一起不明原因腹瀉疫情的病原學(xué)研究

蔣靖怡，毛旭建，江錦宜，李 瓊，杜 強(qiáng)，姚 萍

（常州市疾病預(yù)防控制中心，江蘇 常州 213022）

感染性腹瀉是一組由多因素、多病原體引起的腸道傳染病，在發(fā)達(dá)國家和發(fā)展中國家都是主要感染性疾病之一[1]。其他感染性腹瀉是指除霍亂、痢疾、傷寒和副傷寒以外的感染性腹瀉，是由細(xì)菌、病毒、寄生蟲等引起的腸道感染，在我國被列為丙類傳染病，是我國重要的公共衛(wèi)生問題之一[2]。引起其他感染性腹瀉的常見病原體主要有細(xì)菌（副溶性弧菌、大腸桿菌、沙門菌、志賀菌等）、病毒（輪狀病毒、諾如病毒、札如病毒、星狀病毒等）、寄生蟲（隱孢子蟲、環(huán)孢子蟲、蘭伯氏賈第鞭毛蟲等）[3-5]。

2020 年年底，常州市某學(xué)校發(fā)生一起不明原因感染性腹瀉疫情，主要癥狀為惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉，個(gè)別伴發(fā)熱。12月22日起陸續(xù)有學(xué)生發(fā)病，截至2021年1月4日，共出現(xiàn)100多例嘔吐、腹瀉病例。為檢測(cè)引起此次不明原因腹瀉的病原體，有針對(duì)性地控制疫情的傳播，我們將采集的樣本做了以下一系列檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 檢測(cè)樣本：依據(jù)感染性腹瀉診斷標(biāo)準(zhǔn)，于2020年12月27日采集腹瀉病例肛拭子10 份，2021年1月3日采集新發(fā)腹瀉病例肛拭子8 份。兩批共計(jì)18 份檢測(cè)樣本，均冷藏運(yùn)輸待檢。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器：低溫高速離心機(jī)（Thermo Scientific），Prism? 7500型實(shí)時(shí)定量PCR儀（Applied Biosystems），全自動(dòng)核酸提取儀（Applied Biosystems），微型電泳轉(zhuǎn)移槽（Bio-Rad），BioFire FilmArray（BioMerieux），ChemiDoc XRS+成像儀（Bio-Rad）。

1.1.3 主要試劑：核酸提取試劑盒（重慶中元生物技術(shù)有限公司），達(dá)安基因股份有限公司的腸道病毒通用型核酸檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針法），上海之江生物技術(shù)有限公司的腹瀉類病毒核酸測(cè)定試劑盒（熒光PCR法-96孔預(yù)裝板），F(xiàn)ilmArray GI Panal胃腸道感染測(cè)試試劑盒，江蘇碩世生物科技有限公司的腸出血性大腸桿菌（Enterohemorrhagic E.coli,EHEC）核酸檢測(cè)試劑盒（熒光PCR法）。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 病毒核酸提取與實(shí)時(shí)熒光定量PCR：采用自動(dòng)化核酸提取儀與磁珠法核酸提取試劑盒，吸取50 μL待測(cè)樣品加入含磁珠的溶液中，選擇自動(dòng)化程序開始提取，最后核酸溶于50 μL洗脫液中，并于－80 ℃長期保存。

病毒核酸熒光定量PCR檢測(cè)試劑為達(dá)安基因股份有限公司的腸道病毒通用型核酸檢測(cè)試劑盒，熒光檢測(cè)通道為FAM通道；上海之江生物技術(shù)有限公司的腹瀉類病毒核酸測(cè)定試劑盒（96孔預(yù)裝板），可以分別定性檢測(cè)8 種腹瀉類病毒的特異性核酸片段：腸道腺病毒、輪狀病毒A組、輪狀病毒B組、輪狀病毒C組、諾如病毒Ⅰ型、諾如病毒Ⅱ型、札如病毒、人星狀病毒，熒光檢測(cè)通道為FAM通道。熒光定量PCR反應(yīng)在ABI 7500定量PCR儀上進(jìn)行，其擴(kuò)增程序?yàn)槟孓D(zhuǎn)錄45 ℃ 10 min；預(yù)變性95℃ 15 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40 個(gè)循環(huán)，反應(yīng)體系為25 μL。

細(xì)菌核酸熒光定量PCR檢測(cè)試劑為EHEC核酸檢測(cè)試劑盒，熒光素FAM標(biāo)記靶基因STX1、熒光素VIC標(biāo)記靶基因STX2、熒光素ROX標(biāo)記靶基因eae，其擴(kuò)增程序?yàn)轭A(yù)變性95 ℃ 5 min；變性95 ℃10 s，退火延伸及熒光檢測(cè)55 ℃ 40 s，共40 個(gè)循環(huán)，反應(yīng)體系為25 μL。

1.2.2 FilmArray多重PCR：FilmArray GI Panal胃腸道感染測(cè)試試劑盒可以同時(shí)檢測(cè)引發(fā)腹瀉的22 種病毒、細(xì)菌和寄生蟲。該儀器將樣本核酸的制備、擴(kuò)增、檢測(cè)和分析過程整合于一體。FilmArray測(cè)試條中包含核酸提取、逆轉(zhuǎn)錄、PCR和檢測(cè)過程中所需的所有干粉試劑。儀器運(yùn)行前，在測(cè)試條兩段分別加入試劑緩沖液和樣本混合液。其余步驟全部由FilmArray儀器自動(dòng)完成：①從樣本中提取并純化核酸；②完成第一階段多重PCR，初步擴(kuò)增DNA片段；③在第一階段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的基礎(chǔ)上，完成第二階段巢式PCR；④利用溶解曲線分析數(shù)據(jù)，生成結(jié)果分析報(bào)告。

2 結(jié)果

2.1 引起腹瀉的常見病毒熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果 由于此次腹瀉疫情傳播人數(shù)較多，傳播時(shí)間快，因此我們首先懷疑是由病毒引起的腹瀉疫情。在用腹瀉類病毒核酸測(cè)定試劑盒（96孔預(yù)裝板）進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)后，發(fā)現(xiàn)腸道腺病毒、輪狀病毒A組、輪狀病毒B組、輪狀病毒C組、諾如病毒Ⅰ型、諾如病毒Ⅱ型、札如病毒、人星狀病毒均為陰性，我們又使用腸道病毒通用型核酸檢測(cè)試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果同樣為陰性。

2.2 FilmArray多重PCR檢測(cè)結(jié)果 通過熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，引起腹瀉的常見病毒核酸檢測(cè)結(jié)果均為陰性。為了快速高效地尋找引起此次腹瀉疫情的病原微生物，我們選擇FilmArray多重PCR檢測(cè)方法，并采用配套的胃腸道感染測(cè)定試劑盒。該試劑盒可同時(shí)檢測(cè)22 種病原體靶標(biāo)，涵蓋了細(xì)菌、寄生蟲與病毒。我們隨機(jī)挑取了10 個(gè)樣本進(jìn)行檢測(cè)，由于此方法檢測(cè)靈敏度較高，因此我們將每3 個(gè)樣本混合進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，有一組樣本顯示產(chǎn)志賀樣毒素大腸埃希菌（Shiga-like toxin-producing E.coli, STEC）陽性。另外，腺病毒、星狀病毒、諾如病毒GⅠ/GⅡ、輪狀病毒A群、札如病毒均未檢測(cè)到，也驗(yàn)證了之前熒光定量PCR的結(jié)果。

2.3 熒光定量PCR驗(yàn)證結(jié)果 FilmArray多重PCR檢測(cè)結(jié)果為我們提供了思路，這起疫情很有可能是由STEC引起。然而，為了節(jié)約成本，F(xiàn)ilmArray只檢測(cè)了隨機(jī)抽取的10 份樣本，且是每3 個(gè)樣本混合為一個(gè)樣本進(jìn)行檢測(cè)，如果這僅僅是個(gè)例，不能說明STEC是引起此次腹瀉疫情的病原，所以我們應(yīng)用熒光定量PCR的方法確定所有樣本中到底哪幾例是STEC陽性。檢測(cè)結(jié)果表明，所有18 例肛拭子樣本中，5 例檢測(cè)出EHEC的毒力因子Stx1/eae（圖1）。

圖1 EHEC核酸檢測(cè)試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)

EHEC屬于致瀉性大腸埃希菌，是引起小兒與成人腹瀉的主要致病菌[6]。食用不潔食物后，EHEC進(jìn)入大腸，借助外膜蛋白的黏附能力，黏附至回腸末端、盲腸和結(jié)腸，產(chǎn)生志賀樣毒素（Shiga-like-toxin, SLT），其中SLT-1除1個(gè)氨基酸外，其余均與志賀毒素相同；SLT-2則有60%與志賀毒素同源，故EHEC也稱為STEC。

EHEC的致病因子主要為前噬菌體編碼的志賀毒素Stx[7]，Stx家族成員有Stx1和Stx2，兩者在免疫學(xué)上沒有交叉反應(yīng)，一個(gè)EHEC菌株可以只表達(dá)兩者其一，也可以同時(shí)表達(dá)[8]。eae基因編碼一種緊密素，當(dāng)EHEC要入侵人體時(shí)，通過緊密素黏附在腸黏膜上，從而防止因腸蠕動(dòng)而將其排出，因此eae基因也是STEC致病的關(guān)鍵因子[9]。

此次疫情檢測(cè)到的STEC同時(shí)表達(dá)Stx1與eae基因，Stx2基因未檢出。

3 討論

此次腹瀉疫情所采集樣本均為病人的肛拭子樣本，進(jìn)行核酸提取后，先采用常規(guī)的熒光定量PCR方法，排除了已知常見的引起腸道感染的病毒（腸道腺病毒、輪狀病毒A組、輪狀病毒B組、輪狀病毒C組、諾如病毒Ⅰ型、諾如病毒Ⅱ型、札如病毒、人星狀病毒）[10]，在尚無發(fā)現(xiàn)的情況下，隨機(jī)選擇小部分樣本，采用了靈敏度更高，病原體靶標(biāo)更多的FilmArray多重PCR法，發(fā)現(xiàn)了可能引起此次腹瀉疫情的STEC。接下來對(duì)所有的病人樣本進(jìn)行檢測(cè)，選擇熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)方法，在驗(yàn)證上述結(jié)果正確的同時(shí)，共發(fā)現(xiàn)5 例樣本為EHEC（Stx1/eae陽性）。EHEC感染癥狀輕重不一，可為無癥狀感染、輕度腹瀉、出血性腸炎、溶血性尿毒綜合征（hemolytic uremic syndrome, HUS）等，然而，HUS多發(fā)生在帶Stx2基因的EHEC感染中。本疫情中病例主要癥狀為惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉，個(gè)別伴發(fā)熱，未發(fā)現(xiàn)血便。我們?cè)诮酉聛淼墓ぷ髦袑⒎蛛x培養(yǎng)該致病菌，進(jìn)一步研究該菌致病特征及進(jìn)行同源性分析等。