大腸埃希菌主動(dòng)外排泵的研究進(jìn)展

閆向龍，石艷春，鄭源強(qiáng)，孫瑤，孫穎，欒艷淼

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)內(nèi)蒙古自治區(qū)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010058)

大腸埃希菌屬腸桿菌科埃希菌屬，為革蘭陰性短桿菌，在自然界中廣泛存在。大腸埃希菌作為人體正常菌群存在于腸道中，可合成維生素K和B族維生素，參與宿主的物質(zhì)代謝。大腸埃希菌的某些血清型可作為病原體引起腸道內(nèi)感染，出現(xiàn)腹瀉等癥狀。臨床上分離出的大腸埃希菌可引起腸道外感染，如敗血癥、菌血癥、肺炎、腎盂腎炎、膽囊炎和繼發(fā)性腹膜炎?？股卦谥委煾腥拘约膊≈邪l(fā)揮重要作用，但隨著抗菌藥物種類的增加以及臨床不合理抗菌藥物的應(yīng)用，耐藥菌不斷產(chǎn)生。除細(xì)菌種屬特性決定的固有耐藥外，細(xì)菌產(chǎn)生耐藥的機(jī)制還包括產(chǎn)生藥物滅活酶、改變藥物的作用靶點(diǎn)以及形成生物被膜等[1]。通過改變外膜通透性、主動(dòng)外排等方式可減少藥物的積聚和攝取。對(duì)于革蘭陰性桿菌，外膜上存在的主動(dòng)外排泵是導(dǎo)致其耐藥的主要原因[2]，如大腸埃希菌的AcrAB-TolC(由膜融合蛋白AcrA、外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AcrB和外膜通道蛋白TolC三部分組成)外排系統(tǒng)[3]、銅綠假單胞菌的MexAB-OprM(由膜融合蛋白MexA、內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)體MexB和外膜通道蛋白OprM組成)外排系統(tǒng)等[4]。這些外排系統(tǒng)的底物主要以各類抗生素為主，也包括一些氧化劑和有機(jī)溶劑等?，F(xiàn)就大腸埃希菌主動(dòng)外排泵的研究進(jìn)展予以綜述。

1 大腸埃希菌主要外排泵家族

對(duì)大腸埃希菌主動(dòng)外排泵的研究發(fā)現(xiàn)，主要有5個(gè)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族參與了抗菌藥物的主動(dòng)外排[5]，其中，ATP結(jié)合盒(ATP binding cassette，ABC)超家族是通過ATP結(jié)合和水解推動(dòng)藥物自由排出的“主要活性”轉(zhuǎn)運(yùn)體[6]，而其他4個(gè)家族均是以質(zhì)子泵獲取能量的轉(zhuǎn)運(yùn)體，包括易化因子超家族(major facilitator superfamily，MFS)、耐藥節(jié)結(jié)化細(xì)胞分化(resistance nodulation division，RND)超家族、多藥和有毒化合物排出(multidrug and toxic compound extrusion，MATE) 家族以及小多重耐藥性(small multidrug resistance，SMR)家族[7-8]。研究表明，這些外排泵家族的底物具有多樣性，包括抗菌劑[9]、染料、清潔劑和溶劑等[10]。

1.1MFS MFS是最大的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族，該家族中包含多種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，如金黃色葡萄球菌中的QacA和大腸埃希菌中的MdfA等。MFS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族依靠質(zhì)子的溶度梯度作為能量來源實(shí)現(xiàn)其功能，其轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的方式包括單向轉(zhuǎn)運(yùn)、逆向轉(zhuǎn)運(yùn)和共同轉(zhuǎn)運(yùn)。MFS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的底物也有多種類型，如抗生素、細(xì)菌的代謝產(chǎn)物、糖類和離子等。對(duì)MFS轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，MFS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以一種“交替進(jìn)入”的機(jī)制(即藥物結(jié)合位點(diǎn)交替暴露于細(xì)胞外部或內(nèi)部)運(yùn)行[11]。通常情況下，MFS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族由一種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)成(如金黃色葡萄球菌中的QacA)，但大腸埃希菌的多重耐藥外排泵則由多種蛋白外排泵和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白共同發(fā)揮作用[12]。

1.2ABC超家族 ABC超家族利用水解ATP供能實(shí)現(xiàn)主動(dòng)外排功能。人類ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白P-糖蛋白(P-糖蛋白/ABCB1)[13]、多藥耐藥相關(guān)蛋白1(多耐藥相關(guān)蛋白1/ABCC1)[14]和乳腺癌耐藥蛋白(乳腺癌耐藥蛋白/ABCG2)[15]在腫瘤多重耐藥中起重要作用。在細(xì)菌中，ABC外排泵并不常見，大腸埃希菌中的MacB外排泵首先在革蘭陰性菌中被發(fā)現(xiàn)，其主要介導(dǎo)大環(huán)內(nèi)脂類藥物的外排[16]。ABC主動(dòng)外排泵作用的底物種類較多，除抗生素外還包括氨基酸、糖類、離子和多糖類化合物等，功能性ABC外排泵包括2個(gè)負(fù)責(zé)藥物識(shí)別和轉(zhuǎn)運(yùn)的跨膜結(jié)構(gòu)域和2個(gè)ATP水解的細(xì)胞質(zhì)核苷酸結(jié)合域，其主動(dòng)外排機(jī)制是通過上述兩種結(jié)構(gòu)域構(gòu)象的改變降低藥物與底物結(jié)合的親和力，實(shí)現(xiàn)其外排功能[17]。

1.3RND超家族 RND泵存在于革蘭陰性菌的內(nèi)膜中，具有跨膜結(jié)構(gòu)域和周質(zhì)結(jié)構(gòu)域。RND家族主要成員包括存在于大腸埃希菌中的外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AcrB和銅綠假單胞菌中的內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)體MexB，AcrB、AcrA和TolC構(gòu)成AcrAB-TolC三聚體復(fù)合物，MexB、MexA和OprM構(gòu)成MexAB-OprM三聚體復(fù)合物[18]。AcrB可介導(dǎo)多種不同底物的轉(zhuǎn)運(yùn)，如陰離子、陽離子、兩性離子以及抗生素、化療藥物、毒素、洗滌劑和膽鹽[19]。多藥耐藥轉(zhuǎn)運(yùn)體RND家族的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是膜融合蛋白AcrA、外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AcrB和外膜通道蛋白TolC跨越革蘭陰性菌的雙膜，并直接將有毒物質(zhì)外排到細(xì)胞外環(huán)境[20]。但RND多藥泵仍有待進(jìn)一步深入研究，如轉(zhuǎn)運(yùn)體如何與質(zhì)子泵配合實(shí)現(xiàn)其功能以及大腸埃希菌AcrA、AcrB及TolC三者之間動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)換的實(shí)現(xiàn)等均需通過比較晶體結(jié)構(gòu)以及各結(jié)構(gòu)的參數(shù)來分析[21]。

1.4MATE家族 MATE家族最早在細(xì)菌中被發(fā)現(xiàn)[22]，如大腸埃希菌中的洋地黃外排泵和副溶血性弧菌中的諾氟沙星外排泵。洋地黃外排泵的作用底物以抗生素為主，如鏈霉素、卡那霉素和環(huán)丙沙星；NorM外排泵的主要作用底物是有毒性的陽離子，如吖啶紅和溴化乙啶。人類MATE轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可轉(zhuǎn)運(yùn)二甲雙胍和西咪替丁等藥物。有研究在哺乳動(dòng)物中也發(fā)現(xiàn)了MATE家族外排泵，其主要通過尿液將藥物或毒素排出體外，是一種機(jī)體解毒方式[23]。研究發(fā)現(xiàn)，NorM外排泵的作用底物為非藥物，主要存在于霍亂弧菌和淋病奈瑟球菌中[24]。對(duì)MATE晶體結(jié)構(gòu)的研究顯著增強(qiáng)了人們對(duì)MATE家族機(jī)制的理解，MATE的晶體結(jié)構(gòu)顯示其有一個(gè)面向外部的空腔，大約延伸至膜的一半[25]。NorM結(jié)構(gòu)(包含結(jié)合的四苯基磷或溴化乙啶)有2個(gè)細(xì)胞外環(huán)，幾乎“覆蓋”了藥物結(jié)合位點(diǎn)，表明NorM外排泵的主要作用是結(jié)合非藥物(如有毒化合物)的外排[26]。

1.5SMR家族 SMR家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白長(zhǎng)度僅100～120個(gè)氨基酸，由4個(gè)跨膜區(qū)螺旋組成，且螺旋內(nèi)環(huán)相對(duì)較短，SMR家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白存在于許多不同的細(xì)菌中[27]。迄今為止，研究最多的是大腸埃希菌中的反轉(zhuǎn)運(yùn)體EmrE和金黃色葡萄球菌中的SMR?？椎鞍譡28]。EmrE可以輸送許多不同的親脂陽離子(如乙炔、甲醇)；EmrE的每個(gè)單體中均含有一個(gè)單膜嵌入谷氨酸殘基(E14)，且EmrE是保守的SMR轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白同系物，這是質(zhì)子和底物結(jié)合的必要條件[29]。關(guān)于EmrE結(jié)構(gòu)和生物化學(xué)研究(包括低溫電子顯微鏡、X光晶體學(xué)、核磁共振光譜學(xué))表明，EmrE以反向二聚體形式存在[30]。有學(xué)者通過點(diǎn)突變對(duì)大腸埃希菌反轉(zhuǎn)運(yùn)體EmrE的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制進(jìn)行修改，結(jié)果顯示，用質(zhì)子替代藥物恢復(fù)轉(zhuǎn)運(yùn)體的起始構(gòu)象后，谷氨酸殘基與質(zhì)子進(jìn)行了交換[31]。EmrE存在3種構(gòu)象狀態(tài)，表明結(jié)構(gòu)的可塑性與靈活性是多藥識(shí)別和轉(zhuǎn)運(yùn)的基礎(chǔ)[32]。深入研究EmrE結(jié)構(gòu)的可塑性可進(jìn)一步闡明SMR轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的多種功能。

2 AcrAB-TolC外排泵的結(jié)構(gòu)

大腸埃希菌是目前發(fā)現(xiàn)外排泵種類最多的細(xì)菌，其中以AcrAB-TolC外排泵研究較多。AcrAB-TolC外排泵屬于轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白R(shí)ND超家族，RND超家族轉(zhuǎn)運(yùn)的底物廣泛。RND超家族包括膜融合蛋白AcrA、外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AcrB和外膜通道蛋白TolC三個(gè)結(jié)構(gòu)，若AcrAB-TolC外排泵系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，細(xì)菌可轉(zhuǎn)變?yōu)槊舾袪顟B(tài)，敲除相關(guān)耐藥基因后，可增加細(xì)菌對(duì)藥物的敏感性。

2.1膜融合蛋白AcrA(接合器) 與多數(shù)膜融合蛋白結(jié)構(gòu)類似，AcrA由4個(gè)線性排列的結(jié)構(gòu)域組成，包括膜近端結(jié)構(gòu)域區(qū)、β-桶形結(jié)構(gòu)域、脂酰結(jié)構(gòu)域和α-螺旋發(fā)夾結(jié)構(gòu)域[33]。α-螺旋發(fā)夾結(jié)構(gòu)域參與了AcrA與TolC周質(zhì)端的相互作用，而β-桶形結(jié)構(gòu)域和膜近端結(jié)構(gòu)域則與AcrB的對(duì)接結(jié)構(gòu)域接觸[34]。一些膜融合蛋白缺乏膜脂蛋白結(jié)構(gòu)域，而其他蛋白質(zhì)的α-螺旋發(fā)夾結(jié)構(gòu)域長(zhǎng)度不同或完全缺失[35-36]。膜融合蛋白組成主動(dòng)外排泵方式的差異導(dǎo)致其功能不同，靈活的蛋白結(jié)構(gòu)是蛋白識(shí)別多種底物的基礎(chǔ)。

2.2外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AcrB(泵) AcrB是RND超家族的代表。AcrB可廣泛識(shí)別轉(zhuǎn)運(yùn)底物，如抗生素(四環(huán)素、氯霉素、β-內(nèi)酰胺類、新生霉素、梭狀酸、萘啶酸和氟喹諾酮類)、洗滌劑(如十二烷基硫酸鈉、Triton X-100)和類似清潔劑的膽鹽以及陽離子染料、消毒劑，甚至非極性溶劑[37]。AcrB是一種同源三聚體，AcrB組件可分為跨膜結(jié)構(gòu)域、波特域和對(duì)接域，其中波特域最靠近內(nèi)膜，可分為PN1、PN2、PC1和PC2 4種亞結(jié)構(gòu)域，這4種亞結(jié)構(gòu)域可形成近端和遠(yuǎn)端結(jié)合囊，而近端和遠(yuǎn)端結(jié)合囊均富含與轉(zhuǎn)運(yùn)底物接觸的芳香族、極性和帶電氨基酸殘基[38]。近端和遠(yuǎn)端結(jié)合囊被一個(gè)“開關(guān)環(huán)”隔開，這個(gè)“開關(guān)環(huán)”可以阻斷底物運(yùn)輸通道，而近端和遠(yuǎn)端結(jié)合囊袋可以識(shí)別不同類型的底物，近端囊袋有利于AcrB與紅霉素、利福平、β-內(nèi)酰胺等抗生素的相互作用，而遠(yuǎn)端囊袋可與米諾環(huán)素或阿奇霉素結(jié)合[39-40]。AcrB可轉(zhuǎn)運(yùn)底物的種類繁多，但AcrB蛋白識(shí)別多種不同化學(xué)結(jié)構(gòu)底物的具體過程還需結(jié)合其晶體結(jié)構(gòu)以及復(fù)雜的空間計(jì)算進(jìn)一步研究[41]。

2.3外膜通道蛋白TolC(通道) 外膜通道蛋白TolC可分解為3個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域，即β-桶體、α-螺旋桶體和混合α/β-折疊體(又被稱為赤道結(jié)構(gòu)域)[42]。TolC可被招募到許多不同的外排泵中，其中包括MFS外排泵(EmrA、EmrB和TolC)、RND型吖啶外排泵(AcrA、 AcrB和TolC)以及ABC型大環(huán)內(nèi)酯泵(MacA和MacB)[43]。此外，TolC也被稱為Ⅰ型分泌系統(tǒng)，由ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體激活，并驅(qū)動(dòng)致病細(xì)菌的毒性決定因子穿過細(xì)胞膜，包括黏附素、毒素或其他對(duì)人類和動(dòng)物細(xì)胞定植及感染具有重要作用的蛋白質(zhì)[44]。但目前ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)底物并攜帶底物通過TolC通道的機(jī)制尚未明確。

2.4調(diào)控機(jī)制

2.4.1局部調(diào)控 局部調(diào)控以負(fù)性調(diào)控因子AcrR為主，AcrR位于AcrAB操縱子的上游，由阻遏基因AcrR編碼，能夠抑制自身基因AcrR和AcrAB的表達(dá)[45]。AcrR的N端是典型的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)，AcrA通過這一結(jié)構(gòu)與DNA鏈結(jié)合，附著于AcrAB操縱子的位點(diǎn)，導(dǎo)致該操縱子阻遏[46]。另一方面，AcrAB操縱子受轉(zhuǎn)錄激活因子MarA的正向調(diào)節(jié)，MarA的表達(dá)發(fā)生在MarR阻遏物從MarRAB操縱子的操作位點(diǎn)解離后[47]。AcrR和MarR阻遏物均具有DNA結(jié)合和藥物結(jié)合位點(diǎn)[48]。研究表明，編碼基因MarR和AcrR的突變可以保持AcrAB-TolC泵的過度激活狀態(tài)，而大腸埃希菌AcrR第45位氨基酸突變可導(dǎo)致AcrAB過表達(dá)，這種影響的程度主要取決于細(xì)菌對(duì)四環(huán)素和環(huán)丙沙星的耐藥水平[49]。

2.4.2全局調(diào)控 細(xì)菌適應(yīng)外界環(huán)境變化的能力依賴于多個(gè)調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，這些網(wǎng)絡(luò)以協(xié)調(diào)的方式控制基因表達(dá)，以響應(yīng)環(huán)境刺激。外界刺激信號(hào)傳遞給轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子與特定開放閱讀框啟動(dòng)子區(qū)的靶DNA相互作用，激活或抑制靶基因的表達(dá)[50]。在某種情況下，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子控制不同代謝途徑的基因和操縱子，這些轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子又被稱為全局調(diào)控因子，以轉(zhuǎn)錄因子Rob、SoxS和MarA為主，主要構(gòu)成MarA-SoxS-Rob調(diào)控系統(tǒng)，MarA-SoxS-Rob調(diào)控系統(tǒng)是細(xì)菌適應(yīng)性反應(yīng)所必需，在革蘭陰性腸桿菌中高度保守，但在其他革蘭陰性和少數(shù)革蘭陽性細(xì)菌中未發(fā)現(xiàn)其直接同源物以及編碼相似蛋白質(zhì)的基因[51]。MarA、SoxS和Rob均是RND超家族的成員，對(duì)許多刺激存在反應(yīng)，包括pH值的改變、抗生素的存在和氧化應(yīng)激等[52]。mobox是全局調(diào)控系統(tǒng)的結(jié)合位點(diǎn)，可與AcrAB-TolC的啟動(dòng)子上游結(jié)合，從而激活相關(guān)基因的表達(dá)，MarA、SoxS和Rob的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域在一級(jí)序列同源性、DNA序列識(shí)別和轉(zhuǎn)錄激活特性方面均非常相似[53]。然而，MarA、SoxS和Rob的表達(dá)或活性由特定信號(hào)刺激產(chǎn)生，表明三者相互作用可以產(chǎn)生足夠的反應(yīng)，雖然每個(gè)系統(tǒng)均可獨(dú)立發(fā)揮作用，但MarA、SoxS和Rob緊密相連，共同構(gòu)成MarA-SoxS-Rob調(diào)控系統(tǒng)[54]。

3 外排泵抑制劑

外排泵是細(xì)菌防御的重要機(jī)制，可防止抗生素進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，導(dǎo)致抗生素耐藥性產(chǎn)生。因此，目前的研究多集中于發(fā)現(xiàn)新型外排泵抑制劑或?qū)σ阎股剡M(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾。外排泵抑制劑主要通過阻斷外排泵與抗生素的結(jié)合降低其耐藥性[55]。

研究指出，一些抗腫瘤藥物(如利血平、長(zhǎng)春新堿)可以降低腫瘤細(xì)胞的耐藥性，通過抗癌藥物與P-糖蛋白(屬于ABC家族)結(jié)合，抑制外排蛋白的功能[56]。利血平通過抑制NorA外排蛋白阻止其對(duì)諾氟沙星的外排作用，從而提高金黃色葡萄球菌對(duì)諾氟沙星的敏感性；此外，利血平也能對(duì)抗淋病奈瑟菌對(duì)四環(huán)素、紅霉素和阿米卡星的耐藥性[57]。氰氯苯腙是目前研究最多的質(zhì)子泵抑制劑，可抑制依賴質(zhì)子濃度梯度的外排系統(tǒng)，破壞其外排作用，但對(duì)于依賴ATP供能的外排泵無抑制作用[58]。

4 小 結(jié)

不同外排泵家族是導(dǎo)致細(xì)菌耐藥的主要原因，主要包括ABC超家族、RND超家族、MATE家族、SMR家族和MFS等。目前對(duì)于AcrAB-TolC外排泵的結(jié)構(gòu)構(gòu)象、轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制以及調(diào)控方式等的研究均較清楚，但對(duì)于外排泵抑制劑的研究較少，且目前多處于體外實(shí)驗(yàn)階段。隨著細(xì)菌體內(nèi)多種類型外排泵的出現(xiàn)以及不同耐藥機(jī)制的共同作用，多重耐藥菌的數(shù)量隨之增加。體外試驗(yàn)表明，外排泵抑制劑與抗生素聯(lián)合使用可在一定程度上逆轉(zhuǎn)攜帶外排泵基因細(xì)菌的耐藥性[59]，但外排泵本身的安全性等尚未在體內(nèi)試驗(yàn)中得到驗(yàn)證。因此，對(duì)不同外排泵結(jié)構(gòu)及轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制進(jìn)行研究的同時(shí)，還應(yīng)重視外排泵抑制劑在體內(nèi)的研究。