李瑩副教授鑒定為菊科艾納香屬植物假東風(fēng)草Blumea riparia（Bl.）DC.（小花種，地標(biāo)收載品種）、菊科艾納香屬植物東風(fēng)草Blumea megacephala（Randeria）Chang et Tseng（大花種，非標(biāo)品種），信息見表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法

2.1 水分、總灰分、酸不溶性灰分測(cè)定 按2020年版《中國(guó)藥典》 四部［15］方法，對(duì)水分（通則0832）、總灰分（通則2302）、酸不溶性灰分（通則2302）進(jìn)行測(cè)定。

2.2 醇溶性浸出物測(cè)定 以40%乙醇為溶劑，按2020 年版《中國(guó)藥典》 四部［15］（通則2201）醇溶性浸出物測(cè)定法項(xiàng)下的熱浸法測(cè)定。

2.3 總黃酮含量 參考文獻(xiàn)［16］ 中響應(yīng)面優(yōu)化的條件、方法，測(cè)定樣品中總黃酮含量。

2.3.1 對(duì)照品溶液制備 取蘆丁對(duì)照品適量，精密稱定質(zhì)量，40%乙醇定容至10 mL，搖勻，得質(zhì)量濃度為1 mg／mL 的母液。分別精密量取0、0.1、0.2、0.5、0.8、1 mL，加0.3 mL 5% NaNO2溶液，混勻，靜置6 min，加0.3 mL 10% Al（NO3）2混勻，靜置6 min，再加4 mL NaOH 試液，40%乙醇稀釋至10 mL，搖勻，制成質(zhì)量濃度為0.01、0.02、0.05、0.08、0.1 mg／mL 的對(duì)照品溶液。

2.3.2 供試品溶液制備 取待測(cè)樣品0.2 g，精密稱定質(zhì)量，置于具塞錐形瓶中，精密加入20 mL 40%乙醇，密塞，稱定質(zhì)量，超聲（600 W、40 kHz）處理30 min，放冷，40% 乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精確量取0.1 mL 濾液，加0.3 mL 5%NaNO2溶液，混勻，靜置6 min，加0.3 mL 10%Al（NO3）2混勻，靜置6 min，再加4 mL NaOH 試液，40%乙醇稀釋至10 mL，搖勻，即得。

2.3.3 線性關(guān)系考察 取對(duì)照品溶液，在500 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），吸光度為縱坐標(biāo)（A）進(jìn)行回歸，得方程為A＝12.184X－0.017 6（r＝0.999 8），在10～100 μg／mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.4 精密度試驗(yàn) 取適量“2.3.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，連續(xù)測(cè)定6 次吸光度。結(jié)果，吸光度RSD為0.86%，表明儀器精密度良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品（D10）6 份，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定吸光度。結(jié)果，吸光度RSD 為1.43%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.3.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，分別在0、10、20、40、60 min 測(cè)定吸光度。結(jié)果，吸光度RSD 為0.91%，表明供試品溶液于制備后1 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4 含量測(cè)定

2.4.1 色譜條件 Diamonsil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相［乙腈?甲醇（1 ∶1）］ ?0.1% 甲 酸；體積流 量1.0 mL／min；檢測(cè)波 長(zhǎng)327 nm；柱溫30 ℃。3，4?二咖啡?？鼘幩?、3，5?二咖啡?？鼘幩崤c樣品中其他組分色譜峰達(dá)基線分離，其理論塔板數(shù)均大于5 000，見圖1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.4.2 對(duì)照品溶液制備 取3，4?二咖啡酰奎寧酸、3，5?二咖啡?？鼘幩釋?duì)照品適量，精密稱定質(zhì)量，置于10 mL 量瓶中，70%甲醇溶解并稀釋至刻度（質(zhì)量濃度分別為1.028、0.992 mg／mL），70%甲醇稀釋，得到3，4?二咖啡?？鼘幩豳|(zhì)量濃度分別為0.010 0、0.020 1、0.051 4、0.082 2、0.102 8 mg／mL，3，5?二咖啡 ?？鼘?酸質(zhì)量 濃度分別為0.001 0、0.019 8、0.049 6、0.079 4、0.099 2 mg／mL的對(duì)照品溶液。

2.4.3 供試品溶液制備 取樣品約0.2 g，精密稱定質(zhì)量，置于具塞錐形瓶中，精密加入25 mL 70%甲醇，密塞，稱定質(zhì)量，超聲（600 W、40 kHz）處理30 min，放冷，70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4.4 線性關(guān)系考察 準(zhǔn)確吸取適量對(duì)照品溶液，70%甲醇稀釋成不同質(zhì)量濃度，在“2.4.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，結(jié)果見表2，表明各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.4.5 精密度試驗(yàn) 取適量“2.4.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，在“2.4.1”項(xiàng)色譜下連續(xù)進(jìn)樣6 次。結(jié)果，3，4?二咖啡酰奎寧酸、3，5?二咖啡?？鼘幩岱迕娣eRSD 分別為0.56%、0.52%，表明儀器精密度良好。

2.4.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品（D10）6 份，按“2.4.3”項(xiàng)下方 法制備 供試品溶液，在“2.4.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定，測(cè)得3，4?二咖啡酰奎寧酸含量RSD 為1.67%，3，5?二咖啡?？鼘幩岷縍SD 為1.93%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.4.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，于0、6、12、18、24 h 在“2.4.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，測(cè)得3，4?二咖啡酰奎寧酸、3，5?二咖啡酰奎寧酸含量RSD 分別為0.52%、0.49%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.8 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批樣品（D12），按“2.4.2”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，按1 ∶1 的比例加入3，4?二咖啡?？鼘幩?、3，5?二咖啡酰奎寧酸，測(cè)得兩者平均加樣回收率分別為101.63%、99.23%，RSD 分別為3.82%、2.01%。

3 結(jié)果與分析

3.1 測(cè)定結(jié)果 由表3 可知，9 批假東風(fēng)草水分含量最高為9.98%，最低為7.83%，平均值為9.21%，均符合2009 年版 《湖南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》［17］不得超過14.0%的規(guī)定；9 批假東風(fēng)草總灰分含量最高為8.88%，最低為4.94%，平均值為6.50%；酸不溶性灰分含量最高為1.23%，最低為0.57%，平均值為0.87%；浸出物含量最高為27.08%，最低為17.61%，平均值為22.21%。10批東風(fēng)草水分含量最高為9.67%，最低為6.24%，平均值為8.00%；總灰分含量最高為10.68%，最低為6.52%，平均值為8.90%；酸不溶性灰分含量最高為1.73%，最低為0.79%，平均值為1.21%；浸出物含量最高為17.77%，最低為10.57%，平均值為13.56%。

表3 假東風(fēng)草和東風(fēng)草測(cè)定結(jié)果Tab.3 Determination results of B.riparia and B.megacephala

9 批假東風(fēng)草總黃酮平均含量為126.10 mg／g，10 批東風(fēng)草其平均含量為82.65 mg／g。9 批假東風(fēng)草中3，4?二咖啡?？鼘幩?、3，5?二咖啡?？鼘幩崞骄糠謩e為7.80、4.18 mg／g，10 批東風(fēng)草兩者平均含量分別為3.52、4.43 mg／g。

3.2 聚類分析 采用SPSS 20.0 軟件對(duì)9 批假東風(fēng)草和10 批東風(fēng)草水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物、總黃酮、3，4?二咖啡?？鼘幩?、3，5?二咖啡酰奎寧酸含量測(cè)定結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果見圖2。由此可知，以水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物、總黃酮、3，4?二咖啡?？鼘幩岷?，5?二咖啡?？鼘幩釣橹笜?biāo)，可將假東風(fēng)草和東風(fēng)草聚為兩類，其中D2～D3、D7～D8、D10～D14、D16～D19 聚為一 類，D1、D4～D6、D9、D15 聚為另一類，但未能將2 個(gè)物種明顯區(qū)分開。

圖2 9 批假東風(fēng)草、10 批東風(fēng)草樹狀圖Fig.2 Dendrogram of nine batches of B.riparia and ten batches of B.megacephala

3.3 主成分分析 采用SPSS 20.0 軟件對(duì)9 批假東風(fēng)草和10 批東風(fēng)草水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物、總黃酮、3，4?二咖啡?？鼘幩帷?，5?二咖啡酰奎寧酸含量測(cè)定結(jié)果進(jìn)行主成分分析，結(jié)果見圖3。以特征值（n）≥1 為原則提取2 個(gè)主成分，累積貢獻(xiàn)率達(dá)到71.93%，可說明7 種成分的變化趨勢(shì)，從而客觀反映假東風(fēng)草和東風(fēng)草信息。浸出物、總黃酮和3，5?二咖啡?？鼘幩嵩诘? 主成分中有較高載荷，可反映這3 種成分的信息，呈高度正相關(guān)；3，4?二咖啡?？鼘幩嵩诘?主成分中有較高載荷，可反映這1 種成分的信息，呈高度正相關(guān)。根據(jù)提取的2 種主成分得分對(duì)19批樣品進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)可將D5、D9、D12、D14、D16、D18～D19 分為一 類，D1～D4、D6～D8、D10～D11、D13、D17 分為另一類，但也未能將假東風(fēng)草、東風(fēng)草2 個(gè)品種明顯區(qū)分開，與聚類分析結(jié)果基本一致。

圖3 24 批樣品主成分分析圖Fig.3 Principal component analysis plot for twenty?four batches of samples

4 討論與結(jié)論

9 批假東風(fēng)草和10 批東風(fēng)草水分、灰分和浸出物含量最高值與最低值之間有較大差異，表明不同產(chǎn)地假東風(fēng)草和東風(fēng)草種間和種內(nèi)質(zhì)量均有差異；假東風(fēng)草總黃酮含量高于東風(fēng)草；假東風(fēng)草中3，4?二咖啡?？鼘幩岬暮扛哂?，5?二咖啡?？鼘幩?，且3，4?二咖啡酰奎寧酸含量高于東風(fēng)草；東風(fēng)草中3，5?二咖啡?？鼘幩岷扛哂?，4?二咖啡?？鼘幩?，且高于假東風(fēng)草中3，5?二咖啡酰奎寧酸含量。多指標(biāo)系統(tǒng)聚類分析和主成分分析結(jié)果并未將東風(fēng)草和假東風(fēng)草2 個(gè)品種明顯區(qū)分開。

3，4?二咖啡?？鼘幩岷?，5?二咖啡酰奎寧酸是一類廣泛存在于金銀花、蒼耳等中藥材中的二咖啡酰奎寧酸類［17?18］。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［17?20］，該類成分具有抗氧化、抗炎、抗血小板活性物質(zhì)等作用；課題組前期針對(duì)這2 種植物的化學(xué)成分分離研究中，提取分離出3，4?二咖啡?？鼘幩岷?，5?二咖啡?？鼘幩幔蔬x用該2 種成分與藥材功效相關(guān)且在植物中含量較高、容易得到的成分作為質(zhì)量指標(biāo)性成分。

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，基于東風(fēng)草的總黃酮、3，4?二咖啡?？鼘幩?、3，5?二咖啡?？鼘幩岷枯^高，藥材市場(chǎng)、廣西百色市和南寧市壯瑤彝等民族民間臨床長(zhǎng)期混用、新資源發(fā)現(xiàn)的實(shí)際情況，結(jié)合課題組其他研究結(jié)果綜合考慮，建議對(duì)東風(fēng)草與假東風(fēng)草開展臨床功效對(duì)應(yīng)的藥效學(xué)比較研究，將東風(fēng)草納入滇桂艾納香的一個(gè)新的植物基原同等入藥；滇桂艾納香藥材項(xiàng)下，規(guī)定水分不超過14%，總灰分不超過11.00%，酸不溶性灰分不超過1.50%，浸出物不低于11.00%，總黃酮含量不低于67.00 mg／g，3，4?二咖啡?？鼘幩岷坎坏陀?.80 mg／g，3，5?二咖啡 酰奎寧 酸含量不低于3.50 mg／g。