楊桃根DMDD調(diào)控ROS介導(dǎo)的自噬通路減輕糖尿病大鼠心肌損傷

馬 靜，吳婭妮，黃德倫，周艷平，侯柳婷，李亞坤，鐘 靜，韋曉潔

(1. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣西 南寧 530299；2. 廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530021)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是全球危害性最大的慢性疾病之一，而我國年齡標(biāo)準(zhǔn)化的DM發(fā)病率已高達(dá)10%[1]。糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是DM常見的、嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，也是導(dǎo)致DM患者死亡的主要原因[2]。長期高糖刺激可造成心肌細(xì)胞肥大、凋亡，引起心肌纖維化，導(dǎo)致心室收縮及舒張功能不全，最終形成心力衰竭[3]。由此可見，高糖所致的心肌細(xì)胞凋亡是誘發(fā)DCM的核心病理變化。DCM心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，目前認(rèn)為與高糖引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、活性氧(reactive oxygen species，ROS)聚集及自噬紊亂有關(guān)[4]。

楊桃(AverrhoacarambolaL.)為酢漿草科五斂子屬植物，在我國廣泛分布于廣西、廣東、福建等地[5]。楊桃根莖是廣西民間常用中藥材?！吨腥A本草》中記載，楊桃根具有行氣活血、祛風(fēng)止痛、澀精止帶之功效。本課題組前期證實(shí)，楊桃根總提取物可改善DM大鼠糖脂代謝，抑制高糖誘發(fā)的氧化應(yīng)激反應(yīng)[6]。近期，我們從楊桃根中分離出一種單體成分，即2-十二烷基-6-甲氧基-2,5-二烯-1,4-環(huán)己二酮(DMDD)，并初步證實(shí)該成分能減輕高糖所致的心肌細(xì)胞損傷，但其機(jī)制尚未完全明確。本研究采用高糖高脂飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素誘導(dǎo)建立DM大鼠模型，觀察楊桃根DMDD對DM大鼠心臟功能、心肌細(xì)胞凋亡、ROS-自噬通路的影響，探討楊桃根DMDD對DM大鼠心肌損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物SPF級成年SD大鼠共50只，♂，體質(zhì)量(180±20)g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證號：SCXK桂2014-0002。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑楊桃根DMDD由本課題組自行制備；高糖高脂飼料購于北京博愛港生物技術(shù)有限公司；鏈脲佐菌素購于Sigma公司；ROS、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所；抗Beclin-1、LC3、Atg5、p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR、GAPDH抗體購于Abcam公司；TUNEL試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 分組與造模大鼠隨機(jī)分為Control組、DM組、DMDD組(12.5、25.0、50.0 mg·kg-1)，每組10只。經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，DM組、DMDD組給予高糖高脂飼料飼養(yǎng)4周，之后腹腔注射鏈脲佐菌素(120 mg·kg-1)1次，4周后隨機(jī)血糖值≥16.7 mmol·L-1即判定2型糖尿病大鼠造模成功，本研究造模成功率為75%(30/40)，失敗模型予以替補(bǔ)；Control組僅給予普通飼料及灌胃等量生理鹽水。DMDD組于造模成功后分別灌胃不同濃度DMDD，連續(xù)灌胃給藥21 d，1次/d；Control組、DM組僅灌胃等量生理鹽水。末次給藥后，采集大鼠血樣及心臟組織供后續(xù)試驗(yàn)。

1.4 血糖測定經(jīng)尾尖采血，用血糖測定儀檢測大鼠空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)。

1.5 左心室功能評價(jià)10%水合氯醛(3 mL·kg-1)腹腔注射麻醉大鼠，使用Vevo 2100型小動物彩色超聲診斷儀測定左室舒張末期壓(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)、左心室壓峰值(left ventricular systolic pressure，LVSP)、左心室內(nèi)壓最大上升速率(maximum upstroke velocity of left ventricular pressure，+dp/dtmax)、左心室內(nèi)壓最大下降速率(maximum descent velocity of left ventricular pressure，-dp/dtmax)。

1.6 心肌形態(tài)變化取大鼠心肌組織，4%多聚甲醛固定，隨后脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，HE染色后于光鏡下觀察心肌組織病理學(xué)形態(tài)變化。

1.7 心肌細(xì)胞凋亡心肌組織經(jīng)固定、脫水、石蠟包埋、切片后，參照TUNEL試劑盒說明書檢測細(xì)胞凋亡，凋亡細(xì)胞核染成棕黃色，光鏡下隨機(jī)選5個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)凋亡細(xì)胞數(shù)目，凋亡指數(shù)/%=(凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%。

1.8 氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測取心肌組織加入4 ℃PBS研磨制備10%組織勻漿，3 000 r·min-1離心10 min取上清液，根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作，SOD采用羥胺法檢測，MDA采用 TBA法檢測，ROS采用化學(xué)熒光法檢測。

1.9 Western blot檢測取50 mg心肌組織加入500 μL預(yù)冷RIPA裂解液，勻漿后離心取上清，BCA法檢測蛋白濃度, 20 μg蛋白樣品上樣，行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉，一抗(Beclin-1 1 ∶500、LC3 1 ∶1 000、Atg5 1 ∶1 000、PI3K 1 ∶1 000、p-PI3K 1 ∶1 000、Akt 1 ∶1 000、p-Akt 1 ∶1 000、mTOR 1 ∶1 000、p-mTOR 1 ∶1 000、GAPDH 1 ∶ 2 000)4 ℃孵育過夜，洗膜后加入二抗(1 ∶5 000)室溫孵育1 h，洗膜、ECL顯色、曝光，ImageJ軟件處理圖像。

2 結(jié)果

2.1 DMDD對FBG和心功能指標(biāo)的影響相較于Control組，DM組FBG、LVEDP明顯增高，同時(shí)LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax明顯降低(P<0.05)；相較于DM組，DMDD組FBG、LVEDP明顯降低，同時(shí)LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax明顯增高(P<0.05)，并呈劑量依賴性，見Tab 1。

Tab 1 Comparison of FBG and cardiac function indexes in each group n=10)

2.2 DMDD對心肌組織結(jié)構(gòu)的影響HE染色可見Control組大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，排列整齊、緊密；DM 組大鼠心肌細(xì)胞呈不規(guī)則排列，細(xì)胞間質(zhì)增寬，并伴有細(xì)胞破碎、壞死，部分心肌纖維斷裂；DMDD組大鼠心肌細(xì)胞排列稍紊亂，破碎、壞死細(xì)胞數(shù)量明顯減少，纖維斷裂減少(Fig 1)。

Fig 1 Myocardial morphology of rats in each group (HE×200)

2.3 DMDD對心肌凋亡的影響TUNEL染色可見，相較于Control組，DM組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯增高(P<0.05)；相較于DM組，DMDD組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯降低(P<0.05)，且呈明顯劑量依賴性(Fig 2)。

Fig 2 Apoptosis of myocardial cells in each group n=10)

2.4 DMDD對心肌ROS、SOD及MDA水平的影響相較于Control組，DM組SOD水平明顯降低，同時(shí)ROS、MDA水平明顯增高(P<0.05)；相較于DM組，DMDD組SOD水平明顯增高，同時(shí)ROS、MDA水平明顯降低(P<0.05)，且呈明顯劑量依賴性(Fig 3)。

Fig 3 Comparison of ROS, SOD and MDA levels in myocardial tissues of rats in each group n=10)

2.5 DMDD對心肌Beclin-1、LC3、Atg5表達(dá)的影響相較于Control組，DM組Beclin-1、LC3 Ⅱ/Ⅰ、Atg5表達(dá)明顯增高(P<0.05)；相較于DM組，DMDD組Beclin-1、LC3 Ⅱ/I、Atg5表達(dá)明顯降低(P<0.05)，且呈明顯劑量依賴性(Fig 4)。

Fig 4 Comparison of Beclin-1, LC3 and Atg5 expression in myocardial tissues of rats in each group n=10)

2.6 DMDD對心肌PI3K/Akt/mTOR通路的影響相較于Control組，DM組p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR明顯降低(P<0.05)；相較于DM組，DMDD組p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR明顯增高(P<0.05)，且呈明顯劑量依賴性(Fig 5)。

Fig 5 Comparison of PI3K, Akt, and mTOR expressions in myocardial tissues of rats in each group n=10)

3 討論

持續(xù)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡是引發(fā)DCM的主要原因，由于凋亡心肌細(xì)胞無法再生，逐漸被膠原纖維等取代，故而導(dǎo)致心肌纖維化及心室重構(gòu)。因此，抑制心肌細(xì)胞凋亡對于改善DM心肌損傷具有積極意義[7]。本研究采用高糖高脂飲食聯(lián)合腹腔注射鏈脲佐菌素建立DM大鼠模型，HE染色顯示DM組大鼠心肌組織損傷明顯；心臟彩超可見LVEDP明顯增高，同時(shí)LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax明顯降低；TUNEL染色顯示心肌細(xì)胞凋亡明顯。上述變化與文獻(xiàn)[8]中對于DM心肌損傷模型的報(bào)道一致，提示造模成功。而相較于DM組，DMDD組大鼠心肌組織損傷明顯減輕，左心室功能明顯改善，同時(shí)心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯降低。這表明DMDD對于DM心肌損傷具有明確的保護(hù)效應(yīng)。

自噬是真核細(xì)胞的重要代謝途徑，泛指蛋白質(zhì)和受損細(xì)胞器經(jīng)溶酶體清除、降解的一系列過程[9]。生理?xiàng)l件下，細(xì)胞自噬活性持續(xù)處于低水平狀態(tài)，有助于維持細(xì)胞的存活與能量平衡[10]。然而，某些條件下會導(dǎo)致自噬過度激活，造成細(xì)胞程序性死亡。目前認(rèn)為，自噬可在一定程度上調(diào)控心肌細(xì)胞增殖與凋亡，并在DCM進(jìn)展過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[11]。本研究顯示，DM組大鼠不僅存在心功能障礙，還伴有心肌自噬過度激活，表現(xiàn)在自噬標(biāo)志物Beclin-1、LC3 Ⅱ/I、Atg5表達(dá)較Control組明顯增高，與朱小艷等[12]報(bào)道一致。而DMDD組大鼠上述自噬標(biāo)志物表達(dá)較DM組明顯降低，提示DMDD可有效抑制DM大鼠心肌細(xì)胞過度自噬。

高糖狀態(tài)下，心肌組織中ROS產(chǎn)生增加，加之氧自由基清除能力減弱，勢必造成ROS大量蓄積，最終造成心肌細(xì)胞DNA及脂質(zhì)的過氧化損傷[13]。本研究結(jié)果顯示，DMDD組SOD水平較DM組明顯增高，同時(shí)ROS、MDA水平較DM組明顯降低。表明DMDD有助于清除ROS，并調(diào)控抗氧化物/氧化物平衡，從而改善糖尿病所致心肌氧化應(yīng)激損傷。近年研究發(fā)現(xiàn)，ROS可作為一種胞內(nèi)信號分子參與細(xì)胞自噬的調(diào)控[14]。證據(jù)表明，ROS可通過調(diào)控PI3K/Akt/mTOR、AMPK、PIK3C3等通路誘導(dǎo)自噬小體形成，從而引發(fā)細(xì)胞自噬[15]。其中PI3K/Akt/mTOR通路是研究得最為廣泛的路徑之一。當(dāng)細(xì)胞ROS水平發(fā)生變化時(shí)，可激活PI3K激酶，促使Akt磷酸化，并調(diào)控下游mTOR活化，進(jìn)而影響自噬體形成和成熟[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)，DMDD組p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR較DM組明顯增高(P<0.05)，說明DMDD可激活PI3K/Akt/mTOR通路，這也是其調(diào)控心肌細(xì)胞自噬的主要機(jī)制之一。

綜上所述，楊桃根DMDD可通過調(diào)控ROS介導(dǎo)的PI3K/Akt/mTOR自噬通路，抑制心肌細(xì)胞凋亡，從而減輕DM大鼠心肌損傷。