冷柱頭氣相色譜法測(cè)定示蹤劑[18F]PBR06注射液中有機(jī)溶劑含量

喬洪文，盛靈慧，梁志剛,3

(1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科，北京 100053;2.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院 國(guó)家老年疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100053;3.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院 信息中心，北京 100053)

正電子發(fā)射斷層顯像(positron emission computed tomography, PET)能夠在體定量反應(yīng)特定靶向的功能情況，已經(jīng)成為臨床實(shí)用的分子影像手段，在疾病的研究、診斷、監(jiān)測(cè)和療效評(píng)價(jià)中發(fā)揮日益重要的應(yīng)用價(jià)值[1-2]。性質(zhì)優(yōu)良的示蹤劑是獲取良好PET圖像的必要條件，臨床上經(jīng)常采用的放射性核素包括：11C、18F、13N、68Ga等。PET顯像示蹤劑存在放射性半衰期的物理限制，需要制備后盡快使用，因此要求產(chǎn)品的質(zhì)控檢驗(yàn)方法快速、有效；同時(shí)由于放射性可能會(huì)引起輻射損傷，要求質(zhì)控檢驗(yàn)方法操作簡(jiǎn)單、樣品量少[3]。對(duì)于新開發(fā)的正電子類示蹤劑，應(yīng)根據(jù)《正電子類放射性藥品質(zhì)量控制指導(dǎo)原則》[4]，制定適用的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并通過臨床前研究驗(yàn)證制備工藝和產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性，以保證后續(xù)研究中示蹤劑制劑的安全性和研究的有效性。

[18F]PBR06是一種新型PET示蹤劑，主要用于檢測(cè)腦中神經(jīng)炎癥的分布和輕重程度。由于神經(jīng)炎癥表現(xiàn)在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中均有重要作用，包括多發(fā)性硬化、腦腫瘤和神經(jīng)退行性疾病等，因此，[18F]PBR06具有重要的臨床和研究應(yīng)用價(jià)值[5]。[18F]PBR06注射液的制劑形式是含有10%(v·v-1)乙醇的0.5%(g·g-1)抗壞血酸鈉生理鹽水溶液，其中乙醇為助溶劑，用于維持[18F]PBR06在制劑中的溶解度、保持制劑穩(wěn)定，制劑中乙醇含量的合格范圍為8.0%～12.0%。[18F]PBR06注射液在生產(chǎn)過程中還使用了另外兩種有機(jī)溶劑：乙腈用于原料18F-脫水干燥和粗產(chǎn)物色譜純化，DMSO用作氟化反應(yīng)溶劑[6-7]?！吨袊?guó)藥典》2020年版中規(guī)定，產(chǎn)品制劑中乙腈的限量為0.041%，DMSO為0.5%[8]。正電子放射性藥物中的殘留溶劑通過氣相色譜測(cè)定，常用分流/不分流進(jìn)樣口直接進(jìn)樣法和頂空進(jìn)樣法[10-14]，用于[18F]PBR06注射液分析存在的問題是：分流/不分流進(jìn)樣口直接進(jìn)樣法難以在一次進(jìn)樣中準(zhǔn)確測(cè)定低沸點(diǎn)溶劑乙醇、乙腈和高沸點(diǎn)溶劑DMSO的含量，而且[18F]PBR06制劑中乙醇含量較高，超出定量檢測(cè)線性范圍；頂空進(jìn)樣法所需樣品量較多、耗時(shí)較長(zhǎng)。本研究擬開發(fā)一種快速、樣品量少、能夠在一次進(jìn)樣中快速完成定量檢測(cè)[18F]PBR06注射液中乙醇含量，以及乙腈、DMSO殘留量的制劑質(zhì)檢方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

色譜儀：安捷倫7890B氣相色譜儀，配備冷柱頭進(jìn)樣口、G4513A型自動(dòng)進(jìn)樣器和FID檢測(cè)器；AB204E型電子天平：梅特勒公司。

1.2 主要試劑

乙醇：藥用級(jí)，南京化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：190509120B，含量99.93%；抗壞血酸鈉：藥用級(jí)，石藥集團(tuán)，批號(hào)：219014801；乙腈(批號(hào)：STBH5417，含量99.96%)、DMSO(批號(hào)：STBH9550，含量99.99%)：分析純，Sigma；水：色譜級(jí)，F(xiàn)isher Chemical，批號(hào)：178475；生理鹽水：藥用級(jí)，中國(guó)大冢制藥有限公司，批號(hào)：9F99B1；[18F]PBR06注射液(批號(hào)：PBR06-20190808-XWH，PBR06-20191216～20191220-XWH 共6批次)：于首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科放射性藥物實(shí)驗(yàn)室制備。

1.3 色譜條件

采用Restek公司Stabilwax色譜柱(30 m×0.52 mm，1 μm)，載氣為高純氮?dú)?。初始溫度?5 ℃，保持4 min，以40 ℃/min的速率升溫至200 ℃，保持3 min。檢測(cè)氣為氫火焰離子化檢測(cè)器，檢測(cè)器溫度為240 ℃。冷柱頭進(jìn)樣口溫度跟隨柱溫，進(jìn)樣口恒定壓力5.5 psi(37.9 kPa)，進(jìn)樣體積1 μL。

1.4 溶液配制

供試品溶液：[18F]PBR06注射液，基質(zhì)為含10%(v·v-1)乙醇的0.5%(g·g-1)抗壞血酸鈉-生理鹽水溶液。

空白溶液：精密稱取抗壞血酸鈉500 mg，溶解于100 mL生理鹽水，制得空白溶液。

標(biāo)準(zhǔn)溶液：在50 mL容量瓶中加入約40 mL空白溶液，用移液器向容量瓶中依次加入6 mL乙醇，32 μL乙腈、273 μL DMSO，稱量并記錄加入的準(zhǔn)確質(zhì)量，然后用空白溶液定容，制得乙醇濃度為12%(v·v-1)、乙腈濃度為0.048%(g·g-1)、DMSO濃度為0.59%(g·g-1)的1號(hào)標(biāo)準(zhǔn)溶液。用空白溶液逐級(jí)稀釋1號(hào)標(biāo)準(zhǔn)溶液，制得2～6號(hào)標(biāo)準(zhǔn)溶液，乙醇濃度(v·v-1)依次為10%、5%、2%、1%、0.5%；乙腈濃度(g·g-1)依次為0.040%、0.020%、0.008 0%、0.004 0%、0.002 0%；DMSO濃度(g·g-1)依次為0.49%、0.25%、0.098%、0.049%、0.025%。

1.5 方法學(xué)驗(yàn)證

1.5.1專屬性及系統(tǒng)適用性檢查 取空白溶液和2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)溶液各100 μL，分別置于5 mL容量瓶中，用水定容并混勻，然后取1 mL置于樣品瓶中，按1.3節(jié)色譜條件進(jìn)行分析，其中2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進(jìn)樣3次。

1.5.2精密度考察 取2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL，置于5 mL容量瓶中，用水定容并混勻，取樣并于同一日內(nèi)重復(fù)測(cè)定6次，考察各峰的保留時(shí)間和峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD%)。

1.5.3線性范圍考察 取1～6號(hào)標(biāo)準(zhǔn)溶液各100 μL，分別置于5 mL容量瓶中，用水定容并混勻，然后各取1 mL置于樣品瓶中，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次。分別以乙醇、乙腈和DMSO的峰面積為縱坐標(biāo)，以1～6號(hào)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，考察各溶劑的線性范圍和決定系數(shù)R2。

1.5.4定量限和檢測(cè)限測(cè)定 采用線性范圍考察2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)溶液的分析結(jié)果，按照信噪比10∶1和3∶1分別計(jì)算乙醇、乙腈和DMSO的定量限和檢測(cè)限，然后按照倍數(shù)將2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)溶液用空白溶液逐級(jí)稀釋，制得乙醇、乙腈、DMSO的定量限和檢測(cè)限檢查溶液。分別移取100 μL上述檢查溶液，用5 mL水稀釋后按1.3節(jié)色譜條件進(jìn)行分析(n=3)，分別考察乙醇、乙腈和DMSO的定量限和檢測(cè)限。

1.5.5加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確移取已測(cè)得各組分含量的[18F]PBR06注射液(批號(hào)為PBR06-20190808-XWH)5 mL，置于10 mL容量瓶中，分別加入高、中、低量的乙醇、乙腈和DMSO，然后用空白溶液定容，制得加標(biāo)回收率檢查溶液。分別取上述回收率檢查溶液100 μL，置于5 mL容量瓶中，用水定容混勻，然后取1 mL置于樣品瓶中，照1.3節(jié)的色譜條件測(cè)試，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次。

1.5.6系統(tǒng)耐用性初步分析 首先將樣口壓力分別設(shè)置為5.3 psi(36.5 kPa)、5.5 psi(37.9 kPa)和5.7 pis(39.3 kPa)，保持其余色譜條件如1.3節(jié)不變，取2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋液進(jìn)樣分析；然后將樣口溫度分別設(shè)定為53 ℃、55 ℃和57 ℃，保持其余色譜條件如1.3節(jié)不變，取2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋液進(jìn)樣分析。計(jì)算改變進(jìn)樣口壓力和溫度時(shí)，乙醇、乙腈和DMSO保留時(shí)間和峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.6 樣品測(cè)定

在[18F]PBR06注射液生產(chǎn)結(jié)束后(共5批次，批號(hào)：PBR06-20191216～20191220-XWH)，于鉛玻璃后取產(chǎn)品制劑100 μL，加入到5 mL容量瓶，采用水定容并搖勻，然后移取0.2 mL到微量GC樣品瓶中，按照1.3節(jié)的色譜條件進(jìn)行分析，通過峰面積計(jì)算制劑中乙醇、乙腈和DMSO的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)驗(yàn)證

2.1.1專屬性及系統(tǒng)適用性檢查 2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)溶液分析結(jié)果表明，乙醇、乙腈和DMSO能夠獲得較好分離，保留時(shí)間依次為2.053 min、2.943 min和7.975 min，三個(gè)色譜峰之間的分離度大于1.5。乙醇、乙腈和DMSO的理論塔板數(shù)分別為1 199、9 697和615 360，拖尾因子分別為2.63、1.65和1.10。空白溶液分析結(jié)果中無可見色譜峰，對(duì)被測(cè)各組分無干擾，色譜圖見圖1。2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)溶液3次連續(xù)進(jìn)樣中乙醇保留時(shí)間和峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.5%和0.1%，乙腈為0.1%和1.8%，DMSO為0.0%和2.4%。以上結(jié)果表明，本研究開發(fā)的GC條件具有較好的專屬性和系統(tǒng)適用性[9]。

圖1 空白溶液(a)和2號(hào)工作標(biāo)準(zhǔn)溶液(b)的氣相色譜圖Fig.1 GC chromatogram of blank (a) and No.2 standard (b)

2.1.2精密度 方法精密度考察結(jié)果見表1，乙醇、乙腈和DMSO三種目標(biāo)物的保留時(shí)間和峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%，表明本色譜方法精密度良好，符合《中國(guó)藥典》2020版中關(guān)于殘留溶劑重復(fù)性的要求(RSD≤5%)[7]。

表1 GC方法精密度測(cè)試結(jié)果Table 1 The results of precision inspection for the GC method validation

2.1.3線性范圍 根據(jù)1～6號(hào)標(biāo)準(zhǔn)溶液分析結(jié)果得到回歸方程列于表2，乙醇、乙腈和DMSO分別在0.5%～12.0%(v·v-1)，0.004 0%～0.048 0%(g·g-1)和0.025%～0.590%(g·g-1)濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。[18F]PBR06注射液中乙醇含量的理論值為10%(v·v-1)，合格范圍為8.0%～12.0%(v·v-1)；殘留溶劑乙腈限度為0.041%，DMSO為0.50%。本研究GC方法的線性范圍涵蓋以上三種溶劑的檢測(cè)限度。

表2 方法線性范圍考察結(jié)果Table 2 The results of linear range inspection

2.1.4定量限(S/N=0)和檢測(cè)限(S/N=3)測(cè)定 將2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)系列稀釋后分析，測(cè)得乙醇的定量限為0.15%(v·v-1)，檢測(cè)限為0.05%(v·v-1)；乙腈定量限為0.002 9%(g·g-1)，檢測(cè)限為0.000 87%(g·g-1)；DMSO定量限為0.008 2%(g·g-1)，檢測(cè)限為0.002 5%(g·g-1)。

2.1.5加標(biāo)回收率 高、中、低濃度的加標(biāo)回收率檢查溶液中的溶劑濃度為限度120%、100%和80%，分析結(jié)果列于表3，三種待測(cè)溶劑的加標(biāo)回收率均大于95%，表明該方法具有良好的準(zhǔn)確度。

表3 方法加標(biāo)回收率考察結(jié)果Table 3 The results of standard addition recovery inspection

2.1.6系統(tǒng)耐用性 在色譜柱選擇上，Stabilwax色譜柱適用于高含水量和高鹽樣本分析，研究結(jié)果表明此款色譜柱可以實(shí)現(xiàn)制劑中各目標(biāo)組分的良好分離，同時(shí)具有良好的重現(xiàn)性和精密度。樣口壓力分別設(shè)置為5.3 psi(36.5 kPa)、5.5 psi(37.9 kPa)和5.7 pis(39.3 kPa)，取2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)溶液分析，結(jié)果表明，三種目標(biāo)物的保留時(shí)間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差<0.94%，峰面積<1.83%。進(jìn)樣口初始溫度分別設(shè)置為53 ℃、55 ℃和57 ℃，2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)溶液中三種目標(biāo)物的保留時(shí)間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差<0.68%，峰面積<1.57%。以上數(shù)據(jù)表明該方法耐用性良好。

2.2 樣品測(cè)定

5批次[18F]PBR06注射液分析結(jié)果列于表4，乙醇含量和乙腈、DMSO殘留量均合格。在生產(chǎn)過程中，乙醇主要作用是將純化后產(chǎn)品從固相萃取小柱上洗脫，加入到抗壞血酸鈉生理鹽水溶液中，并使產(chǎn)品穩(wěn)定溶解于制劑溶液中。生產(chǎn)中投入乙醇的量為最終產(chǎn)品制劑的10%(v·v-1)，但是由于乙醇和生理鹽水溶液在生產(chǎn)體系中有不同程度的殘留，導(dǎo)致實(shí)際進(jìn)入最終產(chǎn)品制劑中的乙醇比例發(fā)生變化，產(chǎn)品制劑中乙醇含量的合格范圍為8.0%～12.0%(v·v-1)。檢驗(yàn)批次產(chǎn)品中乙醇含量均合格。

表4 5批[18F]PBR06注射液質(zhì)控分析結(jié)果Table 4 The results of quality control tests of five batchs

[18F]PBR06注射液生產(chǎn)過程，乙腈用于原料F-18離子的除水劑和制備色譜的流動(dòng)相；DMSO用作氟化反應(yīng)溶劑?！吨袊?guó)藥典》2020版中規(guī)定，產(chǎn)品制劑中乙腈和DMSO的限度分別為0.041%和0.5%[8]。經(jīng)檢驗(yàn)的5批產(chǎn)品中的乙腈和DMSO殘留量均合格。

3 討論

正電子核素標(biāo)記的PET示蹤劑具有放射性和較短的物理半衰期，這要求藥物制劑的質(zhì)控檢驗(yàn)方法快速、測(cè)試樣品量小[12-14]。常用的藥物制劑中有機(jī)溶劑的檢查方法為頂空進(jìn)樣法和分流/不分流進(jìn)樣口直接進(jìn)樣法。頂空進(jìn)樣法是指將供試品溶液置于密閉小瓶中，在恒溫控制的加熱室中加熱至供試品中揮發(fā)性組分在液態(tài)和氣態(tài)達(dá)到平衡后，由進(jìn)樣器吸取一定體積的頂空氣注入色譜柱中進(jìn)行分析。頂空進(jìn)樣法可用于極性差異較大的多組分分析，缺點(diǎn)是需要較長(zhǎng)的平衡時(shí)間和較多樣品量。分流/不分流進(jìn)樣口直接進(jìn)樣法是指將供試品溶液直接注入進(jìn)樣口中，溶液在進(jìn)樣口氣化室中完成氣化，然后部分或全部進(jìn)入色譜中進(jìn)行分離測(cè)定。該方法的優(yōu)點(diǎn)是所需樣品量少、速度較快，缺點(diǎn)是可能存在高沸點(diǎn)組分氣化不完全、樣品加熱氣化過程中發(fā)生改變等問題，導(dǎo)致進(jìn)樣口易被污染、對(duì)高沸點(diǎn)組分檢測(cè)的重復(fù)性較差。

冷柱頭進(jìn)樣口直接進(jìn)樣法是將供試品溶液直接注射到色譜柱中，在色譜柱中完成氣化和分離的氣相分析技術(shù)。該技術(shù)不存在進(jìn)柱前加熱汽化過程，避免了樣品組分岐視效應(yīng)、進(jìn)樣針頭選擇性蒸發(fā)和非線性分流等問題，具有良好的穩(wěn)定性和檢測(cè)靈敏度。該技術(shù)的缺點(diǎn)是進(jìn)樣口結(jié)構(gòu)復(fù)雜，襯管和進(jìn)樣器針頭需要對(duì)應(yīng)色譜柱直徑；非揮發(fā)性組分可能沉積在色譜柱柱頭，造成污染。冷柱頭進(jìn)樣口直接進(jìn)樣法在國(guó)內(nèi)外的研究中主要用于熱不穩(wěn)定樣品或痕量組分的分析，在食品、農(nóng)藥和石油工業(yè)中應(yīng)用較多[15-18]；用于藥物檢驗(yàn)的報(bào)道較少，這主要是由于常規(guī)藥物批量較大，對(duì)取樣量和檢測(cè)時(shí)間的限制較小，采用應(yīng)用較廣泛的分流/不分流進(jìn)樣口即可滿足檢測(cè)要求；冷柱頭進(jìn)樣口用于放射性藥物質(zhì)控檢測(cè)此前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。放射性藥物生產(chǎn)具有批量小、質(zhì)控樣品量較少的特點(diǎn)，冷柱頭進(jìn)樣口直接進(jìn)樣法所需樣品量少，通過數(shù)微升樣品即可完成檢測(cè)，而且檢測(cè)時(shí)間短，可通過一次進(jìn)樣測(cè)定制劑中乙醇和殘留溶劑含量；此外放射性藥物中有效物質(zhì)含量低，可以避免冷柱頭進(jìn)樣口因非揮發(fā)性組分沉積而造成污染。采用冷柱頭進(jìn)樣口直接進(jìn)樣法進(jìn)行放射性藥物制劑中有機(jī)溶劑分析，可充分發(fā)揮該方法快速、樣品少、定量范圍寬等優(yōu)點(diǎn)，而避免柱頭污染等弊端，具有良好的應(yīng)用價(jià)值。

本研究采用冷柱頭進(jìn)樣口直接進(jìn)樣法測(cè)定[18F]PBR06注射液中有機(jī)溶劑含量，方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明，該方法用于乙醇定量檢查和乙腈、DMSO限度檢查符合《中國(guó)藥典》要求。該方法可在一次進(jìn)樣中完成三種待測(cè)溶劑的檢測(cè)，運(yùn)行時(shí)間小于12 min，而且使用的樣品量相當(dāng)于4 μL產(chǎn)品制劑原液，可大幅減低暴露在環(huán)境中的放射性活度，減少操作人員受到的輻射劑量。本研究證明冷柱頭進(jìn)樣口直接進(jìn)樣方法適用于[18F]PBR06產(chǎn)品制劑的質(zhì)控檢查，有利于保證藥物制劑的安全性，對(duì)[18F]PBR06的推廣應(yīng)用具有重要意義。此外，本研究開發(fā)方法還適用于其他制劑中乙醇含量為0.5%～12%(v·v-1)的放射性藥物的質(zhì)控分析，在本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)用于β淀粉樣蛋白示蹤劑[18F]AV-45、Ⅱ型囊泡單胺轉(zhuǎn)運(yùn)體示蹤劑[18F]FP-DTBZ和多巴胺D2受體示蹤劑[18F]Fallypride的殘留溶劑質(zhì)控檢測(cè)。

4 結(jié)論

冷柱頭直接進(jìn)樣氣相色譜法適用于放射性藥物制劑[18F]PBR06注射液中的乙醇含量測(cè)定和乙腈、DMSO殘留量檢查，具有快速、樣本量小的優(yōu)點(diǎn)，可通過單次進(jìn)樣即獲得三種待測(cè)溶劑含量，有利于提高藥物質(zhì)控分析效率，并且該方法可進(jìn)一步用于其他制劑組成類似的放射性藥物的質(zhì)控分析。