不同產地薏苡仁HPLC 指紋圖譜建立及甘油三油酸酯測定

張 婷羅云云杜偉鋒*葛衛(wèi)紅李昌煜

（1.杭州市西溪醫(yī)院，浙江 杭州310023； 2.浙江中醫(yī)藥大學中藥炮制技術研究中心，浙江杭州311401；3.浙江省食品藥品檢驗研究院，浙江 杭州310052； 4.浙江中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥科學院，浙江 杭州310053）

薏苡仁為禾本科植物薏苡Coix lacrma?jobiL.var.mayuen（Roman.）Stapf 的干燥成熟種仁［1］，性涼，味甘淡，歸脾、肺、胃經，具有健脾滲濕、清熱排膿、除弊、利水等功效［2?3］。其主要成分有甘油三酯類、多糖類、氨基酸及生物堿類等［4］。現(xiàn)代研究表明，薏苡仁可應用于消化系統(tǒng)腫瘤［5］、胃腸功能紊亂［6］、類風濕性關節(jié)炎［7］等。薏苡仁為藥食同用的品種［8］，市場需求量大。在各地均有生長分布，以貴州、福建等為主產地。由于各產區(qū)種植方法和氣候條件的不同，造成其成分質量差異［9］，從而導致薏苡仁臨床療效的差異，因此對不同產地薏苡仁質量進行更全面的評價，以期有利于優(yōu)化產地，保證相關產品的質量。

目前，中藥HPLC 指紋圖譜用于分析中藥有效成分的種類和含量，符合中醫(yī)中藥整體性和模糊性的特點，已逐漸應用于中藥質量控制和評價中［10?12］。為了仔細分析不同產地薏苡仁的質量差異，本研究對4 個主要產地（貴州、福建、浙江、云南）11 批薏苡仁進行指紋圖譜相似度評價及聚類分析，同時檢測其指標成分甘油三油酸酯的含量，比較樣品質量差異，以期為薏苡仁最優(yōu)產地的選擇提供依據。另外，為更準確反應產地真實情況，實驗樣品均為實地調研采樣所得，經統(tǒng)一的加工方法處理。

1 材料

戴安3000 高效液相色譜儀（美國Dionex 公司）；LNN ELSD 3000 型蒸發(fā)光散射檢測器（美國LNN 公司）；DFT?200 手提式高速中藥粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司）；Al?204 型電子分析天平（瑞士梅特勒?托利多公司）。乙腈、二氯甲烷均為色譜純；水為娃哈哈純凈水。甘油三油酸酯標準物質（純度99.8%，批號111692?201605）。

本研究共選取了貴州、福建、浙江、云南出產的薏苡仁共11 批樣品，信息見表1，經浙江中醫(yī)藥大學葛衛(wèi)紅教授鑒定均為正品。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結果

2.1 色譜條件 安捷倫反相C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈?二氯甲烷（65 ∶35）；體積流量1.0 mL／min；柱溫25 ℃。蒸發(fā)光散射檢測器檢測［13］；載氣體積流量2.0 L／min；漂移管溫度70 ℃；保留時間50 min；增益2。

2.2 供試品溶液制備 取薏苡仁粉末（過3 號篩）約0.6 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入流動相50 mL，稱定質量，浸泡2 h，超聲（300 W、50 kHz）處理30 min，放冷，再稱定質量，用流動相補足減失的質量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 對照品溶液制備 取甘油三油酸酯對照品適量，精密稱定，加流動相制備成每1 mL 含0.14 mg該成分的溶液，即得。

2.4 指紋圖譜方法學考察

2.4.1 精密度試驗 按“2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下連續(xù)進樣6次，將所得指紋圖譜導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A 版”軟件，計算相似度均大于0.995，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗 取同一薏苡仁供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下，分別于制備后0、2、4、8、12、24 h 時進樣，記錄指紋圖譜，所得圖譜導入軟件計算得相似度均大于0.995，表明供試品溶液在24 h 內穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重復性試驗 取同一批薏苡仁粉末，精密稱定6 份，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣，記錄指紋圖譜，導入指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件，計算相似度均大于0.995，表明該方法重復性良好。

2.5 指紋圖譜分析

2.5.1 指紋圖譜建立 分別取不同產地薏苡仁S1～S11，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣分析，得到各批薏苡仁HPLC 色譜圖，將色譜數(shù)據導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A 版”，其中保留時間穩(wěn)定的共有峰有7 個，在“2.1”項色譜條件下，將薏苡仁指紋圖譜與對照品色譜進行比較，指認出6 號鋒主要指標成分甘油三油酸酯，將其作為參照峰，計算各共有峰與參比峰的峰面積比值，每個樣品的非共有峰面積占總峰面積的比值均小于20%，符合指紋圖譜要求。其中指紋圖譜疊加圖見圖1，對照品及薏苡仁樣品的共有峰模式圖見圖2～3。

圖1 11 批樣品HPLC 指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints of eleven batches of samples

圖2 對照品HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of reference substance

圖3 樣品共有峰模式圖Fig.3 Common peak pattern of samples

2.5.2 相似度評價及聚類分析 分別將11 批樣品的色譜數(shù)據導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004A）軟件，考察色譜峰相似度的一致性，進行相似度評價，結果見表2，表明不同產地11 批樣品指紋圖譜中主要峰群的整體圖貌基本一致，雖然不同產地樣品中各成分含量有較大差別，但特征指紋峰的相對保留時間一致。11 批樣品中，除S3樣品相似度為0.705 外，其余相似度均大于0.902。不同產地樣品指紋圖譜沒有顯著性差異，其共有峰相對保留時間基本一致，峰面積比值存在較大差異，表明不同產地樣品質量之間存在差異。

表2 11 批樣品相似度Tab.2 Similarities of eleven batches of samples

同時以篩選所得的7 個共有峰面積為變量，產地為自變量，應用SPSS 19.0 軟件進行聚類分析，結果見圖4，表明11 批樣品分為3 類，Ⅰ類為S1、S2、S3、S5、S9、S10、S11，即貴州樣品、1 批福建樣品、1 批浙江樣品及云南樣品聚為一類；Ⅱ類為S4、S6、S8，即2 批福建樣品與1 批浙江樣品聚為一類；Ⅲ類為S7，即1 批浙江縉云縣的樣品單獨為一類?？梢娰F州和云南的樣品較為穩(wěn)定；而3 批浙江的樣品聚為3 類，2 批福建樣品聚為2類，可見即使同一產地，不同種植戶間的藥材質量也有較大差異。

圖4 11 批樣品聚類分析樹狀圖Fig.4 Dendrogram of eleven batches of samples

2.6 甘油三油酸酯含量測定

2.6.1 線性關系考察 取甘油三油酸酯對照品逐級稀釋成5 個不同質量濃度梯度對照品溶液，搖勻，同時在“2.1”項色譜條件下進樣，以對照品質量濃度對數(shù)值為橫坐標（X），峰面積對數(shù)值為縱坐標（Y）進行回歸，得方程為Y＝1.841 5X＋7.141 9（r＝0.999 3），在0.223～8.625 mg／mL 范圍內線性關系良好。

2.6.2 精密度試驗 精密稱定甘油三油酸酯對照品適量，加入流動相制備成每1 mL 含0.25 mg 的對照品溶液，在“2.1”項色譜條件下連續(xù)進樣6次，測得峰面積、保留時間RSD 分別為2.41%、0.25%，表明儀器精密度良好。

2.6.3 穩(wěn)定性試驗 精密稱取同一批樣品，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下，分別于0、2、4、8、12、24 h 各進樣1次，測得峰面積、保留時間RSD 分別為1.42%、0.57%，表明供試品溶液在24 h 內穩(wěn)定性良好。

2.6.4 重復性試驗 取同一批樣品，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣，測得峰面積、保留時間RSD 分別為2.49%、0.51%，表明該方法重復性良好。

2.6.5 加樣回收率試驗 取同一批樣品6 份，按低、中、高比例（0.5、1.0、2.0 倍）加入對照品甘油三油酸酯，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣，記錄各峰面積和保留時間，測得甘油三油酸酯平均加樣回收率為99.84%，RSD 為1.09%。

2.6.6 樣品含量測定 按“2.2”項下方法制備11 批供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣10 μL，根據外標法［14］計算各組分含量，結果見表3。除S4 樣品的含量低于2020 年版《中國藥典》限度值0.50% 外，其余樣品均高于此限度值，其中S1 樣品最高，達0.998%；產自云南曲靖師宗縣的含量平均值最高，達0.911%；福建產樣品質量穩(wěn)定性最差，RSD 為31.37%，而浙江、云南產樣品RSD 相對較低，質量較為穩(wěn)定。

表3 甘油三油酸酯含量測定結果（%， n＝3）Tab.3 Results of content determination of glycerol trioleate（%， n＝3）

3 討論

本實驗對色譜條件進行了系統(tǒng)性考察，包括乙腈?二氯甲烷流動相的不同比例（70 ∶30、68 ∶32、65 ∶35、62 ∶38、60 ∶40）、不同體積流量（0.5、0.8、1.0、1.3、1.5 mL／min）、不 同柱溫（20、25、30、35 ℃），最終確定“2.1”項下色譜條件。采用HPLC?ELSD 法測定薏苡仁指紋圖譜的同時獲得甘油三油酸酯含量，該方法穩(wěn)定可靠、重現(xiàn)性較高，可用于評價薏苡仁及其他含有甘油三油酸酯的藥材的質量。而運用指紋圖譜結合相似度分析和聚類分析，以及以甘油三油酸酯的含量作為指標，可對不同產地薏苡仁的質量進行更為全面的評價。

結果表明，不同產地的薏苡仁質量存在差異，甚至來自同一省同一地區(qū)的樣本之間含量也有一定差異。大部分薏苡仁種植戶都是自己留種，在各地種植方法和氣候條件的影響下，經過多年的人工種植，形成了一些各自不同的特征，可以解釋薏苡仁中化學成分的差異。同時，實地采樣調研發(fā)現(xiàn)福建薏苡產地加工方式差異較大，浦城產薏苡常供藥用，而食用型薏苡常加工成碎米，這可能是導致福建產薏苡質量不穩(wěn)定的原因。因此，為能更好確保中藥的質量，在建立完善的質量標準體系的同時，還應建立中藥材質量追溯系統(tǒng)，實時監(jiān)控藥材從種植到臨床應用的全過程，從而確保中藥療效。