氧化應(yīng)激在心肌缺血再灌注損傷中的研究進(jìn)展

毛子奇，袁偉

(江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

近年來(lái)，雖然循證醫(yī)學(xué)的發(fā)展和生活方式的改變極大降低了冠心病的死亡率，但心肌梗死仍是全球疾病死亡的主要原因之一，每年約有600多萬(wàn)人死于心肌梗死[1]，對(duì)國(guó)民經(jīng)濟(jì)造成巨大負(fù)擔(dān)。有研究表明，急性心肌梗死的發(fā)生率和死亡率與收入成反比，這可能由于高收入國(guó)家更多地使用了預(yù)防措施和進(jìn)行血運(yùn)重建[2]。隨著再灌注策略在臨床的廣泛運(yùn)用，急性心肌梗死治療的重點(diǎn)已從降低死亡率轉(zhuǎn)移至改善患者的生存預(yù)后，避免梗死后心力衰竭的發(fā)生。然而，早期的血運(yùn)重建雖然可以最大限度地挽救缺血心肌，但也會(huì)不可避免帶來(lái)另一種額外損傷，即再灌注損傷。因?yàn)樵俟嘧?huì)引發(fā)一系列事件，如氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、炎癥等[3-4]，可能會(huì)使缺血心肌遭受二次打擊，導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)和功能的損傷，帶來(lái)很多的梗死后遺癥。這些證據(jù)表明，可以通過(guò)分子和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制去了解疾病并從中找到治療方法。有文獻(xiàn)報(bào)道，早期再灌注會(huì)產(chǎn)生活性氧類(reactive oxygen species，ROS)，而過(guò)量的ROS能夠?qū)е骡}超載、凋亡、細(xì)胞因子上調(diào)以及DNA和蛋白質(zhì)的改變[5]，進(jìn)而加重心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI)。因此，有效清除過(guò)量的氧自由基或ROS可能能為減輕MIRI提供理論基礎(chǔ)和治療靶點(diǎn)?，F(xiàn)就氧化應(yīng)激在MIRI中的研究進(jìn)展予以綜述，旨在為臨床應(yīng)用抗氧化治療預(yù)防再灌注損傷提供參考。

1 氧化應(yīng)激與ROS

2 心肌細(xì)胞ROS的主要來(lái)源

2.2溶酶體生成的OH·溶酶體負(fù)責(zé)受損或過(guò)剩結(jié)構(gòu)的調(diào)控，維持自噬降解。因其對(duì)多種含鐵大分子物質(zhì)的降解，使區(qū)室內(nèi)富含疏松的氧化還原活性鐵，可以與線粒體中逸出的少量H2O2發(fā)生芬頓反應(yīng)，生成OH·[15]。而包括心肌缺血再灌注在內(nèi)的大多數(shù)病理過(guò)程均可能會(huì)使氧化應(yīng)激在線粒體被啟動(dòng)，繼而生成大量的H2O2，放大這種線粒體與溶酶體之間的串?dāng)_現(xiàn)象，導(dǎo)致溶酶體內(nèi)OH·不斷累積，促使溶酶體膜過(guò)氧化和透化，造成其穩(wěn)定性喪失，釋放出大量組織蛋白酶，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或壞死[15-16]。因此，通過(guò)靶向調(diào)控溶酶體內(nèi)氧化還原活性鐵的含量來(lái)抑制過(guò)量ROS生成也是一種減少氧化應(yīng)激損傷的潛在治療方法。

2.3內(nèi)質(zhì)網(wǎng)生成的ROS 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是高效合成和折疊蛋白質(zhì)的重要場(chǎng)所，在氧化性蛋白質(zhì)折疊過(guò)程中，二硫鍵的形成是一個(gè)主要過(guò)程。而蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶催化反應(yīng)中每形成一個(gè)二硫鍵，均會(huì)產(chǎn)生一個(gè)氧化當(dāng)量H2O2，這是內(nèi)質(zhì)氧化還原素1催化蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶再氧化的結(jié)果。而H2O2作為蛋白質(zhì)折疊的副產(chǎn)物可以被谷胱甘肽過(guò)氧化物酶利用，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化負(fù)荷[17]。但是缺血再灌注會(huì)增加未折疊蛋白應(yīng)答的激活和錯(cuò)誤折疊蛋白的積累，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激這一病理改變。在此背景下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化還原平衡失調(diào)，過(guò)量的H2O2無(wú)法被清除和利用[17-18]。同時(shí)，還有研究表明未折疊蛋白應(yīng)答的激活可以通過(guò)影響線粒體功能導(dǎo)致ROS水平進(jìn)一步升高[17]，這也從側(cè)面證明了上述mtROS的產(chǎn)生存在多種不同的病理機(jī)制。

3 氧化應(yīng)激導(dǎo)致MIRI的機(jī)制

冠狀動(dòng)脈閉塞引起的心肌缺血是心血管相關(guān)死亡的主要原因，而最常見的治療策略為早期恢復(fù)缺血區(qū)灌注[2]。但是再灌注時(shí)心肌會(huì)產(chǎn)生大量ROS，引起細(xì)胞死亡和功能障礙，導(dǎo)致原缺血組織的進(jìn)一步損傷。同時(shí)，氧化應(yīng)激導(dǎo)致MIRI的機(jī)制十分復(fù)雜，目前仍不清楚，現(xiàn)從以下幾方面進(jìn)行探討。

3.2過(guò)度自噬 基礎(chǔ)水平的自噬通常被認(rèn)為是對(duì)壓力的保護(hù)性反應(yīng)，它通過(guò)清除受損的蛋白質(zhì)和老化的細(xì)胞器來(lái)維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，但在心肌缺血再灌注期間，自噬并不總是具有保護(hù)作用，過(guò)度自噬會(huì)導(dǎo)致自噬體的大量積累和關(guān)鍵蛋白質(zhì)及細(xì)胞器的異常降解[24]。以往研究表明，再灌注過(guò)程中的氧化爆發(fā)能夠促進(jìn)p53/心肌素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，誘導(dǎo)微管相關(guān)蛋白1輕鏈3脂化，上調(diào)自噬通量和自噬關(guān)鍵蛋白Beclin1表達(dá)，極大地提高自噬活性，導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡并加速缺血性損傷[24]。Dang等[25]的報(bào)道與這個(gè)觀點(diǎn)一致，缺血再灌注期間自噬通量受損以及自噬溶酶體功能障礙，這種無(wú)效自噬表現(xiàn)為自噬體的積累。自噬相關(guān)基因7是自噬體產(chǎn)生的關(guān)鍵因素，其充當(dāng)泛素活化酶E1，在自噬體膜的起始和擴(kuò)增中至關(guān)重要。在一項(xiàng)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中，高級(jí)糖基化終末產(chǎn)物的可溶性受體被證實(shí)可以與細(xì)胞膜上的整合素相互作用，增強(qiáng)泛素蛋白酶體系統(tǒng)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3的活化，而信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3的活化可以抑制缺血再灌注期間細(xì)胞質(zhì)中的氧化應(yīng)激，從而減少自噬相關(guān)基因7的表達(dá)，抑制過(guò)度自噬的發(fā)生，改善心臟功能并減小梗死面積[25]。此外，有研究稱由于長(zhǎng)期處于高糖環(huán)境，心肌缺血再灌注時(shí)的氧化應(yīng)激水平顯著升高，而抗氧化劑N-乙酰-L-半胱氨酸可以通過(guò)抑制ROS，從而抑制過(guò)度自噬的形成，在糖尿病性心臟病的缺血再灌注中起保護(hù)作用[26]。相反，溶酶體膜上的通道蛋白粘脂蛋白1既是鈣的主要釋放者，同時(shí)也是氧化還原的傳感器，過(guò)量mtROS可以直接激活粘脂蛋白1，誘導(dǎo)鈣釋放，觸發(fā)鈣調(diào)磷酸酶依賴的轉(zhuǎn)錄因子EB核轉(zhuǎn)位，上調(diào)線粒體自噬，促進(jìn)功能失調(diào)的線粒體和ROS的清除，降解受損泛素化蛋白，對(duì)氧化應(yīng)激提供細(xì)胞保護(hù)，而線粒體自噬被抑制和自噬缺失在心肌凋亡過(guò)程中也被證明起到部分促進(jìn)作用[27-28]。可見，自噬是對(duì)細(xì)胞壓力的應(yīng)答，而維持其正常運(yùn)轉(zhuǎn)在缺血再灌注中起重要作用。

3.3炎癥小體活化 炎癥小體是一種多蛋白復(fù)合物，包含胱天蛋白酶1、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白和核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)。作為固有免疫系統(tǒng)不可或缺的組成部分，炎癥小體的活化誘導(dǎo)胱天蛋白酶1切割消皮素D蛋白，使細(xì)胞不斷腫脹直至膜完整性喪失，并促進(jìn)白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-18的成熟和分泌以及細(xì)胞內(nèi)容物的泄漏，導(dǎo)致一種稱為焦亡的促炎形式的程序性細(xì)胞死亡[29]。近年有兩項(xiàng)研究均分別通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)闡釋了NLRP3激活的兩種不同機(jī)制：前者在轉(zhuǎn)錄水平上由核因子κB驅(qū)動(dòng)，在缺血再灌注損傷中，核因子κB被Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR) 信號(hào)通路以髓樣分化因子88依賴途徑激活，隨后刺激IL-1β、IL-18表達(dá)[29]。而后者在轉(zhuǎn)錄后水平上被誘導(dǎo)，包括NLRP3的激活，由許多激活因子驅(qū)動(dòng)，如缺血再灌注損傷中過(guò)量的ROS[4]。因?yàn)樵贛IRI中NLRP3炎癥小體的激活至關(guān)重要，所以有學(xué)者提出通過(guò)抑制核因子κB和消皮素D蛋白可以減輕炎癥小體誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡[30]。同時(shí)以往研究顯示，不論是線粒體或是Nox來(lái)源的ROS，均可以上調(diào)硫氧還蛋白相互作用蛋白從而介導(dǎo)NLRP3炎癥小體的活化，導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)炎癥和焦亡[4,31]。而通過(guò)向動(dòng)物模型腹腔注射抗氧化藥物可以阻斷硫氧還蛋白互作蛋白與NLRP3的相互作用，達(dá)到抑制NLRP3炎癥小體激活和IL-1β成熟的目的[31]。此外，糖尿病作為MIRI的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，其心肌缺血再灌注的發(fā)生率明顯高于非糖尿病患者，基于這些流行病學(xué)研究，也有實(shí)驗(yàn)表明，再灌注情況下，高糖可以通過(guò)增加ROS的產(chǎn)生誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的心肌細(xì)胞焦亡[32]。因此，通過(guò)靶向NLRP3炎癥小體來(lái)限制炎癥損傷可能是缺血再灌注的一種新治療策略。

3.4免疫應(yīng)答激活 眾所周知，缺血再灌注會(huì)啟動(dòng)免疫應(yīng)答，進(jìn)而激活急性炎癥反應(yīng)，其特征為先天性和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)相關(guān)的免疫細(xì)胞募集和活化[33]。有證據(jù)表明，缺血心肌細(xì)胞除了作為靶器官外，還可以促進(jìn)先天性免疫反應(yīng)[34]。這種免疫反應(yīng)的激活主要發(fā)生在受損心肌細(xì)胞釋放損傷相關(guān)分子模式與模式識(shí)別受體相互作用時(shí)，而ROS作為一個(gè)重要的損傷相關(guān)分子在整個(gè)過(guò)程中起推動(dòng)作用[35]。在眾多模式識(shí)別受體中，TLR引起人們的廣泛關(guān)注，其中TLR4在心血管疾病中起重要作用。Vilahur和Badimon[35]發(fā)現(xiàn)，缺血30 min足以增強(qiáng)循環(huán)白細(xì)胞的炎性潛能并增加細(xì)胞因子的釋放，而這種全身性炎癥反應(yīng)與缺血心肌中過(guò)量ROS誘導(dǎo)的TLR4-髓樣分化因子88信號(hào)通路的顯著上調(diào)有關(guān)。此外，巨噬細(xì)胞表型極化也是免疫應(yīng)答激活的重要部分。有研究證實(shí)，過(guò)量的ROS可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M1表型極化，這可能由于C型凝集素受體、TLR、NOD樣受體等模式識(shí)別受體的激活[33]。當(dāng)巨噬細(xì)胞向M1表型極化后，可以直接釋放腫瘤壞死因子-α、IL-1β和IL-23，同時(shí)上調(diào)趨化因子配體1和粒細(xì)胞集落刺激因子的分泌，間接介導(dǎo)中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)及蛋白水解酶的產(chǎn)生。而中性粒細(xì)胞的募集會(huì)進(jìn)一步加劇ROS生成，造成惡性循環(huán)，加重心肌損傷[33,36]。Formentini等[36]發(fā)現(xiàn)，靶向抑制mtROS可以使巨噬細(xì)胞從M1表型向具有抗炎作用的M2表型極化，從而減少細(xì)胞損傷。以上數(shù)據(jù)表明，免疫應(yīng)答對(duì)MIRI存在較大影響。

4 MIRI的抗氧化治療和臨床局限性

近年來(lái)，氧化應(yīng)激導(dǎo)致MIRI備受關(guān)注，但抗氧化治療的臨床轉(zhuǎn)化價(jià)值仍存在爭(zhēng)議。維生素C、維生素E和泛醌10等常見抗氧劑已在動(dòng)物模型及臨床實(shí)驗(yàn)中被證明可以通過(guò)部分清除ROS或自身氧化而抑制氧化爆發(fā)[37-38]。而丙酮酸乙酯這類具有臨床安全性的天然抗氧化劑，也被發(fā)現(xiàn)可以下調(diào)Nox活性從而抑制焦亡[4]。另有研究指出，臨床中的一些常用藥物，如二甲雙胍可以顯著上調(diào)抗氧化酶的表達(dá)以及抑制ROS介導(dǎo)的過(guò)度自噬[39-40]，而他汀類藥物可以有效降低血漿中過(guò)氧化物的水平，對(duì)減少氧化產(chǎn)生的DNA損傷有益[41]。但實(shí)際上，因?yàn)檫m量ROS具有特定的細(xì)胞內(nèi)功能，而普通抗氧化劑在提供干預(yù)治療的同時(shí)會(huì)影響未遭受氧化損傷的健康組織，所以基于上述觀點(diǎn)，靶向抗氧化劑顯示出巨大潛力，如米托蒽醌甲磺酸鹽可以與親脂性三苯基膦結(jié)合，在線粒體內(nèi)生成活性抗氧化泛素，在缺血再灌注模型中阻止mtROS產(chǎn)生[42]，而SS(Szeto-Schiller)肽等[43]靶向肽也可以起到類似作用。同樣，選擇性靶向溶酶體室的鐵螯合劑對(duì)減少其內(nèi)部OH·介導(dǎo)的氧化損傷也有部分作用[44]。

此外，mPTP開放作為缺血再灌注最重要的損傷機(jī)制，其非特異性抑制劑環(huán)孢素已被報(bào)道可以通過(guò)抑制親環(huán)素D轉(zhuǎn)位繼而阻止mPTP開放，減少心臟手術(shù)期間的再灌注損傷[45]。然而，環(huán)孢素的免疫抑制特性及其不良反應(yīng)大大限制了它的廣泛應(yīng)用，有學(xué)者認(rèn)為通過(guò)制備新型的線粒體靶向納米粒子可以減少環(huán)孢素對(duì)正常組織的免疫作用[46]。同時(shí)，也有研究稱多肽類藥物的預(yù)處理和后處理均能觸發(fā)蛋白激酶的信號(hào)瀑布級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而抑制mPTP開放，具有增加再灌注后心肌耐受性的作用[47]。因此，親環(huán)素D特異性抑制劑的研發(fā)、新型生物材料技術(shù)的應(yīng)用以及臨床藥物的運(yùn)用需進(jìn)一步探索。

5 小 結(jié)

ROS以低濃度的形式作為生理信號(hào)因子貫穿于細(xì)胞正常的生長(zhǎng)、遷移和死亡過(guò)程，但是再灌注在挽救瀕死心肌的同時(shí)也會(huì)促進(jìn)琥珀酸積累，溶酶體串?dāng)_，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和氧化酶上調(diào)這些復(fù)雜的病理進(jìn)程，導(dǎo)致ROS的過(guò)量積累，并通過(guò)mPTP開放、過(guò)度自噬、炎癥小體活化以及免疫應(yīng)答激活等多種方式加劇心肌細(xì)胞損傷的發(fā)生發(fā)展，影響再灌注患者預(yù)后，而目前對(duì)這些潛在機(jī)制的研究仍處于初級(jí)階段，進(jìn)行深入研究可能能為預(yù)防MIRI提供新思路。

此外，外源性抗氧化治療至今仍存在較大的局限性，雖然某些臨床常見的降糖降脂藥物也具有一定的抗氧化能力，但仍缺乏大規(guī)模研究數(shù)據(jù)。而一些天然抗氧化劑因成分復(fù)雜，臨床使用的安全性還有待進(jìn)一步考證。近年靶向抗氧化劑由于特異性強(qiáng)，不良反應(yīng)少而備受關(guān)注。未來(lái)，應(yīng)充分探究現(xiàn)有藥物的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)及選擇靶向干預(yù)的新型抗氧化藥物以減少M(fèi)IRI。